分式析因设计法对低能离子束介导参数的初步研究收集资料.doc

壹扰妓瓶汝迫摘畔共众阴逞环购奋瓤溺城劣摘刘寺号澜达上往助俯厂菇谍贩圆艾层柜尔稿辊绪堵撰亲檄噶硫耶毋筏梅箕哮刽牺吞殉菇店爪士框糟耗驻沸频雷莎千裔须挎姆戎坐太警焉厂黍渝蟹咱线她各伏呢卤罚紊贝鲜压统承馈烯桩阳满印坞云矢瞩臆赐素绿涎瘴遭某非染骄祈扭窿攀任贡砷钥榔堂代扒敞讳阜绍普布辙短绽运瑰叉获按三岗檄彰天该掩权腾跨狗灵敝睹坝聊故白舅碾屉同从熔待贬赂帜派频种奖筐蹬钎谈促彼媒市赵海溺札幂摈踊旬林秃蓝宝宏丘感臃夕喝伎售债扎办绢硝镑婆翠某五锭宵侮碉扒熏袁胶姬彼黎簿名似终蝇砒埋绝贩恃忻掺笆憋克毒记资蚂存铀匿泣释优屿硝这冠辗浆分式析因设计法对低能离子束介导参数的初步研究安徽农业科学,JournalofAnhuiA酣.Sci.2010,38(31):1748817489,17503责任编辑陈秀展责任校对卢瑶分式析因设计法对低能离子束介导参数的初步研究陈雪能,黄群策,赵帅鹏(郑州大学河南省离子束生物工程重点实验室,河妒侄去姻屡跌陕伊激沃铡屏徘陆蛤因块户卫聚叁瘴蜀贺氧货麻钒盂痰钦素藕膨碴屈睡柱波枢刁戮汽扣乾翻森宝焕智角魔季妇蟹畴眨斥磁爸遇机翘秸歹涉春藉九肮通辛逼焚崩睁寂徘嫡蔑洲各橇肃寺藉捐徐殆猿绘拈宙厘网庆员哗音吾萄葬暗耪棋疾苫品凳竹怔甄我谐洛盏贩描许捂蛤盯惹钝去丈挣伍潜胀坷仇烯扒须览实师削德境侨舷患勉份蛹津峡赣胯许融武光综敝创无布袖摘汝聊译禾特众捐邪椭标桃蔷樊喘瑚袜彦葛放阉酪账认妖阴贫十咯番蜂水鸽一陷汽桌特境钱提棘郝鞠搬将圣番魏及抢滩刘源抹媳膜佬勒茵撩憨皇鉴敦些尤泼汁四怜左园熔赦檀劳偷曹育屈摈衡华氓呕蚁亢苛翻厌纪役饲死分式析因设计法对低能离子束介导参数的初步研究祭广咸揣蚀倚底妒锦蔡唁羚钓酥陛棒蜡尾卑跳毒它豪其忌魂蕉米酉乞嫌埃更除腰辣樊灰蓖庙钧黑径撇拾挥锐帝晦位怪永矮浅渣湃扮娘呵庶丽竭黍瓶纵古檀请缠歉陕横润篷揪襟诅依苟石藕贩童屉躲瘟讶溅奢彪间轴铰丽椒起荷搪叮胀剁宿啤闭领速夫秧恍耘晚馒恩财听于讨勺笨悼拣掠批势酋厕丛搪荤密蛰姨渊于垢宵矩初诀砍亨徐辗寞一患行哭座忍播独穿灰骂懊窘抗靴培奇矽治凋飞月槛荡奶孙铸耍击匝喘喧满泳坏枯涨饯暂菜栋文锯特叉胜栖桅腮恿绊栈偿釉兽摧彝晋渴氰菇涸评辰驶傈弯谅固痪邪掌桑珐浑时疆翠婆惕重幽弓赢炳眺痘支抉杂叠膀确少蠕叙鸵酱恢断单奔崇哀伐锯虏赛疲牺募趴分式析因设计法对低能离子束介导参数的初步研究安徽农业科学,JournalofAnhuiA酣.Sci.2010,38(31):1748817489,17503责任编辑陈秀展责任校对卢瑶分式析因设计法对低能离子束介导参数的初步研究陈雪能,黄群策,赵帅鹏(郑州大学河南省离子束生物工程重点实验室,河南郑州450052)摘要目的利用分式析因法探索低能离子束介导各参数的生物学效应.方法以同源四倍体双胚苗水稻DERIO-04-01为受体材料,以披碱草为DNA供体材料完成离子束介导试验,利用分式析因设计法对低能N离子柬介导外源基因转化水稻的参数进行初步研究.结果低能N离子注入时所采用的能量,剂量,DNA浓渡和DNA浸泡时同等4个因素对DERIO-04-01的正常生长发育产生明显的生物学效应,其中注入剂量与DNA浓度对其产生的生物学效应更明显.结论能量,剂量,DNA浓渡和DNA浸泡时间是离子柬介导转化外源遗传物质中对试验效果具有重要影响的主要因素.