第1章伦理审批---中山大学附属第一医院知识讲解.docx

中山大学附属第一医院生物资源库
样本标准化操作流程
第1版
2013-10

目录
第1章 伦理问题 1
第2章 标本的收集与处理 2
2.1血标本 2
2.2组织标本 3
2.3尿液 4
2.4其他标本 5
第3章 全血基因组DNA的提取与保存 6
3.1全血基因组DNA提取 6
3.2全血基因组DNA检测 7
3.3 DNA分装方案 7
第4章 资料收集及数据维护 9
4.1资料收集 9
4.2数据维护 9
第5章 标本的使用管理 10
5.1申请 10
5.2审批 10
5.3出库 10
5.4反馈 10
第6章 质量控制 11
6.1人员的培训与考核 11
6.2设备和样本的空间安全 11
6.3数据信息的安全 11
6.4标本的质量控制 12

第1章 伦理审批
所有标本在收集前必须由中山大学附属第一医院伦理委员会论证通过，同时经过患者或其家属的同意并签署书面知情同意书，并且与具体相应的临床科室协商，在绝对保证临床诊断的前提下进行标本收集，避免不必要的纠纷。

第2章 标本的收集与处理
2.1血标本
1. 血标本采集
⑴ 血标本的采集方式为外周静脉穿刺取血，抗凝管（EDTA）和促凝管各1支，每支3～4ml。抗凝管采集后立即轻轻颠倒震摇8～10次。并填写好标本送存单，记录患者姓名、病历号、诊断疾病、采集时间等信息。
⑵ 避免在输液的同一肢体上及输液装置的近心端采血，避免在输液管内采血，避免在大规模输液（超过1000ml）12小时之内采血。采血最好在早晨患者进食和饮水之前进行，首次入院患者的采血应在所有的治疗之前。
⑶ 2h内将标本送至实验室，完成处理和分装。
2. 血标本处理
⑴ 标本处理前，实验技术人员先准备好二维码冻存管，并在管身标记“患者编号+S/P/B+分管号”（S为血清、P为血浆、B为白膜层buffy coat）。同时收集患者的人口学信息、临床信息、处理时间等。
⑵ 血标本处理流程如下图。处理完毕后尽快通过冰盒将标本转运至生物资源库储存。
血标本2管
3~4ml
促凝管
常温静置30min
抗凝管
4℃3000rpm离心10min
血清
250μLÍ5支
血浆
250μLÍ5支
白膜层
300μLÍ1支

3. 血标本储存
⑴ 标本到达生物资源库后，技术人员通过扫描枪读码将标本录入标本管理系统，分配存储位置信息，再将标本放入到相应的冰箱当中。
⑵ 在标本管理系统中进一步完善患者的人口学信息、临床信息、处理时间等。
2.2组织标本
1. 组织标本采集
⑴ 临床诊断明确，未经治疗的手术切除标本，且尽量保证所取的组织没有坏死。
⑵ 组织标本包括肿瘤组织、肿瘤旁组织（距离肿瘤组织2cm正常组织（距离肿瘤组织＞5cm）。如果肿瘤标本组织太小（如直径≤1cm）则不宜取，首先满足临床需要。对于空腔器官，如食管、胃、肠、胆囊、膀胱等，“癌旁组织”、“正常组织”应取相应部位的“粘膜组织”样本。
⑶ 组织标本采集必须在手术标本离体后30min内完成，并用冰盒转运至实验室进行处理。
2. 组织标本处理
⑴ 标本处理前，实验技术人员先准备好二维码冻存管，并在管身标记“患者编号+T/P/N/L+分管号”（T为肿瘤、P为瘤旁、N为正常组织，L为淋巴结）。同时收集患者的人口学信息、临床信息、处理时间等。
⑵ 组织标本的处理在超净台内完成。工作人员应戴上无菌手套，使用一次性无菌器具，应避免不同样本相互接触，避免样本的交叉污染和二次污染。在不同样本上的操作或者在同一个样本上不同位置的操作都应使用干净无菌的刀片和器具。禁止将样本置于干毛巾或其他吸水的物质上进行操作。
流程如下图。处理完毕后尽快通过冰盒将标本转运至生物资源库储存。
组织标本
（肿瘤、瘤旁、正常）
切成数份
1 cmÍ1 cmÍ0.4 cm大小
直接分装数管
-80℃或液氮保存
RNAlater液处理
-80℃保存

福尔马林固定
石蜡包埋，常温保存

3. 组织标本入库
⑴ 标本到达生物资源库后，技术人员通过扫描枪读码将标本录入标本管理系统，分配存储位置信息，再将标本放入到相应的冰箱当中。
⑵ 同时在标本管理系统中进一步完善患者的人口学信息、临床信息、处理时间等。

