乳腺癌早期筛查和诊断生物标志物研究进展_梁有沣.pdf

梁有沣 等/乳腺癌早期筛查和诊断生物标志物研究进展 Chinese Journal of Biotechnology http:/ Apr.25,2023,39(4):1425-1444 DOI:10.13345/j.cjb.220699 2023 Chin J Biotech,All rights reserved 资助项目：中央高校基本科研业务费(buctrc201910)；2021 年新疆科协青年人才托举工程项目；京津冀基础研究合作专项19JCZDJC65800(Z)；新疆生产建设兵团重点领域科技攻关计划项目(2022AB022)This work was supported by the Fundamental Research Funds for the Central Universities,China(buctrc201910),the Young Elite Scientists Sponsorship Program by Xinjiang Association for Science and Technology,China(2021),the Beijing-Tianjin-Hebei Basic Research Cooperation Special Project(19JCZDJC65800(Z),and the Scientific and Technological Research Project of Xinjiang Production and Construction Corps,China(2022AB022).*Corresponding author.Tel:[phone],E-mail: Received:2022-09-01;Accepted:2023-01-26 1425 生物工程学报 乳腺癌早期筛查和诊断生物标志物研究进展 梁有沣1，郝明炫1，郭蕊1，李小宁1，李永超1,2，喻长远1，杨昭1,2*1 北京化工大学生命科学与技术学院 分子诊断技术创新研究中心，北京 100029 2 塔里木大学生命科学与技术学院 新疆生产建设兵团塔里木盆地生物资源保护利用重点实验室，新疆 阿拉尔 843300 梁有沣,郝明炫,郭蕊,李小宁,李永超,喻长远,杨昭.乳腺癌早期筛查和诊断生物标志物研究进展J.生物工程学报,2023,39(4):1425-1444.LIANG Youfeng,HAO Mingxuan,GUO Rui,LI Xiaoning,LI Yongchao,YU Changyuan,YANG Zhao.Biomarkers for early screening and diagnosis of breast cancer:a reviewJ.Chinese Journal of Biotechnology,2023,39(4):1425-1444.摘 要：2020年全球乳腺癌(breast cancer,BC)新发病例达 226万例，占全部肿瘤新发病例的 11.7%，是全世界发病率最高的癌症。早期发现、早期诊断和早期治疗是降低乳腺癌死亡率及改善预后的关键。尽管乳房 X 光筛查被广泛用作乳腺癌筛查的工具，但其假阳性、辐射性和过度诊断仍是亟待解决的问题。因此，亟需开发易于获取且稳定可靠的生物标志物，用于乳腺癌无创筛查和诊断。近年来多项研究显示来自乳腺癌患者血液中的循环肿瘤细胞 DNA(circulating tumor cell DNA,ctDNA)、癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA)、糖类抗原 15-3(carbohydrate antigen 15-3,CA15-3)、细胞外囊泡(extracellular vesicles,EV)、循环 miRNA 和 BRCA 基因突变等生物标志物，以及来自人体尿液、呼出气体(volatile organic compounds,VOCs)和乳头吸出液(nipple aspirate fluid,NAF)中的磷脂、miRNA、苯乙酮和十六烷等多种生物标志物与乳腺癌早期筛查和诊断密切相关。本文综述了上述生物标志物在乳腺癌早期筛查和诊断中的应用。