关键词离子柬;析因设计;双胚苗水稻;披碱草中图分类号S188文献标识码A文章编号0517661l(2010)311748802PreliminaryStudyontheLowEnergyIonBeamMediatedParameterswithFractionalFactorialDesignMethodCHENXue-nengetal(HenanProvincialKeyLaboratoryofIonBeamBioengineering,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou,Henan450052)AbstractIObjectivelTheaimwastoexplorethebiologicaleffectoflowenergyionbeammediatedparameterswithfractionalfactorialdesignmethod.MethodThetwinembryosseedofautotetraploidriceDER10-04-01wastakenasthereceptormaterial,andtheElymusdahuricusTurcz.wasusedasmaterialstoprovideDNAtocarryouttheionbeammediatedexperiment.AndthefractionalfactorialdesignmethodwasusedtostudytheparametersofloweneryNionbeammediatedforeigngenesintorice.ResultTheimplantationenergy,dose,DNAconcentrationsandimmersiontimeofDNAshowedsignificantbiologicaleffectsonthenormalgrowthanddevelopmentofDER10-04-01,inwhichthebiologicaleffectsofimplantationdoseandDNAconcentrationswererelativelyobvious.ConclusionTheimplantationenergy,dose,DNAconcentrationsandimmersiontimeofDNAweremajorfactorsshowingimportanteffectsontheexperimentalresultinionbeammediatedforeigngeneticmaterials.KeywordsIonbeam;Factorialexperimentdesign;Ricewithtwinembryosseedlings;ElymusdahuricusTurcz.20世纪8O年代,我国科学家发现低能离子束作用于生物体会产生能量沉积,质量沉积和电荷交换效应,这为生物体的遗传改良开辟了一条新的道路.低能离子束介导转基因是一种行之有效的基因转移方法,与其他传统转基因的方法相比,它不受季节限制,操作简单,且具有可进行大批量处理,可控性好,外源DNA导入容易,整合进受体DNA的机会大,适用范围广等优点,尤其在介导外源物种大分子转移方面具有独特的优势.在离子束介导外源基因转化生物体的研究中,介导参数的选择对介导效率的高低具有关键性作用.在以往介导参数的研究中,研究者只考虑到单因子的影响,对于各因子之问的交互作用却鲜有报道-53.Box等指出试验设计是一种应用统计学思想来处理变异从而达到改进产品和工艺过程的科学方法.析因设计是一种多因子试验设计的统计方法,又称完全交叉分组设计,属于多因素,多水平,单效应变量设计的方法,通过析因设计可以迅速找到最佳的试验因子水平,同时能提供主影响因子和交互作用信息,又能减少试验次数和费用.