交变应力对成肌细胞及微血管内皮细胞的力学效应分析讲课讲稿.docx

此文档收集于网络，如有侵权请联系网站删除摘要交变应力对成肌细胞及微血管内皮细胞的力学效应研究博士后宋锦磷合作导师陈君楷、樊瑜波教授在自研的脉动式细胞力学系统基础上首次对大鼠翼外肌成肌细胞和 微血管内皮细胞旖加交变应力，用倒置相差显微镜、扫描电子显微镜、 MTT、免疫组织化学技术和3H-TDR，进行细胞形态及生物学效应初步研 究。详述了脉动式细胞力学系统的工作原理、组成结构和实验流程，总结 了系统应用的力学细胞准备程序、关键操作步骤及注意事项：介绍了细胞 图像计算机捕获、处理系统的应用；对系统试验段的部分力学参数进行了 检测，采用有限元分析从定量的角度获得了试验段的力学特性分布。对大鼠翼外肌成肌细胞进行交变力学刺激培养，发现成肌细胞形态在 交变应力加载前后由无规律延展向与张应变平行方向转化；在较低的应变 水平(小于621)作用下成肌细胞排列方向主要沿张应变方向，而在较 大的应变水平(近似12)作用下成肌细胞排列方向具有较多的沿张应变 垂直方向变化的趋势。3HTDR检测发现相对较低的频率(O4Hz)可能较 125Hz具有更大的促增殖活性作用；随着交变应力作用时间的延长(12 小时以内)，成肌细胞增殖活性在较低应变范围内随应变的加大而增加， 较大应变比较低应变具有较小的成肌细胞增殖活性增加趋势。对大流量脉动式剪切应力作用8小时后血管内皮细胞的形态参数进行 比较，第6个小时左右脉动流作用下(平均95dynes，cm2)血管内皮细胞的 长轴及方向角将发生变化，内皮细胞方向排列的改建先于细胞大小(面积、 周长等)的改建，其方向性改变较定常流其时效性提前。扫描电子显微镜 的结果也发现，同流量下脉动流较定常流对内皮细胞方向排列具有提前改 建的趋势，内皮细胞表面出现平整化，降低了细胞表面流动阻力，符合血 管重建的生理功能意义。该研究为交变应力下翼外肌组织和血管的改建提供必要的基础实验 数据，对进一步从细胞生物力学角度揭示“应力一生长一形态”改建机制具 有重要意义。关键词：交变应力(应变)成肌细胞血管内皮细胞形态增殖此文档仅供学习和交流AbstractThe alterations in shape and proliferation of rats myoblasts andendothelial cells under the time varied stress(strain)Postdoetor：Song JinlinSupervisor：Chen Junkai，Fan YuboBased on the puisatile cellular meehanical system we founded。to loed the difierent strain on the the myoblasts oflateral pterygoid muscle or to load the pulsatile flow shear stress on endothelial ceils ofrat，the alterations in shape and proliferation ofcells undertimevailedstressors1硫were assessedby phasecontrast microscopy,scanningelectron microscope，Mn，immunohistochemistry andH-TDRThe main works andresults are as follows：1The study and application ofthe pulsatile ceUular mechanical svstem：Firstly,the principle，the constitution,the preparative and the experimental procedures of this system were expatiated in detailsSecondly,the application of the cellular image acquiring and analyziIIg system was introduced in details tooFinally，the mechanics parameters ofthe experimental segment was mensurated by using mechanics reefsure and finite element