关键词：乳腺癌；生物标志物；早期筛查；诊断；无创 综 述 ISSN 1000-3061 CN 11-1998/Q 生物工程学报 Chin J Biotech http:/ 1426 Biomarkers for early screening and diagnosis of breast cancer:a review LIANG Youfeng1,HAO Mingxuan1,GUO Rui1,LI Xiaoning1,LI Yongchao1,2,YU Changyuan1,YANG Zhao1,2*1 Innovation Center of Molecular Diagnostics,College of Life Science and Technology,Beijing University of Chemical Technology,Beijing 100029,China 2 Key Laboratory of Protection and Utilization of Biological Resources in Tarim Basin of Xinjiang Production and Construction Corps,College of Life Science and Technology,Tarim University,Alar 843300,Xinjiang,China Abstract:The estimated new cases of breast cancer(BC)patients were 2.26 million in 2020,which accounted for 11.7%of all cancer patients,making it the most prevalent cancer worldwide.Early detection,diagnosis and treatment are crucial to reduce the mortality,and improve the prognosis of BC patients.Despite the widespread use of mammography screening as a tool for BC screening,the false positive,radiation,and overdiagnosis are still pressing issues that need to be addressed.Therefore,it is urgent to develop accessible,stable,and reliable biomarkers for non-invasive screening and diagnosis of BC.Recent studies indicated that the circulating tumor cell DNA(ctDNA),carcinoembryonic antigen(CEA),carbohydrate antigen 15-3(CA15-3),extracellular vesicles(EV),circulating miRNAs and BRCA gene from blood,and the phospholipid,miRNAs,hypnone and hexadecane from urine,nipple aspirate fluid(NAF)and volatile organic compounds(VOCs)in exhaled gas were closely related to the early screening and diagnosis of BC.This review summarizes the advances of the above biomarkers in the early screening and diagnosis of BC.Keywords:breast cancer;biomarkers;early screening;diagnosis;noninvasiveness 乳腺癌是一种由乳房腺上皮组织发生恶性增生而引发的肿瘤疾病，目前已取代肺癌成为全世界发病率最高的癌症1。据 2020 年临床医师癌症杂志(CA：A Cancer Journal for Clinicians)的全球癌症统计报告2，当年全球女性乳腺癌新发病例 226.141 9 万例，死亡病例68.499 6 万例，分别占女性癌症新发和死亡总数的 24.5%和 15.5%。