生物分离技术层析技术省公共课一等奖全国赛课获奖课件.pptx

12.10层析技术层析技术u历史和概念u分类u惯用层析技术u薄层层析法u气相色谱技术u高效液相色谱技术u固相萃取技术第1页22.10.1历史和概念历史和概念层析层析Chromatography1903,Tsweett M.茨维特茨维特碳酸钙碳酸钙石油醚洗脱石油醚洗脱层析法，最早层析法，最早用于有色物质用于有色物质分离，所以也分离，所以也叫色谱法，色叫色谱法，色层法层法第2页3层析技术发展历程层析技术发展历程u1931年Kuhn等在氧化铝和碳酸钙柱上制备性分离了,-胡萝卜素u1941年，Martin和Synge采取水分饱和硅胶为固定相，以含有乙醇氯仿为流动相分离乙酰基氨基酸，建立了分配层析u1951年，Martin和James报道了用自动滴定仪作检测器分析脂肪酸，创建了气-液色谱法，促进了色谱理论形成u1958年，Golay首先提出了分离效能极高毛细管柱气相色谱法u1960年代，为了分离蛋白质、核酸等不易汽化大分子物质，科克兰、哈伯、荷瓦斯、莆黑斯、里普斯克等人开发了世界上第一台高效液相色谱仪，开启了高效液相色谱时代第3页4概念概念uu层析法层析法是利用混合物中各组分物理化学性质差异（如吸附力、分子形状及大小、分子亲和力、分配系数等），使各组分在两相（一相为固定，称为固定相；另一相为流过固定相气体或液体，称为流动相）中分布程度不一样，从而使各组分以不一样速度移动而到达分离目标。第4页5u固定相固定相：固定相是层析一个基质。它能够是固体物质（如吸附剂，凝胶，离子交换剂等），也能够是液体物质（如固定在硅胶或纤维素上溶液），这些基质能与待分离化合物进行可逆吸附，溶解，交换等作用。u流动相流动相：在层析过程中，推进固定相上待分离物质朝着一个方向移动液体、气体等，都称为流动相。柱层析中普通称为洗脱剂洗脱剂，薄层层析时称为展层剂展层剂。第5页6u吸附剂对有机物吸附作用有各种形式。比如以氧化铝作为固定相时，非极性或弱极性有机物只有范德华力与固定相作用，吸附较弱；极性有机物同固定相之间可能有偶极力或氢键作用，有时还有成盐作用。这些作用强度依次为：成盐作用成盐作用配位作用配位作用氢键作用氢键作用偶极作用偶极作用范德华力作用范德华力作用有机物极性越强，在氧化铝上吸附越强。第6页7第7页8第8页9石油醚石油醚环己烷环己烷四氯化碳四氯化碳苯苯氯仿氯仿乙醚乙醚乙酸乙酯乙酸乙酯丙酮丙酮吡啶吡啶乙醇乙醇甲醇甲醇水水乙酸乙酸各种展开剂对极性有机物溶解能力各种展开剂对极性有机物溶解能力对极性有机物溶解对极性有机物溶解对极性有机物溶解对极性有机物溶解能力增强能力增强能力增强能力增强第9页10依据层析分离机制柱层析薄层层析纸层析薄膜层析吸附层析吸附层析吸附层析吸附层析分配层析分配层析分配层析分配层析离子交换层析离子交换层析离子交换层析离子交换层析凝胶层析凝胶层析凝胶层析凝胶层析亲和层析亲和层析亲和层析亲和层析气相(气-液;气-固)层析液相(液-液;液-固)层析依据两相所处状态依据操作形式不一样2.10.2层析法分类层析法分类第10页112.10.3各种层析技术各种层析技术吸附层析吸附层析u吸附色谱利用固定相吸附中心对物质分子吸附能力差异实现对混合物分离，吸附色谱色谱过程是流动相分子与物质分子竞争固定相吸附中心过程。u主要吸附力：吸附能（化学吸附、物理吸附）u吸附剂吸附剂：惯用吸附剂有硅胶、氧化铝、活性炭、硅酸镁、聚酰胺、硅藻土等。