HPLC法同时测定诃子和毛诃子中没食子酸及鞣花酸的含量Δ.docx

HPLC法同时测定诃子和毛诃子中没食子酸及鞣花酸的含量Δ

西藏藏医学院附属医院西藏拉萨850000
【摘要】目的：采用高效液相色谱法测定诃子和毛诃子中没食子酸及鞣花酸的含量。方法：采用InertsustainC18-5µm（4.6×250mm）色谱柱，以甲醇-0.2%磷酸溶液为流动相梯度洗脱，流速1.0mL/min，柱温30℃，检测波长273nm。结果：没食子酸和鞣花酸分别在各自进样量范围内与峰面积呈良好线性关系，相关系数均在0.9993以上；各成分的平均回收率均在99.92~100.29%（n=6），RSD均小于0.67%。结论：该方法快速、准确、简便可用诃子和毛诃子中没食子酸及鞣花酸的含量测定。
【关键词】高效液相色谱法；诃子和毛诃子；没食子酸；鞣花酸；含量测定
诃子和毛诃子均收载于《中华人民共和国药典》2015年版一部，其中诃子的基原植物为使君子科植物诃子TerminaliachebulaRetz.和绒毛诃子TerminaliachebulaRetz.var.tomentellaKurt.的干燥成熟果实，而毛诃子的基原植物为使君子科植物毗黎勒Terminaliabellirica（Gaertn.）Roxb.的干燥成熟果实，为藏、蒙医常用药，但均无相关的含量测定项[1-3]。现代化学成分研究表明，诃子和毛诃子中主要含有鞣质类、酚酸类脂肪酸类等多种结构类型[4，5]。本文旨在建立HPLC法同时测定诃子和毛诃子中没食子酸及鞣花酸的含量，为建立诃子和毛诃子药材的质量标准提供一定的科学依据。
1仪器与材料
1.1仪器：岛津LC-20AT高效液相色谱仪，SIL-20A自动进样器，SPA-20A检测器，CTO-20AC柱温箱（SHIMADAZU公司，日本）；mettlertoledo分析天平（梅特勒-托利多仪器上海有限公司），ohaus分析天平（奥豪斯，美国）。
1.2试药：诃子和毛诃子药材成熟果实：西藏藏医学院附属医院；没食子酸对照品（上海麦克林生化科技有限公司，批号c10076412，纯度>99%）；鞣花酸对照品（上海麦克林生化科技有限公司，批号c10085228，纯度>98%）；Milli-Q超纯水（密理博，美国）；甲醇为色谱纯，磷酸（色谱纯，阿拉丁）。
2实验方法与结果
2.1色谱条件与系统适用性试验：色谱柱：岛津C18（4.6×250mm，5um）；流动相：甲醇（A，0.2%磷酸溶液）–水（B，0.2%磷酸溶液），梯度洗脱（0~7min，6%A；7~8min，6%~55%A；8~25min，55%A）；流速：1.0mL/min；检测波长：273nm；柱温：30℃；进样量10μL。在上述色谱条件下进行测定，标准品和待测溶液中GA的理论塔板数均大于6000，能达到检测要求；分离度均大于1.25，各成分基线分离很好。
2.2对照品溶液的制备
精密称取没食子酸对照品2.93mg和鞣花酸对照品1.52mg，置于10mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，作为对照品贮备液（每1mL含没食子酸293.00μg和鞣花酸152.00μg）。
2.3供试品溶液的制备
分别取诃子和毛诃子粉末（过三号筛）约0.1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入30%、40%、50%、60%和70%甲醇50mL，称定重量，加热回流90℃，1h，放冷，再称定重量，分别用相应的甲醇浓度补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，用0.45μm微孔滤膜滤过，即得供试品溶液，平行3次。
2.4线性关系考察
分别精密吸取“22”项下的对照品储备液0.05、0.1、0.25、0.5、1.0、2.0mL，依次置于5mL容量瓶中，加甲醇溶液稀释并定容到刻度，摇匀，连同储备液共得到7份浓度的系列标准曲线溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，以对照品浓度为横坐标（x），峰面积为纵坐标（y），绘制标准曲线，得到回归方程。没食子酸：y=38018x+10779（r2=0.9995，n=7），线性范围2.93~293.00μg·mL-1；鞣花酸：y=47530x–5020.2（r2=0.9993，n=7），线性范围1.52~152.00μg·mL-1。结果表明，没食子酸和鞣花酸分别在在0.2930~2.9300μg和0.1520~1.5200μg范围内呈现良好的线性关系。
2.5精密度试验
精密吸取“2.2”项下的对照品储备液，按“2.1”项下色谱条件连续进样测定6次，分别记录没食子酸和鞣花酸的峰面积，见表2。结果表明，没食子酸和鞣花酸峰面积的RSD分别为0.27%（n=6）和0.15%（n=6），表明仪器精密度良好。
2.6稳定性试验
精密吸取同一供试品溶液适量，按“2.1”项下色谱条件下分别于放置0、2、4、6、12、24、48h时进样测试，分别记录没食子酸和鞣花酸的峰面积。结果表明，没食子酸和鞣花酸峰面积的RSD分别为0.12%（n=7）和0.47%（n=7），表明供试品溶液在48h内很稳定。
2.7重复性试验
精密吸取同一批供试品粉末6份，按“2.3”项下方法制成供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，分别记录没食子酸和鞣花酸的峰面积。结果表明，没食子酸和鞣花酸峰面积的RSD分别为0.80%（n=7）和1.21%（n=6），表明该方法重复性良好。
2.8加样回收试验
精密吸取同一批诃子子粉末约50mg，6份，置于具塞锥形瓶中，分别加入800µL质量浓度分别为0.44mg·mL-1的没食子酸和0.76mg·mL-1的鞣花酸，按“2.3”项下方法制成供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，分别记录没食子酸和鞣花酸的峰面积。结果表明，该方法的没食子酸和鞣花酸平均加样回收率分别为10029%（RSD=0.67%，n=6）和99.92%（RSD=0.36%，n=6）。
2.9供试品溶液的测定
精密吸取“2.3”项下的供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，分别测定没食子酸和鞣花酸的峰面积，计算其各自的含量，结果见表1。
3讨论
诃子和毛诃子均收载于《中华人民共和国药典》2015年版一部，为藏医和蒙医常用药材，但均无相关的含量测定项。现代化学成分研究表明，鞣质和酚酸类化合物是诃子和毛诃子中的主要成分。本试验采用加热回流提取以甲醇作为提取溶剂，考察了不同甲醇体积分数（30%、40%、50%、60%和70%甲醇-水）对诃子和毛诃子中没食子酸及鞣花酸的浸出率影响。结果表明，毛诃子药材中没食子酸和鞣花酸的含量均高于诃子药材。
综上所述，本实验采用HPLC法测定诃子和毛诃子中没食子酸及鞣花酸，该方法操作简便、重复性好，可用于诃子和毛诃子中没食子酸及鞣花酸含量的测定。
参考文献：
[1]柳春霞，刘航.蒙药诃子药理作用研究进展[J].北方药学，2015，（1）：91-92.
[2]杨雁.诃子化学成分、生物活性及分析方法研究进展[J].西藏科技，2016，（9）：34-39.
[3]王舒.药用植物毛诃子研究进展[J].安徽农业科学，2015，43（5）：65-66.

-全文完-