其标化发病率和死亡率分别为 4.78/万和 1.36/万，074 岁累计发病和死亡风险分别为 5.20%和 1.49%。同年 Cao 等3统计指出，我国女性乳腺癌发病率为 5.90/万，居全国女性恶性肿瘤发病谱首位(约占中国女性癌症新发病例总数的 19.9%)；死亡率为1.66/万，居全国女性恶性肿瘤死亡谱第 4 位，严重威胁了女性的生理、心理和生命健康。癌症统计报告显示4：诊断为早期乳腺癌患者的相对生存率远高于诊断为晚期乳腺癌患者的相对生存率。诊断为 0 期和 I 期乳腺癌患者的 5 年生存率接近 100%，期为 93%，期为 72%。由于乳腺癌的一级预防尚无良策，因此早期发现、早期诊断和早期治疗是降低乳腺癌死亡率及改善预后的关键。当前，乳腺癌临床诊断的常用方法有组织病理学诊断和影像学诊断。组织病理学诊断是乳腺癌诊断的“金标准”，其病理检查报告通常作为疾病确诊的最终参考。但其获取乳腺组织 梁有沣 等/乳腺癌早期筛查和诊断生物标志物研究进展 ：010-64807509： 1427 样本时需要对检查者的身体进行穿刺，会给检查者的身体和心理带来双重负担。影像学诊断包括 B 超、X 光和核磁共振成像(magnetic resonance imaging,MRI)。其中 B 超检查简单便捷、对检查者的辐射量小，但由于其诊断表现与乳腺癌的病理分型相关，所以对早期乳腺癌的诊断准确率很差。乳房 X 光检查是当前乳腺癌筛查的首选方法，但其存在着对致密型乳腺诊断准确率差的缺点。MRI 对人类组织的成像效果很好，临床上常作为 B 超和乳房 X 光检查的补充方法，因其检查费用昂贵不适用于大范围的早期筛查。因此，亟需开发一种诊断准确率高的无创性乳腺癌诊断方法。肿瘤生物标志物是指由肿瘤组织或宿主与肿瘤相互作用所产生的一类活性物质，常常存在于血清、细胞、尿液、体液或组织中并能够提示肿瘤存在与生长变化。理想的肿瘤生物标志物应当同时满足 3 个基本要求5，即分析有效性(analytical validity)、临床有效性(clinical validity)和临床可用性(clinical utility)。具体而言，分析有效性要求标志物具备一定的准确性、灵敏度、特异性和稳健度。临床有效性要求标志物可以检测出疾病状态和预测结局。临床可用性要求，与未使用该标志物相比，使用该标志物可以改善患者的结局(在癌症诊断、治疗、管理或预防方面有统计学意义的改善)。随着科技的进步和发展，肿瘤生物标志物已在肿瘤筛查和诊断中发挥重要作用。在已发现的乳腺癌肿瘤生物标志物中糖类抗原 15-3(carbohydrate antigen 15-3,CA15-3)和癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA)主要应用于转移性乳腺癌患者的病程检测6，具有较高的应用价值，但同时也存在着诊断灵敏度低和特异性差等缺点。对此，已有许多研究工作致力于在开发出一种新型无创的乳腺癌生物标志物，并将其应用于乳腺癌的早期筛查和诊断，以期降低人群中的乳腺癌死亡率。本文将从无创性肿瘤生物标志物(按血液、尿液、呼出气体和乳头吸出液 4 种来源划分)在乳腺癌早期筛查和诊断研究领域作一综述。1 乳腺癌 乳腺癌的组织学表现形式是大量的幼稚化的癌细胞无限增殖和无序状拥挤成团，挤压并侵蚀破坏周围的正常组织，破坏乳房的正常组织结构7。在乳腺癌发病初期，腺上皮细胞在多种致癌因子(如雌二醇 E2 和或孕激素 P4 等)的共同作用下，会发生基因突变，致使细胞增生失控，由于癌细胞的生物行为发生了改变，呈现出无序、无限制的恶性增生8。传统的乳腺癌诊断筛查方法有 B 超、X 光和 MRI。乳房 B 超检查具有无创、便捷、价格低廉和辐射性低的优点，是妊娠或哺乳期女性检查乳腺癌的首选方法。它显示病灶形态时不受致密型乳腺的影响，且彩色多普勒血流分析对乳腺肿瘤的良、恶性区分很精确。但 B 超的诊断表现受乳腺癌的病理分型影响很大，还对检查医师的专业素质要求很高，复查时难以获得准确的对比图像，对病灶的诊断定性往往不如乳房 X 光的重现性好9。乳房 X 光检查应用最为广泛，是乳腺疾病筛查和诊断的首选方法，对钙化型乳腺癌的显示能力很强，被证明能有效降低乳腺癌的死亡率和改善预后。但它对致密型乳腺和乳腺癌微小病变分辨不清容易漏诊，此外还会给检查者带来辐射和过度诊断的危害，其过度诊断的估计范围为 0%至 40%50%10。