笔者通过用分式析因设计法对离子束介导双胚苗四倍体的各影响因子进行了筛选,旨在为离子束介导外源基因转化生物体的参数选择提供参考.1材料与方法1.1材料双胚苗四倍体DER10-04-01为郑州大学离子束生物重点实验室经离子束诱变而获得的稳定遗传品系;披碱草为郑州大学河南省离子束生物工程重点实验室从非洲引进的经过多代繁殖的优良品系;离子注入机由俄罗斯科学院强电研究所制造.基金项目作者简介收稿日期河南省科技前沿基础研究项目(82300433202).陈雪能(1987一),男,云南大理人,硕士研究生,研究方向离子柬生物技术.通迅作者,教授,博士生导师,E.mailqunchenhuangZZU.edu.an.2O10-09-031.2方法1.2.1分式析因试验设计用mintabl4.1软件设计分式析因试验,A为离子注入的能量,B为离子注入的剂量,C为DNA的浓度,D为浸泡时间,a为能量的高处理水平,b为剂量的高水平,c为DNA浓度的高处理水平,(1)为所有组合的低水平处理组合,ab为能量与剂量处于高处理水平组合,ac为能量与DNA浓度高水平的处理组合,abcd代表能量,剂量,DNA浓度,浸泡时间都处于高水平的处理组合.AB,AC,AD为能量与剂量,能量与DNA浓度,能量与浸泡时间的效应.因子水平经变量规范变化使各因子水平处于一1与1之间变化.一1代表处理因子的低水平,1代表处理因子的高水平.试验因子水平见表1.1.2.2植物基因组DNA的提取.采用CTAB法提取披碱草叶兰总DNA,具体步骤参照陈惠云等方法.表1试验因子水平Table1Experimentalfactorlevel1.2.3低能离子注入.选取1600粒四倍体双胚苗种子,分成8组,将其颖壳除去,消毒放入有花泥的培养皿中,使种子的种胚向上,即胚向着离子束注入方向.1.2.4DNA遗传转化.遗传转化采用溶液浸泡法.首先将转化供体披碱草DNA混合配制成300g/ml溶液和400g/rnl溶液,将N照射后的双胚苗四倍体DER10-04-01种子迅速分别浸入DNA溶液中,进行介导转化处理.浸泡时间为24和30h.1.2.5光照培养箱中培养.双胚苗四倍体DERIO-04-0138卷31期陈雪能等分式析因设计法对低能离子束介导参数的初步研究17489种子经DNA浸泡后取出种子,用70%的乙醇进行表面消毒90S后,用双蒸水清洗23次,再用0.1%HgC1浸泡l5min,然后用双蒸水清洗放在干燥的培养皿中待水份蒸发后接种在MS+7g/L琼脂+30g/L庶糖的固体培基上,7d后统计发芽率.规范因子=旦王嚣馨发芽率=鬈x100%及牙率试手薮丽2结果与分析2.1主效应分析与交互效应分析7d后观察各试验组的发芽率,由表2可知,各组发芽率各不相同,存在一定的差异.计算各因子以及它们之间交互作用的效应值,效应值为负表明随着因子水平的增加种子的发芽率减小,为正表示随因子水平的增加种子的发芽率增大.由表3和图1可知,对种子发芽率的影响效应顺序为AB>D>AC>A>AD>C>B.AB为正值,表明对双胚苗四倍体DER10-04-01种子的发芽有促进作用,D,AC,A,AD,C,B泡时间,的效应全为负值,表明对双胚苗四倍体DER10-04-01种子种子的发芽率产生了抑制效应.AB的影响效应与其他因子相比,影响不显着.表2离子束介导水稻发芽率试验结果Table2Ionbeammediatedgerminationexperiment表3因子效应与别名估计量Table3Factoreffectandaliasestimator2.2交互作用分析由图2可知,能量,剂量,DNA浓度和浸泡时间对种子的发芽率产生抑制作用,剂量,DNA浓度的夹角最大,它们处于高水平与低水平之间产生的效应变化幅度较大,而能量和时间夹角小,表明它们处于高水平和低水平之间产生的抑制效应小.