u水分、粒度、吸附物分子大小、极性、特殊化学基团等对各种吸附剂吸附力有影响第11页12纤维素，淀粉纤维素，淀粉纤维素，淀粉纤维素，淀粉硅酸镁硅酸镁硅酸镁硅酸镁硫酸钙硫酸钙硫酸钙硫酸钙硅胶硅胶硅胶硅胶佛罗里硅土佛罗里硅土佛罗里硅土佛罗里硅土氧化镁氧化镁氧化镁氧化镁中性氧化铝中性氧化铝中性氧化铝中性氧化铝活性炭活性炭活性炭活性炭对极性有机物吸对极性有机物吸附作用增强附作用增强第12页13u对极性生物碱在硅胶上死吸附尤其严重，可采取哪些路径调整试验？第13页14吸附层析代表之一吸附层析代表之一活性炭层析活性炭层析u非极性吸附剂（C-C键为主体），普通用于纯化、分离普通用于纯化、分离水溶性物质水溶性物质（也可用于非极性和弱极性），如甙类、氨基酸类、糖类u前处理：普通先过筛，用稀盐酸洗涤，稀碱洗涤，其次用乙醇洗，再以水洗净，于120干燥45h后即可u颗粒活性炭or粉末活性炭？u作为非极性吸附剂，水溶液中吸附强，有机溶剂中吸附弱u活性炭内表面可高达1000m2/g硅胶600m2/g第14页15u研究认为，分子量在5003000是活性炭可能吸附范围，并随分子量增大，吸附容量减小芳香族化合物吸附力大于脂肪族化合物芳香族化合物吸附力大于脂肪族化合物芳香族化合物吸附力大于脂肪族化合物芳香族化合物吸附力大于脂肪族化合物对大分子化合物吸附力大于小分子化合物对大分子化合物吸附力大于小分子化合物对大分子化合物吸附力大于小分子化合物对大分子化合物吸附力大于小分子化合物在疏水性相当条件下，对极性基团多化合物吸附在疏水性相当条件下，对极性基团多化合物吸附在疏水性相当条件下，对极性基团多化合物吸附在疏水性相当条件下，对极性基团多化合物吸附强于极性基团少（与活性炭极性基团及表面水膜强于极性基团少（与活性炭极性基团及表面水膜强于极性基团少（与活性炭极性基团及表面水膜强于极性基团少（与活性炭极性基团及表面水膜相关）相关）相关）相关）第15页16第16页17第17页18u纤维活性炭新型高性能活性炭吸附材料u它是利用超细纤维如黏胶丝、酚醛纤维或腈纶纤维等制成毡状、绳状、布状等，经高温(1200K以上)炭化，用水蒸气活化后形成。u纤维活性炭表面积大，高达1700m2/g，密度小(515kg/m3)，微孔多而均匀，绝大多数为0.00150.0030m小孔和中孔，因而吸附容量大，吸附和脱附速率高，残留量少，使用寿命长.u吸附能力比普通活性炭高出110倍，尤其是对于一些恶臭物质吸附量比颗粒活性炭要高40倍左右。第18页19吸附层析代表之二吸附层析代表之二氧化铝柱层析氧化铝柱层析u酸性氧化铝pH约为44.5，用于分离羧酸、氨基酸等酸性物质；中性氧化铝pH值为7.5（仍属于碱性吸附剂范围），用于分离中性物质，应用最广；碱性氧化铝pH为910，用于分离生物碱、胺和其它碱性化合物分离生物碱、胺和其它碱性化合物等有独特优势。u醛、酮、酸、内酯等类型不易采取中性、碱性氧化铝分离u粒度：100160目第19页20u氧化铝吸附活性与含水量关系极大，普通在200左右加温46h活化，然后按照下表加入一定量水来定等级，层析用氧化铝通常为级。u氧化铝价格廉价，吸附量强于硅胶，对杂质吸附能力强于硅胶活性加入水量（%）0361015第20页21用氧化铝柱分离长春碱和长春新碱范例用氧化铝柱分离长春碱和长春新碱范例长春花碱(抗肿瘤药品)，英文vinblastine，用于何杰金氏病，淋巴细胞瘤，组织细胞淋巴瘤，组织细胞增生症X，晚期睾丸肿瘤，对其它化药品耐受绒癌及乳腺癌。