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土壤生态学实验指导

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土壤生态学

曹志平 胡菊编

2007年10月24日
资源环境学院生态系实验一、培养计数法测定土壤原生动物数量--------------------1
实验二、土壤中线虫的分离方法及杀死固定--------------------4
实验三、土壤螨类的分离------------------------------------6
实验四、氯仿薰蒸浸提法测定土壤微生物生物量碳实验一、培养计数法测定土壤原生动物数量
目前国际上通常采用的有直接计数法和间接计数法两种。直接计数法（direct counting method），顾名思义，就是对土壤中的原生动物不进行培养，而是取一定量的新鲜土壤，加一定量的水或土壤浸出液，摇匀后即进行镜检，得到土壤原生动物丰度（单位重量土壤中的原生动物个数）。间接记数法主要是培养记数法。鉴于土壤这一特定环境，土壤原生动物种类都能形成胞囊，以渡过土壤干旱环境。风干后土壤原生动物形成的胞囊，用培养的方法诱导脱开胞囊，以推知其种类和数量分布。在培养过程中一切器皿、培养基均经高压灭菌，接种时也应避免尘埃落入，以确保培养不受污染。本实验主要采用Singh（1995）和Stout（1962）的“3级10倍”环式稀释法。
仪器、设备和材料
烘箱、培养箱、灭菌锅、培养箱、镊子、玻璃环、三角瓶、烧杯等。
方法与步骤
1土样采集
土壤原生动物很难直接从土壤、水体中采集，要通过室内培养。土壤原生动物在土壤环境干旱时，都能形成胞囊，以等待土壤水分来临后再脱胞囊而活动。所以土壤原生动物的采集，实际上是采集土壤样品，带回实验室进行培养而取得标本。
由于原生动物在土壤中的分布是不均匀的，因此在一个采样区内，需采集10个采样点。用圆形采样器取土样，把土样放入铝盒带回室内。在培养之前，需测定土样含水量。
2 稀释土样
2克风干土样（如有条件，也可以直接用湿土）加18毫升无菌水，充分振荡，可用超声波仪粉碎土壤，使之与水充分混合，这时的稀释度为10；然后用定量吸管吸取2毫升102的土壤悬浮液，加入18毫升无菌水，充分摇匀，此时稀释度为103。依此法逐级稀释，即可得到103、104、105、106……的稀释液。根据原生动物的丰富度选择土壤的稀释度，但每一定量土样均要选择连续的3个稀释度，，即“3级10倍”之意（图1）。
3培养基制备
0.5克氯化钠加1.2克琼脂加98毫升蒸馏水（如用量较多，可按此比例增加），搅拌后在高压灭菌锅中加热灭菌，然后趁热到入培养皿，在凝固之前插入5个内径为1.8厘米、高为0.6厘米的玻璃环。每个土样需6个培养皿30个玻璃环。
4接种、培养和镜检
取其中的连续3级悬浮液，摇匀后每级稀释液各取1ml接种于各自的玻璃杯内，即1、2号培养皿的10个玻璃杯内各滴入1ml第一级稀释液，同样3、4号和5、6号培养皿的10个玻璃杯内分别滴入第二级和第三级稀释液（第一、二、三级稀释液的稀释度是多少，则取决于研究的土壤中原生动物数目的多寡，如采用104-106稀释度系列，则第一级稀释液为104，第二级为105，第三级为106），置于光照培养箱25℃以下培养(图1)。分别在第4、7、11天时在低倍镜下观察每个环中有无原生动物，按肉足虫、鞭毛虫、纤毛虫分别记录。低倍镜下可分清此三大类，但无法鉴定种类。可在实验结束时，再吸出在高倍镜或油镜下鉴定种类。