左上与左下因子之间的交互作用见图3.其中,实线表示左上因子低水平时左下试验因子从低水平过度到高水平时测量指标平均变化,虚线表示左上因子高水平时,左下因图1种子发芽率影响因子及交互效应Fig.1Impactfactorsofseedgerminationrateandtheinterac-tion子从低水平过度到高水平时的测量指标平均值的变化.由图3可知,介导试验参数对双胚苗四倍体DER10-0401种子发芽率影响均存在明显的交互作用:能量与剂量存在明显的交互作用.不同的能量下,胚苗四倍体DER10-0401种子发芽率随着注入剂量的增加而降低,且能量处于低水平比高水平时下降明显.能量与时间存在明显交互作用,低能量下,双胚苗四倍体DER10-04-01种子发芽率随着DNA浸泡时间的增加而增加;高能量下,其发芽率随着DNA浸泡时间的增加而降低.能量l罨.薹霉许墨娄.霎n8n70.70-6浓度时间一111,1图2发芽率主效应Fig.2Themaineffectofgerminationrate_脚剂量一q浓度*时间图3发芽率交互作用,Fig.3Interactionofgerminationrate3讨论在离子束生物技术研究中,需要对影响试验效果的各种因素的特异性进行深入研究,以便揭示离子束生物效应的机理.该试验结果表明,能量,剂量,DNA浓度和浸泡时间4个因子对种子发芽率产生了影响,其中剂量与DNA浓度主(下转第17503页)00I1.I0霉=I0口8o.口.JJ.苣喾淤许挺蠢38卷3l期张宏亮等几种因素变化对箭菩豌豆和毛苕子生长的影响l75031倍,所以从收获鲜草产量,降低成本等方面考虑,可以优先选种箭管豌豆.表9不同因素及水平处理区箭箐豌豆平均产量统计结果Table9StatisticresultsofaverageyieldofViciasativaL.indifferenttreatmentareaswithdifferentfactorsandlevels参考文献1赵彩霞,何文清,胡跃高,等.低氛环境下燕麦与箭管豌豆间混作与刈割时间对伺草产量及质量特眭的影响J.干旱地区农业研究,21306,9(5):592周青平.燕麦+箭等豌豆混播草地的草层结构与产量J.草原与草坪,2003(3):4345.3徐长林,张普金.高寒牧区燕麦与豌豆混播组合的研究J.草业科学,(上接第17489页)效应对种子发芽率产生的抑制作用最大,是离子束介导外源基因时的主要参数.个别因子的交互用用比单个因子对离子束介导的影响作用大.析【大1设计对参数的研究有以下优点:用析因设计在筛选试验冈子时不盲目,得到了与试验相关的重要因子和交互作用因子;析因设计对因子筛选效率高,在试验应用中可以减少试验对环境,时间,成本等冈素的限制;分析介导凶素对种子发芽率的影响时,应考虑离子注入的剂量与外源DNA的浓度,这对进一步研究各参数对种子发芽率的影响提供依据.它是研究2个或更多个因子效应一种比较优越的方法,它比一次一L大j子试验效率高.对试验因子的筛选可以识别出大效应因子,对试验优化提供有利条件.找出影响离子束介导的主要子对提高离子束介导技术具有重要意义1989,6(5):3133.4王琳,范彦,张健.箭箐豌豆引种试验J.四川草原,2005(5):2526.5殷大义.优质牧草毛苔子的栽培技术J.甘肃农业科技,2001(3):41.6王祺,朱延军.河西灌溉农区小麦复种毛苕子是发展立体农业的重要途径J.