长春花HerbaCatharanthirosei，别名别名：雁来红、日日新、日日春、天天开天天开，为夹竹桃科植物长春花Catharanthus roseus(L.)G.Don全草第21页22长春花总碱溶于甲醇长春花总碱溶于甲醇长春花总碱硫酸盐沉淀长春花总碱硫酸盐沉淀长春花总碱硫酸盐水溶液长春花总碱硫酸盐水溶液氯仿萃取长春花总碱氯仿萃取长春花总碱氯仿液用无水硫酸钠干燥后减压蒸干氯仿液用无水硫酸钠干燥后减压蒸干第22页23长春花总碱浸膏长春花总碱浸膏1g上上30g氧化铝柱（氧化铝柱（级级），柱内径），柱内径柱长柱长=110重蒸苯和氯仿混合溶液（比重重蒸苯和氯仿混合溶液（比重1.3）洗脱）洗脱分段搜集并采取氧化铝薄层色谱进行检测分段搜集并采取氧化铝薄层色谱进行检测合并相同流分，蒸干后溶于乙醇，制成硫酸盐析出结晶合并相同流分，蒸干后溶于乙醇，制成硫酸盐析出结晶长春碱和长春新碱在1%硫酸铈铵磷酸溶液下显紫红和灰蓝色氯仿-乙醚-石油醚(10:10:1v/v)为展层剂第23页24u通常所说硅胶层析之一为吸附硅胶层析，载体硅胶含有多孔性硅氧环（mSiO2nH2O）。u硅醇基显较弱酸性。u在甲醇和水中溶解度为在甲醇和水中溶解度为0.01%，pH大于大于9时溶解度急时溶解度急剧上升剧上升。吸附层析代表之三吸附层析代表之三硅胶层析硅胶层析第24页25u硅胶活化：110下烘干12h，其吸附性也伴随水分增加而降低，超出超出12%，吸附力极弱，不能用，吸附力极弱，不能用作吸附层析作吸附层析，只能作为分配层析载体。u硅胶能吸附极性、非极性，饱和、不饱和分子，含有吸附层析和分配层析双重特征。u硅胶是中性偏酸性颗粒，且制备中接触强酸，常带酸性，又是弱酸性阳离子交换剂。u前处理：检验水浸膏pH（不低于5），不然水洗至中性，110下烘干24h。特殊要求下需要经过6mol/L盐酸及氯仿等预洗。第25页26u干装和湿装u干装时，先在柱底塞上少许玻璃纤维，再加入一些细粒石英砂石英砂，然后将准备好吸附剂用漏斗慢慢加入干燥色谱柱中，边加入边敲击柱身，务必使吸附剂装填均匀，不能有空隙。吸附剂用量应是被分离混合物量3040倍，必要时可多达100倍。加够以后，在吸附剂上覆盖少许石英砂。u湿装时，将准备好吸附剂用适量展开剂调成可流动糊，如干装时一样准备好色谱柱，将吸附剂糊小心地慢慢加入柱中（提前放二分之一柱体积展开剂），加入时不停敲击柱身，务必使吸附剂装填均匀，不能有气泡和裂隙，还必须使吸附剂一直被展开剂覆盖。普通柱层析步骤普通柱层析步骤1）装柱装柱第26页272）洗柱）洗柱u干柱在使用前要洗柱，目标是排除吸附剂间隙中空气，使吸附剂填充密实。洗柱时从柱顶由滴液漏斗加入所选展开剂，适当放开柱下端旋塞。加入时先快加，再放慢滴加速度，使吸附剂一直被展开剂覆盖。洗柱时也要轻敲柱身，排出气泡。第27页283）上样和洗脱）上样和洗脱u上样也分为干法和湿法u干法为用比填料颗粒大干燥硅胶加入待上样溶液中，搅拌吸附样品后干燥成均匀粉末后上样u将待分离混合物用最小量洗脱液溶解，小心加入柱中。待混合物溶液液面靠近吸附剂上石英砂时，旋开滴液漏斗旋塞，滴加展开剂。滴加速度以12滴/秒为适度。整个过程中，应使展开剂一直覆盖吸附剂。第28页29正确选择层析柱，正确使用层析柱正确选择层析柱，正确使用层析柱第29页30第30页31第31页32第32页33吸附层析代表之四吸附层析代表之四大孔吸附树脂大孔吸附树脂u大孔吸附树脂是一个不含交换基团不含交换基团、含有大孔结构大孔结构高高分子吸附剂分子吸附剂，也是一个亲脂性物质，它能够有效从很低浓度溶液中吸附各种类型化合物（亲脂键、偶极离子、氢键等吸附方式，还有分子筛作用）。u装柱、上样、洗脱都比较简单，吸附量大，吸附速度快，选择性好，机械强度高，解吸附轻易。按基团极性可分为极性、非极性、中极性。