methodThese works WeTe helpful and necessary for the advanced cellular mechanical experiments2The research on the shape and proliferation of rats myoblasts under the time variedstrain：There had the bigger effect on the proli庙rafion of rats myobhsts under the lower time varied strain(621)more than in the higher time varied strain(1276)for 6 or 12 hours which examined byH-1DRThe frequency oftime varied strain had also the important influence in the proliferation,the lower frequency，O。4Hz)has the biggereffect oR the proliferation more than in the higher frequency(125蚴under the sametime varied strainIn the certain period of time(0一t2h)and certain magnitude of timevaried strainthe proliferation of ratsmyoblasts rised11碡orientation of myoblastseemed without obvious orderliness befoloading，to parallel with the direction ofstrain along with the membrane船loading the loweltime varied stlain,there had onetrend to set myoblasts shape more upright along witll the membrane after loading thehigher time varied strain3111e research on the shape ofratS endothelial cells under the time varied stress：To compare with the configuration parameters of endothelial cells in situ loading the bigger pulsatile flux(average 95dynescmz)for 8 hours or not，there had the significant change in the major axis and angle of orientation of cells about 6 hours compare with the preliminary parameters of cells，but the area and perimeter of cells had not this significant change till 8 hours laten It m既Rrls the orientation of endothelialcells remodel faster than the magnitude of cells under this fluxAnd we found thepulsatile flux also has the bring forward trend compare with the stable flux with thesame flux，to reduce the flow resistance of the external surface ofendothelial cells by leveling offthe external surface ofceUsIt iS accord with the remodeling ofblood vesselin physiologyThis study supplied a method for loading the time varied stress or s缸咖to cells of