MRI 对人类组织的成像显影效果极佳、诊断灵敏度和准确率较高，且能对 B 超和乳房 X 光检查不能确定的乳腺病灶提供诊断依据。在乳腺小 ISSN 1000-3061 CN 11-1998/Q 生物工程学报 Chin J Biotech http:/ 1428 病灶、多病灶和多中心性癌灶以及乳腺深层癌灶方面的诊断和评价上具有优势。但它也存在着检查成本高、操作复杂和假阳性高的缺点。2 血液 在乳腺癌早期诊断方面，血液检测相较于乳房 X 光检查和组织活检具有检测成本低、便捷无创和易于大规模筛查等优点，能够在乳腺癌的早期检测中发挥重要作用。此外，癌细胞通常会将其产生的特异性核酸、蛋白质或细胞囊泡等排入到人体血液中，因而分析血液中上述成分的存在可能提供一种检测癌症的方法。下文将围绕血液来源的肿瘤生物标志物展开，包括循环肿瘤细胞 DNA(circulating tumor cell DNA,ctDNA)、CEA、CA15-3、细胞外囊泡(extracellular vesicles,EV)、循环 miRNA 和乳腺癌易感基因(breast susceptibility gene,BRCA)突变等(图 1)。2.1 循环肿瘤细胞 DNA 循环肿瘤细胞 DNA(circulating tumor cell DNA,ctDNA)是由肿瘤细胞凋亡、坏死或分泌产生的 DNA片段，分类上归属于循环游离 DNA(circulating free DNA,cfDNA)，可从人体外周血中获得11。通常，ctDNA 包含有与起源肿瘤细胞一致的基因突变，如点突变重排和扩增，因而是潜在的疾病诊断生物标志物，有可能作为肿瘤组织切片的补充诊断手段12。ctDNA 可用于检测 40%70%的癌症，包括乳腺癌、脑肿瘤、结直肠癌和黑色素瘤等13。Yang 等14发现早期癌症患者的 ctDNA 浓度(0.77 ng/L)明显低于晚期癌症患者的 ctDNA浓度(1.52 ng/L)(P=0.014 9)，且 ctDNA 浓度随癌症分期增加而增加。图 1 血液、尿液、呼出气体和乳头吸出液等来源的生物标志物 Figure 1 Biomarkers derived from blood,urine,exhaled gas and nipple aspirate fluid.梁有沣 等/乳腺癌早期筛查和诊断生物标志物研究进展 ：010-64807509： 1429 1977 年，美国的 Leon 等15随机抽取了32 名乳腺癌患者和 55 名健康对照者的外周血液并对其 ctDNA 水平进行检测，发现乳腺癌症患者血清 ctDNA 浓度平均值(38 ng/mL)比健康对照者血清 ctDNA 浓度的平均值(7 ng/mL)高。同样地，Huang 等16于 2006 年发现乳腺癌患者的血清 DNA 浓度(65 ng/mL)要比健康对照组的血清 DNA 浓度(13 ng/mL)高，且实时荧光定量PCR(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)的检测灵敏度为 93.4%。2019年，Zhang 等17研究对比了 102 名早期乳腺癌患者和 50 名良性乳腺肿瘤患者的血液 ctDNA表达水平，发现将 ctDNA 与相应的乳腺影像报告和数据系统(breast imaging reporting and data system,BI-RADS)评分相结合时，其对乳腺癌诊断的阳性预测值为 92.4%、灵敏度为 74.2%、特异性为 92.0%，AUC=0.821。以上研究结果证明了 ctDNA 在乳腺癌筛查诊断中的潜力。Olsson 等18回顾性分析了多项有关乳腺癌患者血浆 ctDNA 表达情况的研究，并从中发现 93%发生转移的患者在临床检测前 3 年内显示出肿瘤特异性 ctDNA 的证据。相反，在长期无病生存期患者中未检测到 ctDNA。同样，Coombes 等19在一项研究分析中指出，检测乳腺癌患者血浆 ctDNA水平能够在 89%的复发患者中平均提前 8.9 个月检测到复发。以上研究结果在一定程度上展示出了 ctDNA可作为一种生物标志物用于乳腺癌的早期筛查的潜力。综上所述，虽 ctDNA 在乳腺癌的诊断工作中具有一定的分析有效性(灵敏度和特异性良好)，但是其临床有效性(不能预测患者结局)和临床可用性(对改善患者结局的作用有限)均存在明显的不足。因此，循环肿瘤 DNA 作为一种乳腺癌早期筛查的生物标志物时作用有限，但在乳腺癌的转移和复发检测方面有一定作用。