2.3尿液
1. 尿液样本的分类
分为晨尿、夜尿、24h尿样或其他（随机采样、分级取样、定时取样），首次晨尿的白细胞和红细胞或尿液激素浓度较高，最适合用于检测。因为首次晨尿含有晚餐带来的溶解物及代谢物，浓度偏高不利于比较。通常采集空腹的第二次晨尿。随机尿样适合常规筛查和细胞学研究。分级尿样用于比较尿样和血液中分析物的浓度。定时尿样可用于比较生物分子的排泄模式。
2. 尿液样本的收集
采样容器要求无菌、干燥、50~3000 ml 广口且配有防漏的盖子。根据需测定的分析物来决定是否添加防腐剂。防腐剂的种类因测试的方法、保存的时间及样本运输条件的不同而不同。EDTA 和亚硫酸氢钠是常用的尿样采集防腐剂。
3. 尿液样本的处理
生物资源库工作人员根据标本送存单完成标本的管理系统软件的信息录入，包括患者人口学信息、临床信息、标本的种类及处理方式、处理时间、储存方式位置等。并生成标本的标签。
尿液样本通常离心除去细胞和沉渣，然后对去细胞尿液和分离出的细胞颗粒进行分析和（或）分装冷冻。根据分析目的的不同，样本有各种采集方法。采集时应记录样本的采集方法。
2.4其他标本
指甲和头发样本：可用于痕量金属分析，也可以用来提取DNA。采集后独立包装存储于常温干燥柜中。
唾液：可用于药物测试艾滋病毒检测或激素水平的监测和提取DNA。唾液可以等体积分装或离心，产生的上清和沉淀可以分析和（或）单独存放。
第3章 全血基因组DNA的提取与保存
3.1全血基因组DNA提取
1.仪器与试剂
QIAamp DNA Blood Midi Kit试剂盒、无水乙醇、Eppendorf Centrifuge 5810 R离心机、Grant SUB6水浴箱
2.操作步骤
⑴ 15ml离心管中依次加入，200ul Protease(蛋白酶)、2ml 抗凝全血、2.4ml Buffer AL。颠倒摇匀，剧烈震荡。
⑵ 70℃水浴10分钟。
⑶ 加2ml无水无醇，颠倒摇匀，剧烈震荡。
⑷ 转移上述溶液一半到分离管(QIAamp Midi Spin Column)上层，3000rpm常温离心3分钟。弃去分离管下层液体，尽量转移剩余溶液到分离管上层，3000rpm室温离心3分钟。
⑸ 加入2ml Buffer AW1到分离管上层，4000rpm室温离心2分钟。弃去分离管下层液体，加入2ml Buffer AW2到分离管上层，4000rpm室温离心20分钟。转移分离管上层到收集管中（过程注意检查管底部是否沾有液体，如有请先尽量甩干）。
⑹ 加入600ul Buffer AE 室温孵育不少于10分钟，4000rpm室温离心2分钟。分装收集管下层DNA溶液到EP管中，4℃保存不超过5天，待进行质量检测。
3.注意事项
⑴ QIAGEN Protease为干粉状，使用前应先用5.5毫升无菌注射用水溶解，溶解后就保存于4℃冰箱，不超过七天。
⑵ Buffer AW1使用前应加入125毫升无水乙醇稀释。
⑶ Buffer AW2使用前应加入150毫升无水乙醇稀释。
⑷ 本实验所使用的加样枪头、1.5毫升EP管均应前作高压消毒处理。
3.2全血基因组DNA检测
1.仪器与试剂
Buffer AE(QIAamp DNA Blood Midi Kit试剂盒)、Thermo NanoDrop 1000微量分光光度计
2.操作步骤
⑴ 启动Thermo NanoDrop 1000，按提示加2微升Buffer AE于检测基座上并放下样本臂进行自检，然后用吸水级拭去样本残留。
⑵ 再次加2微升Buffer AE于检测基座上并放下样本臂进行调零(Blank) ，然后用吸水级拭去样本残留。
⑶ 加2微升DNA样本于检测基座上并放下样本臂进行检测(Measure)，然后用吸水级拭去样本残留，并记录样本浓度(ng/μL)。各标本依次进行此操作。
3.3 DNA分装方案
⑴ 需要收集的患者信息：患者编号（或病历号）、年龄、性别、籍贯、身份证号码、临床诊断、诊断时间、病区、标本类型（DNA）、份数、体积、浓度、提取时间、抽血时间。
⑵ DNA总量约550μl用二维码冻存管（500μl规格）进行分装，分5管，每管110μl，最后剩余部分加入第5管。
⑶ 冻存管管身标记“患者编号+D+分管号”，例如123D-1，表示123号患者DNA标本第1管。
⑷ 分装后冻存管放入冻存盒，并在冻存盒上标记“日期+DNA+盒号”。
⑸ 通过冰盒转运至生物资源库入库-80℃储存。
⑹ 患者的相关信息以电子版excel表形式与DNA标本一起送至生物资源库入档保存。
第4章 资料收集及数据维护
4.1资料收集
在标本入库完成之后，进一步与医院HIS系统关联，完善如下信息：
1.标本信息：标本类型、份数、浓度、取材部位、取材时间、处理时间、存储容器、储存位置等
2.患者信息：姓名、性别、年龄、受教育程度、职业、身高、体重、病案号、身份证号、家族史等
3.诊断信息：临床诊断、病理诊断、疾病分期、诊断时间等
4.治疗情况等
4.2数据维护
每个月定期对标本相关信息进行更新维护：
1.随访信息：末次随访时间、疾病进展、复发转移、死亡日期、死亡原因等
2.标本的出库、使用情况：出库次数、出库时间、参与课题、使用人等
3.标本的质控信息