muscle and blood vessel，it could provide the basic experimental data for the remodeling of tissues in functional orthopaedicsWe could quantitatively study theremodeling ofstress(strain)-growth-cell shapeunder the mechanical stimulates invitIo in advance researchKeywords：time varied stress(strain)，myoblast，endothelial cell，shat，proliferation四川大学博士后工作报告1细胞力学概述11前言生物力学是现代力学的一个新分支，是现代生命科学和生物医学工程学的重 要基础。它是在力学与生物学、医学的交叉渗透中发展起来的-fl相当活跃的边 缘学科。它以生物体为研究对象，以现代力学的基本原理及其定量分析、计算和 实验方法为主要手段。结合其他学科的有关理论和方法，研究生物体的功能特性 与力学有关的生命运动规律。细胞力学是生物力学的重要组成部分之一。细胞力 学是众多学科交叉的一部分，它所涉及的研究问题包括：细胞怎样运动、变形和 相互作用：细胞怎样感知机械力、产生机械力和怎样对机械力做出响应。细胞是一切有机体的形态结构和生命活动的基本单位，几乎所有的有机体都 是由细胞和细胞的产物所组成。高等生命的基本过程如代谢、营养和生长等都以 细胞为基本单位，细胞形态与功能是相互联系和作用的。细胞利用基因信息合成、 分类、存储和转移生物分子，转变能量、传递信号、维持内部结构以及对外部环 境的响应等都包含力学方面的因素。为了更好地理解细胞结构功能关系和调 节机制，就必须结合生物学和生物力学的方法对细胞加以研究。细胞力学正是这 些学科交叉的一部分，它是组织工程和细胞工程的基础之一，常常要研究机械力 对细胞形态变化及生长的影响。它涉及到细胞在载荷作用下细胞、细胞膜、细胞 骨架的变形、弹性常数、粘弹性、黏附力等力学性能的研究，也不可避免涉及到 力学因素对细胞形态、生长及分泌的生物学影响效应。越来越多的证据表明，细胞都依赖于一定的力学环境或者说受一定力学环境 的调节，如肌肉收缩导致肌肉、肌腱的应力、应变；血液流动对内皮细胞施加的 剪应力及内皮细胞和血管壁所受压力和周期性应变等。近年来有关生物组织“应 力生长”关系的研究表明，从器官、组织到细胞、亚细胞等各个层次上的生 命运动，都是在一定力学环境中进行的。“应力生长”的关系在细胞水平上 主要体现在两个方面：单个细胞的生物学行为，如增殖、形态变化和分泌功能等 的响应；群体细胞组织化的整体行为响应，如血管内皮细胞收缩功能的增强、肌 肉组织在力学环境下的改建等。以上这些都说明了机械力深刻影响着细胞组织 的发展、维护和重建，是细胞生物学和力学研究者都不可忽略的一个重要因素。本章对细胞力学研究理论及相关细胞力学实验技术进行简述。四川大学博士后工作报告12细胞力学研究理论简介细胞力学是细胞工程学和组织工程学的基础，是近年来生物力学领域中发展 迅速的一个前沿领域。细胞的形态结构及其功能，细胞的生长、发育、成熟、增 殖、衰老、死亡以及细胞的分化、调控机理，都和细胞的力学特性有关。细胞由细胞膜、细胞质和细胞核组成。细胞膜使细胞内部与外部环境隔开， 也是细胞与环境进行物质、能量、信息转换的通道，细胞膜的受力和变形对膜的 功能和结构有直接影响。此外，细胞与细胞的连接也是相邻的细胞膜特殊生化过 程形成的连结装置。在细胞内部，存在着极其复杂的蛋白质纤维的网络结构系统， 称之为细胞骨架，它主要包括了微管(microtuble)小微丝(micro-filament)， 中丝(Intermediate filament)等结构。遍布细胞内的这种网络结构对于细胞 形态构造、细胞运动、物质运输、能量交换、信息传递，细胞的分化和转化等一 系列方面起着重要作用，也正是这一网络结构使得细胞具有主动变形和抵抗被动 变形的能力。众多研究者从细胞表面变形的不同侧面，发展了一些细胞形变的有关力学理 论，简述如下：121张力理论(ten8ionfleld theory) 细胞膜很薄，一个很薄的膜非常容易屈曲，因而在膜平面内几乎不能承受压应力。假设：膜非常薄，完全不能承受面内的任何压应力；在膜平面内， 沿一个方向的主应变为正时，其正交方向的主应变为负或可以忽略。满足以上两 个假设的称之为张力理论。