相 比 于 癌 蛋 白 和 循 环 肿 瘤 细 胞(circulating tumor cells,CTCs)，ctDNA 具有以下优点：一是检测乳腺癌转移和复发的灵敏度高20；二是检测动态范围广、特异性强，能指示出肿瘤的异质性特征21；三是识别相对早期癌症的能力强22。2.2 癌胚抗原 CEA 癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA)是一种由正常的胎儿肠道组织和上皮肿瘤产生并参与细胞黏附的糖蛋白，于 1965 年首次被确定为结肠癌抗原23。分子生物学上，CEA描述为来自 32 个基因家族的糖蛋白，能在各种组织中表达。通常，健康成人血浆中 CEA水平非常低(20 g/L)，如乳腺癌、肺癌、胰腺癌和结直肠癌等，是重要的肿瘤生物标志物之一24。Cui等25统计分析了7 510名乳腺癌患者和39 650 名健康对照者的血清 CEA 水平，发现乳腺癌患者的血清 CEA 水平(平均值 2.17、中位数 1.67 和lgP=37.85)显著高于健康对照者的CEA 水平(平均值 1.78、中位数 1.55 和lgP=0.00)。上述研究结果在统计学上证明了 CEA 在乳腺癌患者和健康者中的表达水平不同。Mujagi 等26分别检测了 47 名乳腺癌患者(实验组 I)、40 名健康对照者(对照组 I)和 33 名其他类型的癌症患者(对照组)的平均循环CEA 水平。经过 t 检验和双向方差分析对数据进行分析处理，发现在乳腺癌患者的 CEA 循环水平显著高于健康女性(P0.000 1)和其他癌症患者(P0.007)，而其他癌症患者的血清 CEA 亦显著高于健康对照者(P0.01)。其中 CEA 在乳腺癌筛查诊断的灵敏度和特异性分别为 65.0%和 57.1%。此外，Jia 等27研究对比了 115 名早期乳腺癌患者和69名健康对照者的CEA表达水平，发现早期乳腺癌患者的血清 CEA 浓度为 ISSN 1000-3061 CN 11-1998/Q 生物工程学报 Chin J Biotech http:/ 1430(20.0318.15)ng/mL，健康对照者的血清 CEA浓度为(11.343.65)ng/mL(P0.000 1)，其诊断早期乳腺癌的灵敏度和特异性分别为 46.1%和 79.7%，AUC=0.620。多项研究证明，乳腺癌患者的CEA水平与健康女性之间存在差异2830，由于 CEA 是一种广谱肿瘤生物标志物，在某些良性肿瘤中的表达量也会升高，缺乏一定的分析有效性(特异性低)，故临床上不推荐作为乳腺癌的早期诊断的标志物，而通常将其作为疗效评价与术后监测转移和复发的指标。2.3 糖类抗原 15-3 糖类抗原 15-3(carbohydrate antigen 15-3,CA15-3)是 MUC1 基因的产物，MUC1 基因存在于几乎所有上皮细胞中，其高表达通常与结肠癌、乳腺癌、卵巢癌、肺癌和胰腺癌有关31。CA15-3 在正常人血清中含量低于 30 U/mL32。由于 CA15-3 具有细胞黏附和细胞间相互作用的特性，所以细胞表面 MUC1 表达的增加往往伴随着癌细胞的侵袭和转移。此外，它对乳腺癌的特异性高于 CEA 和组织多肽抗原(tissue polypeptide antigen,TPA)，因而在乳腺癌早期发现和诊断具有极其重要的作用。Bayo 等33研究对比了 63 名早期乳腺癌患者和 63 名健康对照者的 CA15-3 表达水平，发现早期乳腺癌患者的血清 CA15-3 浓度为 19.74 U/mL，显著高于健康对照者的 16.19 U/mL，其诊断早期乳腺癌的灵敏度和特异性分别为 85.7%和83.3%。在 Fu 等34的一项研究中，对 1 179 例乳腺癌患者和 493 名健康对照者进行了回顾性分析，指出血清中的 CA15-3 是乳腺癌的潜在生物标志物。他们通过分析发现 CA15-3 和CEA 水平与乳腺癌对恶性肿瘤的易感性有显著关联(CA15-3:SMD=2.15,95%CI:2.002.30,P=1.8108)，而 CA15-3 水平与乳腺癌对良性肿 瘤 的 易 感 性 之 间 没 有 显 著 关 联(CA15-3:SMD=0.17,95%CI:0.210.38,P=0.382)。