图1 土壤原生动物定量培养法的稀释和接种示意图

5 结果统计
根据未出现环数，查Stout“3级10倍稀释法”（表1）原生动物密度换算表得知每克土壤中的原生动物数量，即密度。例如，已知鞭毛虫在30个环中有5环中未出现，则查表得λ=69.5，若稀释度为104-106，则鞭毛虫的密度为695000个/克土壤。肉足虫和纤毛虫的密度也同此法求得，三大类密度之和即为总的原生动物密度。这是根据微生物数量统计法的原理从没有原生动物和土壤稀释度求出最或然数（MPN），以此推断每克风干土壤中原生动物数量。将表上查得的数量乘以土壤湿度，即为每克湿土中原生动物数量。

表1 “3级10倍”环式稀释法原生动物密度换算表（Stout，1962）

无原生动
物的环数
λ
土壤中原生动物的个数/g
10-103
102-104
103-105
1
230.3
2303
23030
230300
2
160.9
1609
16090
160900
3
120.4
1204
12040
120400
4
91.6
916
9160
91600
5
69.5
695
6950
69500
6
52.0
520
5200
52000
7
38.7
387
3870
38700
8
29.2
292
2920
29200
9
22.7
227
2270
22700
10
18.0
180
1800
18000
11
14.5
145
1450
14500
12
1107
117
1170
11700
13
9.42
94
942
9420
14
7.52
75
752
7520
15
5.90
59
590
5900
16
4.56
45
456
4560
17
3.51
35
351
3510
18
2.73
27
273
2730
19
2.16
21
216
2160
20
1.73

17
173
1730
21
1.40
14
140
1400
22
1.14
11
114
1140
23
0.92
9
92
920
24
0.74
7
74
740
25
0.58
6
58
580
26
0.44
4
44
440
27
0.31
3
31
310
28
0.20
2
20
200
29
0.09
1
9
90
30
0.00
0
0
0
实验二、土壤中线虫的分离方法及杀死固定
分离线虫方法多种多样，主要根据分离线虫的种类和数量、寄主植物种类、标本的固有属性、采集时间和所分离线虫的用途而定。本文介绍传统的贝曼漏斗法和经改良后的淘洗—过筛—离心法。
（一） 贝曼漏斗法
贝曼漏斗法是Baermann于1917年提出来。其本原理是：线虫是喜水动物，遇水便会从土壤或植物组织内游出，同时由于地心引力及线虫自身的重量，便会下沉至漏斗的管内集中。这种方法仅限分离活动性的蠕虫型线虫，对死虫、不活动的线虫和虫态（如胞囊线虫和根结线虫的雌虫）则是无效的。
仪器、设备和材料
贝曼漏斗：试验装置如图2。常用的是直径为8-10厘米的玻璃漏斗，漏斗管连在一段乳胶管，以止水夹（弹簧夹）控制胶管的开闭，漏斗放在或铁架台上或自制的木制漏斗架的圆环内。