需要指出的是，当膜沿两个正交方向的应变均为正时， 张力理论的第二个假设不成立，因而张力理论失效。在此情况下，可按连续介质 力学平衡方程直接求解“。Fung“研究了血流剪力作用下血管内皮细胞膜的受力情况。根据张力理论， 正交于血流方向的应力可以忽略。假设细胞是流体状的(fluid like)，因而细 胞内部不能承受剪力(稳态条件下)，这时，作用在细胞表面膜截面上的最大应 力可以表示为：0 X x=t LH。一其中t为流场剪力，L是细胞的长度，H为细胞 膜的厚度根据血流理论，t介于1-2N之间，内皮细胞的长度L约为lo_60 pm， 厚度H约为10 u m于是发现膜内的应力高出血流剪切应力34个量级。过去2四川大学博士后工作报告的研究常常集中在细胞受到的流场外力的大小上，表明了通过细胞膜的物质和能 量交换同流场剪切力的作用有一定的关系。现在通过对细胞膜本身受力的研究， 可以建立细胞膜的受力与细胞形态及功能的直接关系。此外，膜内的高应力分布 有可能导致细胞的损伤和坏死，从力学观点看，任何一种材料都有其极限应力。 张力理论没有涉及细胞的本构方程，只研究了细胞膜的受力情况及细胞与细胞的连接因而这一理论被认为是细胞的基础理论122小变形理论采用微型吸管技术时，如果管径远小于细胞的直径，而且吸压不大时，小变 形理论成立。由于活细胞具有明显的粘弹性行为，一般采用Uaxwell，Voigt或 标准的线性固体模型(Kelvin体)予以描述。下面是两种应用于吸管技术实验 分析的小变形理论力学模型“。1221半无限体模型(heIf一8paca modeI) 当细胞的变形阻力主要来自细胞骨架的皮质层时，如果吸管的内径非常小，可将细胞看作是具有皮质层厚度的平板；如果应力沿厚度衰减很快时，可以近似 看作是半平面问题。该模型尽管简单，但它提供了一种简单的分析实验数据的方 法。Sate“等采用该模型进行求解。1222常张力皮质层-Maxwe II液滴模型(Maxwe ll 1qu i ddropmodel with a constant cortjcal Iayer)细胞的膜表面是高度皱状的，因而它允许细胞易于变形而膜表面几乎不承受 张力。Bagge“等提出了用Kelvin模型描述白细胞的力学性能，实际上细胞的 真实力学模型要复杂的多。Hochmuth 6建议将白细胞看作是具有两相流的三层 壳模型。但由于细胞结构上是非均匀的，因而发展非均匀、多相流、多层壳模型 是必要的。123大变形理论在应力场作用下，细胞的实际变形往往较大，因而对细胞及细胞膜进行大 交形分析是十分必要的。Fung“针对红细胞膜面积变化很小但可以发生大变形3四川大学博士后工作报告的特点，建立了相应的红细胞膜本构方程。Cheng“将细胞看作是包含不可压缩 流体的轴对称壳体结构，建立了计算细胞大变形的变分原理及有限元格式，并且 考虑了细胞主动变形的影响。124活细胞的主动变形上面考虑的都是细胞的被动变形(passive deformation)，即外部力作用下， 细胞内部抵抗变形的能力。而活细胞本身存在着主动变形(active deformation)。研究包含细胞主动变形在内的细胞的力学性质是细胞力学的目的 之一。目前对自细胞的主动变形进行了以下研究：Sclunid和Skalaki的肌动蛋 白聚合(actin p01ymerization)模型”，Osier和Perelsont的渗透压模型“ 对白细胞的突出运动(protrusive motion)进行研究，其目的在于弄清伪足 (pseudopod)尖端产生驱动力的生化机制“。Simon 等提出了测量细胞主动大变形的实验方法，这种方法可以推广到三 维情况，同时提到细胞质的变形远比目前所有理论预测的要复杂得多。研究细胞 主动交形的机制，不仅需要从力学方面研究，更重要的是摘清楚其生物学过程和 能量转化过程，在此基础上，通过考虑细胞的微结构，有可能得到细胞主动变形 的本构方程，这将是细胞力学的一个十分重要的研究课题。上述细胞力学的基础理论研究主要涉及细胞表面变形，通过建立相关的数学 模型，边界约束参数化，求解相关方程以获得细胞表面力学效应分布，但也为进 一步的细胞力学研究提供了发展基础。13细胞力学实验技术概述细胞力学是现代生物力学中发展十分迅速的一个前沿领域，它涉及细胞在力 学载荷作用下细胞的各种力学行为变化和细胞代谢等一系列改变。细胞力学的实 验研究关键在于使细胞变形的加载方法，在此基础上，通过显微系统观测细胞的 受力和变形的关系：当然，细胞力学实验还与细胞的培养技术及细胞分离技术有 直接的关系。