马玲等35对 60 名乳腺癌患者和 40 名健康对照者的血清 CA15-3 水平进行了检测，发现乳腺癌患者的血清 CA15-3 水平(28.684.53)U/mL高于健康对照组的血清 CA15-3 水平(21.35 2.88)U/mL，且差异具有统计学意义(P0.05)。其对乳腺癌的灵敏度和特异性分别为 88.3%和85.0%(P0.001)，AUC 曲线下面积为 0.910。在另一项研究中，Ali 等36抽取了 30 名原发性乳腺癌患者和 20 名健康对照者的血清，随后使用酶联免疫吸附试验检测血清中的 CA15-3，结果发现乳腺癌患者的平均 CA15-3 水平(79.15 27.54)U/mL 明 显 高 于 健 康 对 照 组 的平均CA15-3 水平(24.3411.68)U/mL(P0.05)，对乳腺癌的检测灵敏度为 93.3%，特异性为 96.6%。在临床上，CA15-3 在乳腺癌患者术前的预后评估、术后的病情监测和疗效评估等方面应用价值更高。当同时与其他指标或影像学检测联合诊断时，才可用于鉴别诊断乳腺癌。从肿瘤生物标志物的 3 个基本要求考虑，限制其应用在早期乳腺癌诊断的原因为，一是分析有效性差：CA15-3 缺乏足够的灵敏度和特异性，对早期乳腺癌的阳性率低，而对晚期乳腺癌和转移性乳腺癌的阳性率较高。MUC1 几乎在所有上皮细胞中表达，故 CA15-3 水平的升高并不仅仅与乳腺癌有关；二是临床有效性低：CA15-3 的水平升高除了与肿瘤发生、发展相关外，还受到生理状态、良性疾病、炎症、检测因素等多种因素影响，容易出现“假阳性”结果。2.4 细胞外囊泡 细胞外囊泡(extracellular vesicles,EV)是一种携带有各种蛋白质、脂质、核酸(RNA和DNA)和代谢物的由细胞释放的囊泡37，为一类脂质膜封闭的亚细胞结构38。EV 通常分为 3 大类39：从细胞凋亡经历细胞中释放为泡泡的凋亡体 梁有沣 等/乳腺癌早期筛查和诊断生物标志物研究进展 ：010-64807509： 1431(直径 1 m)，来自内体和多泡体与质膜融合的外泌体(直径 10200 nm)，以及通过质膜向外萌芽和裂变产生的微囊泡(直径 30300 nm)。不同类别的囊泡通过不同的机制释放40，外泌体通过 Rab27a/b 通路通过多泡体的胞吐作用释放，而凋亡体和微囊泡则由质膜的浸出释放。细胞外囊泡特别是外泌体是细胞间通讯的重要介质，在生理学上，EV 有助于体内平衡并促进宿主防御机制，包括止血和炎症37；而在病理学中，癌细胞分泌的 EV 量远高于健康细胞，在癌症患者的血浆以及肿瘤细胞培养物中可检测到更多数量的 EV41，可见 EV 有潜力成为各种癌症的筛查和诊断标志物4244。分析 EV 中包含的癌症相关内容可以帮助诊断乳腺癌，特别是已知肿瘤来源的 EV 携带致癌 miRNA，它们可以通过分析血液中循环的EV-miRNA 的表达水平用于诊断早期癌症45。多项研究结果表明：从乳腺癌患者血浆中分离得到的 EV 中存在多种不同的肿瘤生物标志物，如局灶性黏附激酶(focal adhesion kinase,FAK)、表皮生长因子受体蛋白46、凋亡抑制基因47等。因此，分析 EV 中含有的生物标志物可以帮助乳腺癌早期诊断，并将乳腺癌与良性和非癌性疾病区分开来。Kim 等45从癌症基因组图谱(the cancer genome atlas,TCGA)数据库中选择了 7 种来自EV 的 miRNA 用于验证肿瘤衍生的 EV(tumor-derived EV,TDE)中 miRNA 的表达水平，样本来自 55 名早期乳腺癌患者和 20 名健康对照者。发现其中的 4 种 miRNA(miR-9,miR-16,miR-21 和 miR-429)的表达水平在早期乳腺癌患者中显著升高。这 4 种 miRNA 的组合用于乳腺癌早期诊断具有高灵敏度(96.8%)和特异性(80.0%)，AUC=0.880(95%CI:0.780.99)，优于目前的诊断方法，具备一定的分析有效性。其中，miR-16 在区分乳腺癌患者和健康对照者方面具有最佳的鉴别能力，AUC=0.850(95%CI:0.770.94)，其次是miR-21(AUC,0.700;95%CI:0.560.82)，miR-9(AUC,0.710:95%CI:0.59 0.82)和 miR-429(AUC,0.710:95%CI:0.600.83)。与直接暴露在血清中的 miRNA 相比，EV中所含的 miRNA 在血浆中的半衰期更长，因为EV 的脂质膜保护 miRNA 免受核糖核酸酶降解。