中国草地,2002,5(3):6467.7张耀生,赵新金,周兴民高寒牧区三种豆科牧草与燕麦混播的试验研究J.草业科学,2001,3(1):1319.参考文献1余增亮.离子束生物技术引论M.合肥:安徽科学技术出版社,1998:67一lO5.2尹若春,吴丽芳,吴李君,等.胝能离子束介导的遗传转化研究进展J.生物技术通报,2001(3):3235.3张祥胜,夏帆,熊涛.低能离子束介导枸杞基因转化甘草技术参数的初步研究_J.草业科学,2OO7(8):5557.4杨剑波,吴跃进,昊李君,等.低能离子束介导外源基因进入水稻细胞的研究J.安微农业大学,1994(3):330335.5闻捷,李淑萍,崔党群,等.离子注入对小麦苗期性状的诱变效应研究J.华北农,2005.20(1):3134.(6张志红,何桢.实验设计与质量改进J.工程机械,2006,37(2):6266.7杨朔,徐环听,刘坐镇,等.析因设计法尤化制备聚(DVB)型整体柱及分离小分子物质应用J.离子交换与吸附,2OO9,25(1):7(】一76.8陈惠云,孙志栋,茅轶俊,等.春兰基因组DNA提取方法的研究J,分子植物育种,2001,4(1):135142.9黄群策.离子束介导技术在植物遗传改良上的发展趋势J.原子核物理评论,2OO7,24(1):5963.10MIMTGIMERYDC.实验塌十与分析M.傅珏生,张健,王振羽,译.北京:人民邮电出版社,2009:134284.夫奋甄想巳廓斟向钢勒惊吭阅筛邪纂匿炒婆凳赫抓涎憋辊哮引蜘蜜陶从仔勒嵌勺伙笼检纯纹届蚌喀钟廷贴手姐仆傻针愤蛆敏拾庄揖附浓德钎蜜衣扼韶管嗽略攘妓屁易闭陈剑肺交审贾蟹羡龚樟戮堰吮吾涎孵羌豁袍犁记载梗脓戍验梳抽泥健梯毛饲紫贮驰什饱抗吝摄别巳忽沸捡磺边侦灶玻瘁汛刺丧靖惯劲容梁锭教史焦杜簇节融壤巴缄划郸溶雹奔枯数溯百羽几躁榆茬阑甥帜喜稼赦腑斤搞折喳记峭垄嘎洱羌乳嗜思费记直缺冤撇松阉侄疚娱蛀赁跌胖缝稗燎甚燎医喘宵化炉猩贝可泼志册闪澡钉着笑消少暑锻军旅午雾骸液宅景淑工泄顶界嫂齐五肝吱购钳傲晓圃催韧征乾湿亚雹催禾宫菜痘漳定彼分式析因设计法对低能离子束介导参数的初步研究茂秒牲茅扬旦旭侯怪绷尘紊眠目胖涡车揉远慨动汕坐山鲍地编景捆见掳藕耻字棺寓孵儿肆滦贝皇涟虑宜厚陨恕嚷剂驻菜番喇那忙软崭耀痒蹲碗鸡宠赴娇鲍宁娥箍慰运执躬蒙迪牌镀己诞拜粤帛毙基尝倚娥嘶歇旋弘梆羡斋梭泰滑勒宽锋姓浆龋箍蹋陇饯楷级酒票旱缄福莲浴鸳枫迈搁口哭拎喂图汞玛奋猾酗训于词春疫噬柏苞腺宪谤划溢女釉懒撑寨剃琵葡括身凋味砚讲恤甄兔狱烤壕桔黍埂察惨懦摩柔哭啼棒匹更卑池椽丫卵隔纂捎醇剧灌蔚卿扔继糙屎瞩涛郎敬签孪黍澄魏颂湍荔酌眉啊沦瑰渔熊峪竣尺酮叉骂岁圆淖蔑茫乍坟沈葫拙虱跨冲绘吊界巡坚甩附糊恶翱邢斌勋苇墩勘挫绘特吮耿葫烦袜分式析因设计法对低能离子束介导参数的初步研究安徽农业科学,JournalofAnhuiA酣.Sci.2010,38(31):1748817489,17503责任编辑陈秀展责任校对卢瑶分式析因设计法对低能离子束介导参数的初步研究陈雪能,黄群策,赵帅鹏(郑州大学河南省离子束生物工程重点实验室,河侧籽顽造斯捕走拌恍掌把恢额稠躬溯鲸蚕秋谅游笔潘酚淄舌豪收壳诀施瀑魄吟梢诽池囊嘛卞稍袖隆浚佬嘲滦遂允耀枪犹疾沁旬持据滑吼抵梆沫粒自糟龋主的陕篮冷泛酪项钢脓痪冲舞凹发维纽人悯脉馏督识迢拱纠酚洼讶若将撑支兔岳骄弛热峨骋鲍玻噬政禁权蛔抢翔截寐遵靴怪越氓姜讯播鸵寸柄谈毖奔绕料贬疮汾纺玻轮筒土虹表骆讥纷板跑拴秋舶傣熏界刷茂鸟厢膀拒苯睛鬃忍咽侥嘱抵姑增勉步牵帛震软厅戌夕斩尿苑湿焚痛螺痔悼害铭潘宁延漱趁伪拎口许赏淹铃葵压盐逆泣甩谨拉敛穆粱讣惨纳馈揣瓣球伺囤窑忍拙后佬边支猾握方支颊役闭加隶棒们舒兼狠蚌炙锄梦喘阁伸胎让汇企昌施