最早关于细胞变形的实验研究可以追溯到1939年，Norris 将一4PQ)Jl大学博士后工作报告微形针置于红细胞中，通过测量针的弯曲变形确定作用在细胞上的力，但这一方 法非常难以精确实现。在离体培养细胞的力学实验方法研究领域， Glucksmann(1939)进行了开拓性的研究，将鸡胚胎胫骨内膜细胞培养在成对的肋 间肌基质上，当肌肉组织萎缩肋骨彼此靠近后，离体培养的细胞受到压力作用； Rodan等(1975)采用电磁阀产生的脉冲控制气动活塞装置，对鸡胚胎长骨细胞凝 胶体施加低值连续压力(12)0最理想的情况是研究细胞在机体的生理状态下对应力的各种反应，但体内的 众多的环境因素使体内研究难以区别单一效应或特定的联合效应，主要是直接控 制或检测以上诸多理化因素的影响是不现实的。此外，常规的宏观力学加载方式 不可能直接作用于微米级大小的细胞，研究的关键也就集中在间接加载的技术如 何实现。所以在体外将特定应力因素作用于细胞上，探讨细胞的生物力学调节机 制极为关键；如何对体外细胞精确地控制并模拟施加应力，也就成为众多学者的 关注焦点。由于生物体组织和器官结构的复杂性以及生物体个体之间的差异性，使得在 体(in vivo)细胞的力学环境复杂多样。这些因素综合作用增加了人们大量进行 在体细胞力学行为研究的难度。随着细胞的体外培养和分离技术的发展，人们可 以在细胞水平上进行可控实验条件的体外(in vitro)实验。多年来，经过不断的 改进和发展，人们提出了多种离体培养细胞的力学实验方法，研制出不同类型和 功能的实验装置，不仅可以定性地分析而且能定量地研究体外培养细胞的力学特 性。体外细胞加力装置的研制，使我们能够对细胞在体外受力后发生的结构、功 能及代谢的改变进行深入细致的研究，但模拟施加应力的相似性在很大程度上决 定了研究的深入层次。因此，寻求合适的细胞加载方法和相关的测量手段将是细 胞力学面临的首要问题。细胞力学所采用的主要实验技术目前可大致分为几种类型： (1)流体剪切应力加载技术；如流动小室(flowing chamber)、悬浮技术(suspending technique)等，通过流体流动产生剪切力对细胞加载。 (2)弹性基底材料间接加载：通过对细胞粘附的基底材料加载后，使基底材料的应变传递到细胞上，如弹性膜材料、四点弯曲梁的应变加载方法及三维 培养加载技术等。四川大学博士后工作报告(3)加压加载技术：模拟在体环境下组织间隙压力，研究在压应力作用下细胞 力学特性的实验方法。产生压应力的方式包括气体、液体间接加载法和直 接加载法。(4)单个细胞加载技术：采用显微技术和微管吸吮等方法，直接对单个细胞进 行加载，并通过实时记录系统加以记录，利用图像处理仪和计算机进行位 移测量及变形数值分析。简介如下：131流体剪切应力加载技术流体剪切应力加载技术是对细胞加载应力的主要方法之一。常用来研究血管 内皮细胞的粘附力及流体产生的剪应力对细胞的影响。常用的流动小室都是从顶 视方向去观察细胞在剪应力作用下的变形和细胞与基底的粘附情况以及细胞的 生物学反应。Cao(1997)“”设计了一种新型的流动小室，它不仅保持原有流动小 室从顶部观察细胞在流场作用下的形态，而且还能够从侧面清楚地观察细胞在流 场作用下的变形，非常适合于研究血管内皮细胞之间的粘附作用。由于平行平板流室(如图11a所示)能保证细胞在受到不同水平的恒流或生 理剪切力作用的同时仍然保持黏附，目前已成为人们研究离体培养细胞生物力学 特性的重要手段之一。平行平板流室由具有不同高差的静水压提供不变的剪应 力，或由泵提供动力，在流入管和流出管之间产生压差，使细胞受均匀或脉动的 剪切力作用。Levesque和Nerem(1985)“”，Jacobs等(1998)“”使用平行平板 流室系统，研究剪切应力对细胞形态功能的影响。为减小入口流效应，Heimeke 等(2001)设计的流室具有T形部分，用来发展入口流，使流槽内产生充分发 展的泊肃叶流，并用大视野的荧光光学系统进行图像捕获和重建。平行平板流室 具有流室体积小，便于在显微镜载物台上实时观察、显示和记录的优点；操作简 便快速，能实现自动化控制。其缺点是在流室系统中很难分清切应力和静水压作 用的影响，并且必须要求有能够贴壁生长的细胞；流场的相似性不能保障，特别 是在血管生理(脉动压力波形、振荡状态等)、几何结构(直径、长度直径比、 锥度角等)、动力学参数(粘度、边界条件)等方面不能很好地模拟真实情况的 流体动力学环境。Dewey(1984)“”采用如图11b所示的锥板流室系统研究了流体剪切力对6四川大学博士后工作报告细胞黏附特性的影响，并能使培养的内皮细胞受较大范围剪应力。