图2 贝曼漏斗法（Baermann funnel）分离线虫示意图(刘维志，1995)
方法与步骤
取土样或含线虫的植物材料（如根系）切成大约0.5厘米-1厘米长的小段，用四层纱布或二层高级卫生纸（棉质）包住土样或根样，轻轻放入盛水的漏斗内，令水漫过、浸透，如水量不足，轻轻加水，防止冲出泥浆，经48小时，用空烧杯接在漏斗的胶管内，轻轻松开止水夹，从漏斗流出水，内含大量线虫。关闭胶管，向漏斗轻轻补充清水，可以再次收集线虫。
（二）淘洗—过筛—离心法
淘洗—过筛—离心法是在几种最基本的分离方法上，为适应大量快速分离线虫的要求而改进的一种方法。其基本原理是根据虫体大小及线虫的密度比水轻或与水的密度接近，线虫在淘洗过程中，可浮在水面或悬浮在水中。在过筛时，依虫体大小可以在不同筛目上收集线虫。过筛时，往往在密筛（如325目）上留有很多泥浆。为了进一步把线虫从泥浆中分离出来，可利用比重差异，应用不同浓度的蔗糖溶液或其他制剂（密度比水大），结合离心的方法，使收集到的线虫更加纯净。
仪器、设备和材料
1.仪器、设备
40、60、325目筛子各一，低速离心机，100ml或大于100ml离心管，天平，250ml烧杯，脸盆，洗瓶，喷头，试管，洗干净的青霉素瓶。
2.材料
TAF固定液(三乙醇胺—福尔马林固定液)：吸取2ml 40%甲醛，7ml 三乙醇胺溶于91ml蒸馏水。
蔗糖溶液：454克蔗糖溶于1000ml水中(密度1.18g/cm3,浓度为38.5%)。
方法与步骤
1 线虫标本的采集。
挖取植株根系，去掉5cm表土，在根围5-20cm深度取带根土样500cm3左右，放在大塑料袋中，在小塑料袋中放入标签，注明采集寄主、地点、采集人，将小塑料袋放入大塑料袋中，封口后带回实验室。
2 分离过程。
淘洗程序：从40目、60目和325目筛子上过筛，40目筛内收集根系（有根结线虫），编号后存入塑料袋内，60目筛内收集胞囊，亦存入塑料袋内，把325目筛子里的泥浆（内含线虫）洗入烧杯（150ml左右）。
离心程序：
(1) 将烧杯里的泥浆倒入离心管（250ml），称重平衡
(2) 将离心管放入离心机中，1000转/分，离心4-5分钟。
(3) 倾去上清液，加入蔗糖液（38.5%），称重离心，15秒钟，1000转/分离心
(4) 用烧杯收集上清液，加水稀释，防止蔗糖液渗透压过高虫体破裂。
(5) 烧杯中的上清液在325目筛子过筛（筛子倾斜），将325目筛上的线冲洗到烧杯里，再转入试管里将试管垂直放置，过夜（24-48小时，夏天时间短，春、秋季时间长）饥饿，把上清液用长吸管吸掉，试管底部为线虫。
3 杀死.。
向试管加入热水到60℃，将线虫杀死，15分钟。
4 固定。
(1) 将下部虫液用吸管吸入青霉素瓶，加入固定液。
(2) 固定一周后，再换洗固定液，永久保存。固定两周后才能进行鉴定。

实验三、土壤螨类的分离
仪器、设备和材料
1 仪器、设备
干漏斗架、40瓦灯泡若干、塑料瓶、载玻片、盖玻片、解剖镜、挑针、吸管、显微镜。
2 试剂
霍氏封固剂（Hoyers medium）：配方为阿拉伯树胶15克，水合氯醛100克，纯甘油10克，蒸馏水25毫升。该封固剂的配制按下列程序进行：先将阿拉伯树胶（粉状或结晶）完全溶解于蒸馏水，然后再加入水合氯醛和甘油，再经过滤去杂。为便于阿拉伯树胶的完全溶解，可稍加大蒸馏水用量，减低了粘度也便于过滤。待滤过后将清夜置如水浴锅上加热以蒸发多加的水分。
75酒精：量取790ml95%乙醇用蒸馏水稀释1000ml。
方法与步骤
1土壤螨的搜集
称量250~300克土样置干漏斗带铁丝网的盘中，在放置盛有75%酒精的塑料瓶，注意瓶口于漏斗出口对齐，并注意补充塑料瓶中的酒精溶液防止干涸。这样使用40瓦灯泡连续光照48小时，盖上塑料瓶既可。
2清洗保存。
对体表有粘附物的标本要进行清洗，用细毛笔在50%酒精中洗涮体表，剔除粘附物，但不要损坏体表结构。以上方法不能去污时，可以将标本放入封固液中，拨动标本，让封固液粘去污物。牢固的粘附物可用超声波震荡仪清洗，根据虫体大小确定清洗时间，防止虫体被震碎。为准确观察虫体结构，应留下一些标本不清洗。
3透明
去污后的标本，必须进行透明，最常用的有效方法是用乳酸浸泡。为了缩短透明时间，可放在温箱或灯光下加热，透明时间根据标本大小、温度及乳酸浓度而定。个体越大，温度越低，乳酸浓度越低，透明时间越长。只要标本已透明，就应该将标本取出来放在70~75%的酒精中保存。有些甲螨标本，体色极深，可用过氧化氢去色，但不必过份漂白。
4临时玻片与永久玻片的制作
临时玻片：用盖玻片封盖凹玻片的半个凹孔加入乳酸，放入标本整形，调整位置，固定，马上可以镜检，完成后放入酒精中保存（图3）。
永久玻片：将处理好的标本放在载玻片上，沾一小点霍氏封固液于近旁，将标本整肢，象中气门螨类，应尽量使四足伸展，甲螨标本比较圆厚，应固定位置，让封固液稍干后，覆上加有封固液的盖玻片。为了更完整、准确得镜检，还常需解剖标本，解剖需根据标本身体结构，以甲螨为例（图3），可先从后半体背腹沟将后背板剖开，再卸下四足、前背板、口器和基节板、腹板，依次制片。永久玻片干涸后，沿盖玻片四周涂上一圈指甲油，以免受潮滑片。