此外，TDE 及其内含物对癌细胞具有高度特异性，因为它们反映了起源的特征。因此，基于 miRNA 表达模式分析，含 miRNA 的 EV被提出作为癌症诊断的理想来源。另一方面，与传统的组织活检相比，EV 具有侵入性较小，可检测早期无症状癌症的优势。综上所述，细胞外囊泡有助于提高癌症诊断准确性和辅助指导后续治疗决策，但也存在着预测患者结局(临床有效性)和改善患者治疗(临床可用性)方面的不足。2.5 循环 miRNA miRNA(microRNA)是一类长度为 2030个核糖核苷酸的短链非编码 RNA，具有控制蛋白质翻译和/或影响信使 RNA(mRNA)稳定性的能力48。在细胞存活、分化、衰老、凋亡、致癌和转移等方面中起着至关重要的作用。Shimomur 等49从国家癌症中心随机抽取了 1 280 名乳腺癌患者(实验组 I)、2 836 名非癌症对照者(对照组 I)、451 名其他类型的癌症患者(对照组)和 63 名非乳腺良性疾病患者(对照组)的血清样品，使用高灵敏度的微阵列分析全面评估了血清 miRNA 表达谱。在对比乳腺癌和非乳腺癌患者中的 miRNA 表达后发现：特定的 5 个 miRNA 的组合(miR-1246,miR-1307-3p,miR-4634,miR-6861-5p 和 miR-6875-5p)用于检测乳腺癌效果最好。该组合在实验组 I 中诊断的灵敏度为 97.3%，特异性为 82.9%，准确 ISSN 1000-3061 CN 11-1998/Q 生物工程学报 Chin J Biotech http:/ 1432 性为 89.7%。此外，该组合可以检测早期乳腺癌(对 Tis 的灵敏度为 98.0%)。Zou 等50-51亦发现由几种不同的 miRNA 构成的特定集合可以用于乳腺癌的早期诊断。因为乳腺癌具有高度异质性，对不同分期的miRNA 表达谱也有所不同52。Yu 等53使用RT-qPCR 研究了来自 113 名早期乳腺癌患者和 47名健康对照者血清样本中 miRNA 的表达水平，发现 miR-21-3p、miR-21-5p 和 miR-99a-5p 这 3 种miRNA 的组合具有最佳的辅助诊断效果，其诊断早期乳腺癌的灵敏度和特异性分别为 97.9%和73.5%，AUC=0.895。此外，Kim 等45开发了一个用于检测早期乳腺癌的 miRNA 组合(miR-9,miR-16,miR-21 和 miR-429)，其具有高灵敏度(96.8%)和特异性(80.0%)，AUC=0.880。Agelaki等54评估了参与肿瘤休眠的 miR-23b 和 miR-190，参与晚期转移的 miR-21 以及参与上皮细胞-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)的miR-200b 和 miR-200c 等在早期和晚期转移性乳腺癌患者的血浆中表达。并从辅助或一线治疗前分别从 84 名早期乳腺癌患者和 57 名转移性乳腺癌患者中获取血浆样本，用 RT-qPCR 评估上述 5 种 miRNA 的表达水平，根据中位值将表达分为高或低。与早期乳腺癌患者相比，miR-21(AUC=0.772;P0.001),miR-23b(AUC=0.625;P=0.012),miR-200b(AUC=0.744;P0.001)和 miR-200c(AUC=0.668;P=0.001)更高，而 miR-190(AUC=0.629;P=0.013)较低，可以区分早期乳腺癌患者和晚期转移性乳腺癌患者，具有一定的临床有效性。综上所述，miRNA在乳腺癌的诊断工作中具有相当的分析有效性、临床有效性和临床可用性。研究发现表明，许多 miRNA 能够特异性地调节乳腺癌干细胞(breast cancer stem cells,BCSC)的靶基因表达和信号通路54。它们在乳腺癌细胞的自我更新、生长和转移中起着重要的作用，可作为肿瘤发展、转移和对治疗反应的潜在诊断标志物。例如，miR-24-3p 和 miR-125b-5p 均被确定为早期发现55，预后56或预测复发的潜在乳腺癌生物标志物57-58。因此，差异表达的循环 miRNA 组合是乳腺癌早期检测的潜在生物标志物。2.6 BRCA1/2 突变 乳 腺 癌 易 感 基 因(breast cancer susceptibility gene 1,BRCA1)和乳腺癌易感基因2(breast cancer susceptibility gene 2,BRCA2)是一种抑癌基因，在调节人体细胞的复制、遗传物质 DNA 损伤修复、细胞的正常生长方面有重要作用。