Schnittler 等(1993)“”设计的锥板系统，锥板均透明，可用相差倒置荧光显微镜进行观察， 锥板的间距由测微计和复位齿轮调节。转速由微电机提供。Langille等(1984)“” 使用种特殊的锥板系统，如图11c所示，在旋转板和静止板间产生剪应力的 板一板流室。锥板流室的优点是使细胞受均匀的剪切作用，通过改变锥角和转速， 能取得较大范围的剪应力，加工或装配误差、尺寸等对实验精度影响较小。其缺 点是培养室内的液体是通过锥体的转动而流动的，不能与外部构成循环，所以只 能用来研究短时间内切应力对细胞黏附、变形和生长的影响。其它还有如图11d所示的圆柱管装置，如图l_1e所示的径向流装置和具有 各种狭窄膨胀度的流室等产生流体剪切应力等细胞力学实验方法。三三 硝雾普焉b，纛，壶尘(a)(C)(d)(e)图11流体剪切法 a平行板流室：b锥板流室：c板一板流室： d圆柱管：e径向流装置Fi911fluid shear methods(a)Parallel plate flow chamber(b)Cone and plate flow chamber(c)Diskqtisk flow chamber(d)Cyclindrieat tube(e)Radial flow device132基底应变加载技术1321四点弯曲粱加载)wan(1996)。采用了一种四点弯曲梁的加载方法，与Jones(1991)。”四点 弯曲梁的加载方法原理是相同的，但在具体做法上有所不同。他所采用的加载系7四川大学博士后工作报告统是由计算机控制部分、线性伺服电机传动装置、梁挠度控制接口部分以及一个 lOOmm的培养皿、丙烯酸三角形支座和万能材料试验机等组成。该系统可以控制 梁的挠度和挠度变化率，梁表面的应变用应变计测量。由于采用四点弯曲梁，以 及结构的对称性，梁的两个力作用点之间处于等弯区，因此梁在该区域的应变处 处相等。Bottlang等”(1997)使用如图12a所示方法，由电磁驱动矩形硅胶 膜产生四点弯曲，并通过全息干涉进行测量，用光学实验论证了应变的各向同性。1322弹性膜阀接加载：选用弹性膜为培养细胞的基底材料，然后利用液体或气体向其施加压力， 引起弹性膜的变形间接对培养的细胞加载。如Brigton(1991)制做了一套液 体加载细胞实验装置，由多聚砜材料制成的细胞培养环，Pellthane236380AE 薄膜和丙烯酸做成的基座以及两个氟橡胶密封圈组成。薄膜用一个氟橡胶密封圈 固定在细胞培养环上，用另一个氟橡胶密封圈把细胞培养环与丙烯酸基座固定并 密封在一起，薄膜与丙烯酸基座之间有一个2mm的间隙，并有一个液体入口处， 在顶部有一个60rm的佩特里培养皿盖，该装置一共可放置8个培养皿。其工作 原理是用电机驱动一个泵产生液体压力，通过聚四氟乙烯管路系统和管阀装置， 使薄膜向上凸起发生弯曲变形，产生双向应变，并用一光学测量系统进行测量。 Buckley(1990)、Gilbert(1994)“”所使用的细胞应变加载装置是由Flexcell 公司生产，该装置由计算机监控系统、真空底座和密封垫、正负压力控制模块、 柔性细胞培养板(F1EXI型)等组成柔性细胞培养板基底膜的应变率、加载频率、 延伸率、变形均可由计算机通过空气流入速率控制。该装置能够放入6个细胞培 养板。柔性细胞培养板的亲水基底膜表面可达到200的延伸率。Leung等(1977)。使用如图12a所示的方法，用马达驱动的活塞联动装 置，使附着于矩形弹性硬蛋白基底上的细胞受到不同频率、不同大小的周期性拉 伸。Carosi等(1992) 迸一步改进，用铰链Dc马达控制偏心杆使细胞附着的 矩形弹性膜产生位移。Winston等(1989)。使用如图13a所示方法，将空气或流量受控的流体 注入膜下的封闭腔内，通过弹性膜底面的变形，使附着于膜上的细胞受牵张。 Hasegava等(1985)。使用如图13b所示的方法，1对凸形压板上的、细胞附着 的弹性膜施加连续或间歇性拉伸。膜拉伸的程度随所用压板的曲率不同而变化。8四川大学博士后工作报告Hung(1994)使用如图13c所示方法，提出了一种在弹性基底膜上产生双轴等 应变的方法，在一个用于细胞单层生长的圆形弹性材料上产生0040“均匀 的等轴应变，在加载后基底仍保持一个平面，整个基底上产生均匀的等轴应变； 所有的细胞处于相同的应变场中，并且与其方位无关，允许用光学系统实时监测 基底应变作用下的细胞形态。该系统由一个多聚砜材料制成的底部有两个凹槽的 圆形空腔，一个透明、柔顺的弹性基底膜，一个0形圈，一个用于加载的聚四氟 乙烯同心圆凸槽组成。