图3 螨类标本制片法
A.B.临时封片法；C:解剖标本永久制片法

实验四、氯仿薰蒸浸提法测定土壤微生物生物量碳

一、采样与样品预处理
土壤样品的采集方法和要求与测定其它土壤性质时没有本质区别。采集到的新鲜土壤样品立即去除植物残体、根系和可见的土壤动物(如蚯蚓)等,然后迅速过筛(2～3 mm)，或放在低温下(2～4℃)保存。如果土壤太湿无法过筛，进行晾干时，必须经常翻动土壤，避免局部风干导致微生物死亡。过筛的土壤样品调节到田间持水量的50%左右，在室温下于密闭装置中预培养1周，密闭容器中要放入两个50mL的烧杯，分别加入水和稀NaOH，以保持其湿度和吸收释放的CO2。预培养后的土壤最好立即分析，若需要放置一段时间，在低温下(2～4℃)最好不要超过10d。
二、方法—氯仿薰蒸浸提法（FE）
1、方法原理
土壤经氯仿薰蒸处理，微生物被杀死，细胞破裂后，细胞内容物释放到土壤中，导致土壤中的可提取的碳大幅度增加。通过测定浸提液中全碳的含量可以计算土壤微生物量碳。
浸提液中碳可用重铬酸钾容量法测定，也可用微量碳分析仪测定。此处介绍比较简单的重铬酸钾容量方法。
2、仪器及设备
培养箱；真空干燥器；真空泵；往复式振荡机(速率200rev/min)；冰柜；磷酸浴。
3、试剂
1. 无乙醇氯仿：量取500 mL 氯仿于1000 mL的分液漏斗中，加入50mL硫酸溶液[j(H2SO4)=5%]，充分摇匀，弃除下层硫酸溶液，如此进行3次。再加入50 mL去离子水，同上摇匀，弃去上部的水分，如此进行5次。将下层的氯仿转移到蒸馏瓶中，在62℃的水浴中蒸馏，馏出液存放在棕色瓶中，并加入约20g无水K2CO3，在冰箱的冷藏室中保存备用。
2. 硫酸钾溶液[c(K2SO4)= 0.5 mol·L-1]: 称取硫酸钾（K2SO4,化学纯）87.10g，加热溶于去离子水中，稀释至1L。(可加热溶解)
3. 重铬酸钾[c(1/6K2Cr2O7)=0. 4000 mol·L-1]: 称取经130 oC烘干2～3h的重铬酸钾（K2Cr2O7，分析纯）19.622g，溶于1000mL的去离子水中。
其他浓度：9.811 g ,4.9055 g,
4.邻啡罗啉指示剂：称取邻啡罗啉指示剂[C12H8N2·H2O，分析纯]1.49g，溶于含有0.70g FeSO4·7H2O的100mL去离子水中，密闭保存于棕色瓶中。
5.硫酸亚铁溶液[c(FeSO4)=0.0333 mol·L-1]：称取硫酸亚铁(FeSO4·7H2O，化学纯)9.26g，溶解于600～800mL去离子水中，加浓硫酸（化学纯）20mL，搅拌均匀，定容至1000mL，于棕色瓶中保存。此溶液不稳定，需每天标定其浓度。
硫酸亚铁溶液浓度的标定 吸取重铬酸钾标准溶液(试剂8)5.00mL，放入100mL三角瓶中，加水约20mL,加浓硫酸5mL和邻啡罗啉指示剂2滴，用FeSO4溶液滴定，根据FeSO4溶液的消耗量即可计算FeSO4溶液的准确浓度。