当其突变或表观遗传失活时将导致BRCA1/2 表达降低，乳腺分化受损，进而使患乳腺癌风险增加。2019 年，Deng 等59研究对比了 2 769 名乳腺癌患者血液 DNA 中的 BRCA1/2 突变水平，发现乳腺癌患者的 BRCA1、BRCA2 和 PALB2突变率很低，分别为 2.7%(n=74)、2.7%(n=76)和 0.9%(n=24)。上述研究表明，乳腺癌与BRCA1/2 突变无强关联性，BRCA 突变用于乳腺癌早期诊断意义不大。2016 年，Yao 等60研究对比了 1 816 名乳腺癌患者和 5 549 名对应患者家族亲属的血液 BRCA1/2 突变水平，在前者中鉴定出 125 例 BRCA1/2 致病突变，在后者中鉴定出 206 例乳腺癌。患者家族亲属的 BRCA1突变携带者、BRCA2 突变携带者和非携带者的乳腺癌发病率分别为 11.0%、12.7%和 3.2%。研究表明 BRCA1/2 突变携带者的患者家族亲属患乳腺癌的风险显著高于非携带者的亲属，可用于高风险病人的查找。BRCA1 突变携带者与非携带者，风险比(RR)=3.77,95%CI;2.346.09,P0.001；BRCA2 突变携带者与非携带者，RR=4.42,95%CI:2.707.25,P0.001。同样，美 梁有沣 等/乳腺癌早期筛查和诊断生物标志物研究进展 ：010-64807509： 1433 国国立综合癌症网络(National Comprehensive Cancer Network,NCCN)不推荐对普通人群进行BRCA 突变检测，仅建议 BRCA 突变检测用于识别患乳腺癌的高风险人群(乳腺癌患者家族亲属)，并进一步帮助其主动预防疾病的发生。对乳腺癌患者而言，BRCA1/2 基因突变检测诸多优点：可以帮助阳性患者选择适宜的手术治疗方案(更倾向于选择乳腺全切，而不是保留乳房)，指导其选择疗效更好的化疗药物(铂类药物)和预后监测复发(复查部位不仅局限于乳腺，还应包括卵巢及输卵管)。2018 年，Lancet 刊发了 Copson 等61的一项研究，追踪随访了 15 年 2 733 名乳腺癌患者血液 DNA 中的 BRCA1/2 突变水平，发现共有338 例(12%)患者检测出 BRCA 突变，BRCA 阳性和 BRCA 阴性患者的 5 年和 10 年总生存期均无统计学意义差异(5 年：83.8%vs.85.0%;10 年：73.4%vs.70.1%;P=0.76)，上述结果表明乳腺癌基因并不会增加患者死亡率。因此，BRCA 突变检测或存在局限性，即对于检测出 BRCA 突变的年轻女性而言，需要谨慎考虑是否有必要进行预防性手术切乳(无论答案如何，都将给检测者带来一定的心理负担或生理创伤)。3 尿液 除血液来源的生物标志物外，乳腺癌患者尿液、呼出气体和乳头吸出液来源的生物标志物也被发现具有乳腺癌早期诊断的潜力(图 1)。人体尿液是常规医学检测中最为便捷的生物液体之一。多项研究表明，尿液含有乳腺癌筛查的潜在生物标志物，其分析手段涵盖了代谢组学分析、蛋白质组学分析和外泌体分析等6264。Mistry 等65使用代谢组学分析的手段成功在乳腺癌组织中观察到磷脂代谢增加，特别是磷脂酰胆碱(phosphatidylcholine,PC)、磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine,PE)或其他前体分子。此外，Moreau 等66从分子机制上证明了野生型 BRCA1 等位基因的缺失会导致乳腺癌细胞中的脂质产量增加。Kim 等67从 3 组不同类别的患者(健康对照组和乳腺癌患者手术前后)中提取尿磷脂(urinary phospholipids,UPLs)，然后对其进行 nLC-ESI-MS-MS 分析。结果发现：乳腺癌患者尿液样本的 PC 和 PE 的总浓度比健康对照组分别增加了 44.0%和 71.0%。以上研究均证明了检测尿液中磷脂含量有助于早期乳腺癌的早期筛查。2015 年，Erbes 等68发现构建特定的尿液miRNA 谱(miR-21、miR-125b、miR-155 和 miR-451)可以将乳腺癌患者与健康对照组分开，其诊断早期乳腺癌的灵敏度和特异性分别为 83.3%、87.5%(P0.001)，AUC=0.887。Hirschfeld 等69研究探讨了