第5章 标本的使用管理
5.1申请
向生物资源库提交标本使用申请单，详细填写如下内容：
⑴ 所申请标本的病种、类型、数量及其他要求；
⑵ 实验方案的可行性分析，样本量的估算；
⑶ 支撑该课题的基金项目类型和编号。
5.2审批
⑴ 标本使用者提出申请，并经所在科室主任或学科带头人审批；
⑵生物资源库工作人员根据申请者的需求信息在标本管理系统中检索，初步审核申请单；
⑶ 生物资源库主任审阅并备案。
5.3出库
申请单通过审批之后，根据样本的申请单查询样本位置并取用（对于冰冻样本，取用时的速度是非常重要的。最好两个人来操作。取出的样本尽量在冰盒上操作。贮存在液氮温度下的样本，必须用镊子取用，避免样本与手接触，以防止其温度升高）。
5.4反馈
申请者在取得标本之后1个月内，在实验完成之后向生物资源库反馈标本的使用情况，尤其是样本的质量及意见和建议；文章发表后请在致谢中提及并把文章复印件送至生物资源库备案。

第6章 质量控制
6.1人员的培训与考核
⒈ 所有新进人员须经过病理科、生物资源库等相关的专业培训并通过考核才能上岗。
⒉ 所有人员每年参加一次国内外生物资源库前沿技术的学习与培训，提高理论水平和实际工作能力。
6.2设备和样本的空间安全
⒈ 建立环境安全系统,包括设备监控、报警系统和应急措施。
⑴ 温度：为延长制冷设备使用寿命，样本库的外围环境温度应不超过22℃。
⑵ 通风：必须保证良好的通风以防止过于潮湿及冷凝。在氧含量低或者有害气体产生的区域内安装气体监测装置（O2 和CO2监测器）和排气系统。
⑶ 照明：①由白炽灯散发的热能会导致贮存物融化，推荐荧光灯或者其他不产生热量的灯作为冷冻物质使用的光源。②在断电的情况下，应急照明是至关重要的。应急照明可用来指示逃生路线，为设备的监测和应对紧急情况提供有光照的安全环境。③备有便携式照明设备（如手电筒）作为聚焦光源，以备在设备的检修中使用。
⒈ 所有贮存设备的日常温度监测
⑴ 对设备温度的每天早晚各检查1次，并详细记录检查结果。每月汇总查看温度的记录情况，以从中发现设备故障和性能衰退的迹象。
⑵ 保证设备的温控系统与移动终端连接（短信、电话）的畅通，如有异常，工作人员需立即排查。
6.3数据信息的安全
⑴ 对标本库管理系统的用户的权限进行分级管理，普通用户只有浏览、查询功能，只有管理人员才有录入、修改、统计等高级权限。
⑵ 定期对数据库进行的维护，更新标本出库与废除的信息，并填写详细的维护日记。维护之后对数据库进行备份。
6.4标本的质量控制
⑴取材标本部位准确性
由专业技术人员判断，确保肿瘤组织、瘤旁组织和切缘远端非肿瘤组织的区分。取材时应注意肿瘤组织的数目、大小、形态、颜色、硬度，明确区分肿瘤组织与非肿瘤组织，保证取材质量。不能确定的组织进行病理切片观察，肿瘤成分应不低于75%，如不足65% 则应加以标识。
⑵ 标本的质量控制
　控制标本在离体时间30min内完成处理。同时，避免肿瘤组织与对照组织相互污染，避免标本与标本相互污染，避免基因组DNA、RNA和蛋白的降解。
⑶ 标本的控制与抽查
　定期随机抽查标本的质量，提取基因组DNA、RNA和蛋白来检测标本的浓度和纯度。做好相关实验记录，并追溯该标本的收集、处理、储存的流程，找出导致标本降解的可能原因。