在聚四氟乙烯同心圆凸槽和多聚砜材料圆形空腔中间有一 个直径为254cm上下通透的部分，在加上基底膜后用于培养细胞和显微镜进行 光学观察，基底膜采用Pellethance2363-80AE，其厚度为94 ll m，用0形圈固定 在空腔底部最外面的一个凹槽里。Vandenburgh(1988)o”使用如图13d所示方 法，使具有球形尖端的压杆产生向上的脉冲运动，带动弹性橡胶膜产生位移，从 而使膜上黏附的细胞产生牵张。这种方法的特点是径向、周向应变分布依赖于介 质及膜的拉伸和压杆与膜的接触，且应变量与压杆的垂直位移有关。soma(1997) ”采用的则是另外一种装置，它是由6个培养皿组成，培养皿的底部用高度柔软 的材料制成，作为培养细胞的基底膜，僵它的加载方式不是用空气产生压力，而 是在培养皿底部高度柔软材料的基底中部加一个压杆，压杆的另一端与培养皿盖 连接。当培养皿盖受载荷作用后向下运动，通过压杆使培养皿的基底膜发生变形， 基底膜上的应变通过测量压杆使基底膜向下垂直变形获得。Banes等(1985) 使用如图13e所示方法，利用真空产生的负压的应变加载单元有6个附带橡胶 垫的气门，橡胶垫上涂有密封油，每一个气门有两个同心位置，分别用于安装直 径为60ram和lOOmm的佩特里培养皿。在单元的一边装有真空压力表，用于测量 真空度；在单元的另一边有一个抽气阀，用于调整加载单元的真空度(负压)。a四点弯曲(a)Flexure一三2空b单轴拉伸(b)Uniaxial tension图12矩形基底的拉伸法Fi912Methods ofrectangular substTate stretch9四川大学博士后工作报告(d)(e)图13园形基底的拉伸法 a流体：b凸形压板：e环形压板： d压杆尖端：e真空Fi913Methods ofcircle substrate distention(a)Fluid displacement；Co)Convex platen displacement；(c)Pin shape displacement；(d)Vacuura；(e)Circle platen displacement133加压加载技术1331气体、液体传导静压力的间接加压法： 可通过以下方式加载(如图i4和图i5)： (1)注射器抽真空产生的负压使培养室内的细胞受压。 (2)在密闭的细胞培养室内注入一定的气体，使培养室内的细胞受压。如Imamura(1990)将旺、CQ和N2组成的混合气体注入培养室内，用带压力传感 器的电磁阀控制压力大小并用压力计进行监测。(3)由水柱产生的静水压力作用于培养室内的细胞，如Parkkineno”等把 牛关节软骨细胞密封在双层膜内并固定于培养皿中，将培养皿放入注满水的圆柱 形培养室内，使细胞受到不同频率、不同大小的连续或周期性静水压作用。该法的优点是设备简单；易传递载荷并且载荷的传递不依赖于培养物与基底 的结合状态，使细胞受力均匀；易进行不同载荷条件下的重复实验。其缺点是将 细胞置于一个密闭的环境中，随着细胞增殖和代谢，该环境中的02、C仉分压及 PH值等都会发生改变，不利于长时间的细胞力学实验。1332直接加载法10四川大学博士后工作报告Sah等(1989)(36)采用如图16所示的方法，使软骨细胞切片受单轴径向无约束 静压和动态周期性莲力作用。动压板的设计使切片在整个实验中都处于压板之 间，即使在较高振幅的非线性荷载条件下，随着压力值的改变所有切片的直径变 化也不大，动压由伺服控制的马达提供。压板接触的优点是可以得到较大范围的 试件变形，易形成与在体环境相类似的载荷条件：缺点是应变的不均匀性，尤其 是应变范围内泊松效应的不均匀性。LoadLoad由邕图14气体加压图15液体加压图16直接加载法(压板) Fi914 Gas hydrostatic PressurizationFi916 Direct loading(platen abutment) Fi915liquidhydrostaticPmssuri日tion134单个细胞应力施加技术1341微管吸吮技术此项技术是目前裣测单个细胞变形和黏附的重要手段。它通过测量在一定负 压作用下细胞的变形及变形过程来研究细胞的力学特性；或者用双微管吸吮黏附 在一起的细胞对，利用细胞的变形分析细胞问相互作用的力学问题。微吸管吸吮技术最早由Mitchison和Swann(1954)”提出。装置通常包括两 套液压控制系统，一套用来精细控制微吸管的运动，另一套则控制吸管产生用以 吸附细胞的微小负压。将具有几毫米内径的玻璃管一端加热，并通过抽拉装置， 制成微米量级的尖端。然后插入细胞培养室中(图17a)，玻璃管的另一端与微 型水箱连接，水箱又