4、操作步骤
4. 1薰蒸
称取相当于20.0g烘干土重的湿润土壤3份，分别放在约100 mL的烧杯中，一起放入同一干燥器中，干燥器底部放置小烧杯盛装少量的水以保持湿度，同时放入一个装有50mL NaOH溶液和一个装有约50mL的无乙醇氯仿的小烧杯(根据干燥器的大小可以增加氯仿的用量，同时加入少量的直径约为0.5mm的碎瓷片)，用少量凡士林密封干燥器，用真空泵抽气至氯仿沸腾并保持至少2 min。关闭干燥器的阀门，在25oC的黑暗条件下放置24h。打开阀门，如果没有空气流动的声音，表示干燥器漏气，应重新称样进行薰蒸处理。当干燥器不漏气时，取出装有水、碱液和氯仿的烧杯，氯仿倒回瓶中可重复使用。擦尽干燥器底部，用真空泵反复抽气，每一次都要打开干燥器以加快除去氯仿的速度，直到土壤闻不到氯仿气味为止。

5. 2浸提
薰蒸结束后，将土壤全部转移到250 mL的三角瓶中，加入40 mL 0.5mol/LK2SO4溶液，在振荡机上振荡浸提30min（25℃，185rev/min）（转速根据仪器进行调整，必须使得土壤完全振荡开）,过滤。
薰蒸开始的同时，称取等量土壤3份，同上用K2SO4溶液(试剂2)浸提，同时做不加土壤为空白对照。浸提液在室温下可以放置1周，4℃下放置1个月或在-15oC下保存。

6. 3测定
准确吸取浸出液10.00 mL放入硬质消煮管中，加入重铬酸钾标准溶液(试剂3)5.00 mL、浓H2SO4 5mL加入少量的抗暴物质,在170-180℃磷酸浴上煮沸10min，冷却后用去离子水全部转移至150mL三角瓶中，总体积为70mL左右，。加入2滴邻啡罗啉指示剂，用硫酸亚铁溶液(试剂5)滴定剩余的K2Cr2O7。
4.4 测定土壤含水量：称5.00g 上述湿润土壤，放在铝盒中，在105℃烘箱中烘8h，然后称其干重。

5、结果计算
1.有机碳(Oc)的计算
W(C) =（V0-V1）×c×3×ts × 1000 /DW

式中：W(C) ¾¾ 有机碳(Oc)质量分数，mg·kg-1；
V0 ¾¾ 滴定空白样时所消耗的FeSO4体积，mL；
V1 ¾¾ 滴定样品时所消耗的FeSO4体积,mL；
c ¾¾ FeSO4溶液的浓度,mol·L-1；
3 ¾¾ 碳(1/4C)的毫摩尔质量，M(1/4C)=3mg/mmol；
1000 ¾¾ 转换为kg的系数；
ts ¾¾ 分取倍数;
DW ¾¾土壤的烘干质量，g。
2.生物量碳（Bc）的计算
W(C)=2.64Ec

式中：W(C) ¾¾ 微生物量碳(Bc)质量分数，mg·kg-1；
Ec ¾¾ 薰蒸土样有机碳量与未薰蒸土样有机碳量之差，mg·kg-1；

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