u大孔吸附树脂代表：三菱大孔吸附树脂三菱大孔吸附树脂HP20；国产；国产D101大孔吸附树脂大孔吸附树脂第33页34CD180丙烯酸系丙烯酸系用于提取分离丁胺卡那霉素等氨基糖苷类半合成抗生素860021苯乙烯系苯乙烯系主要用于甜菊糖苷、人参皂苷提取精制，有机物分离LK-002脲醛系列脲醛系列主要用于银杏黄酮、山楂黄酮、大豆异黄酮等吸附提取LK-001乙烯吡啶乙烯吡啶主要用于甜菊糖甙等吸附提取DM131改进型树脂改进型树脂苯乙烯系苯乙烯系主要用于银杏黄酮、人参皂甙、茶多酚等物天然药提取和精制，含有吸附量大、二乙烯苯残留量低优点，符合FDA药用要求第34页35第35页36大孔吸附树脂应用举例大孔吸附树脂应用举例u氨基糖甙样品脱盐：氨基糖甙样品脱盐：将含盐氨基糖甙，经过大孔吸附将含盐氨基糖甙，经过大孔吸附树脂，氨基糖甙被吸附，而盐溶液快速经过树脂柱，树脂，氨基糖甙被吸附，而盐溶液快速经过树脂柱，去盐后可用去盐后可用(10-20)%含水醇或丙酮洗脱吸附物含水醇或丙酮洗脱吸附物u冬虫夏草有效成份吸附分离冬虫夏草有效成份吸附分离：H-103吸附树脂对核苷吸附树脂对核苷类化合物和芳香性氨基酸吸附，从而与糖类和非芳香类化合物和芳香性氨基酸吸附，从而与糖类和非芳香性氨基酸分离。性氨基酸分离。第36页37巯基纤维素巯基纤维素巯基棉纤维是将巯基巯基棉纤维是将巯基(HS-)连接在棉花大连接在棉花大分子链上而制成。分子链上而制成。巯基棉纤维对各种金属元素结合能力有着显著差异，巯基棉纤维对各种金属元素结合能力有着显著差异，其强弱次序基本上符合其强弱次序基本上符合软硬酸碱标准软硬酸碱标准第37页38uPt（）-Pd（）Au（）-Se（）Te（）As（）Hg（）-Ag（）Sb（）Bi（）Sn（）CH3HgIn（）-Pb（）Cd（）Zn（）u巯基棉对碱金属、碱土金属无亲和性（巯基棉对碱金属、碱土金属无亲和性（亲石元素亲石元素）；）；而对亲硫元素吸附性能好。各种亲硫金属成份可与较而对亲硫元素吸附性能好。各种亲硫金属成份可与较高浓度高浓度K、Na、Mg2、Ca2、Sr2、Fe3、Mn2、Cr3分离。分离。第38页39巯基纤维素应用举例巯基纤维素应用举例u化学发光测定水、血液和矿石中CouHg（）、Bi（）、Pb（）、Cu（）干扰Co化学发光测定，怎样去除？u在pH4条件下，让试液流过巯基棉，干扰离子被吸附，流出液可直接测定。第39页40还有哪些吸附材料？还有哪些吸附材料？u聚氨酯泡沫塑料聚氨酯泡沫塑料u纳米分离富集材料纳米分离富集材料u壳聚糖壳聚糖u磁微球磁微球u第40页412.10.4分配层析分配层析u分配色谱利用固定相与流动相之间对待分离组分溶解度差异来实现分离。分配色谱固定相普通为液相溶剂，依靠涂布、键合、吸附等伎俩分布于色谱柱或者担体表面。分配色谱过程本质上是组分分子在固定相和流动相之间不停到达溶解平衡过程。u吸附层析往往吸附过于强烈，分配层析则防止了这一缺点。u纸层析是以滤纸为惰性支持物分配层析。滤纸纤维上滤纸纤维上羟基含有亲水性，吸附一层水作为固定相羟基含有亲水性，吸附一层水作为固定相（12%20%水），有机溶剂为流动相。当有机相流经固定相时，物质在两相间不停分配而得到分离。第41页42分配层析之一分配层析之一纸层析纸层析影响纸层析几大原因：物质分子量物质极性物质电荷展开用溶剂种类温度展开方式使用滤纸种类其它第42页43上行法上行法第43页44下行法下行法第44页45滤纸选取对纸层析影响滤纸选取对纸层析影响型号标重(g/m2)厚度(mm)吸水性灰分(%)性能1900.17150-1200.08快速2900.16120-910.08中速3900.1590-600.08慢速41800.34151-1210.08快速51800.32120-910.08中速61800.3090-600.08慢速第45页46双向纸层析双向纸层析1、两相常为酸碱差异两相如乙酸乙酯、95%乙醇、6mol/LHCl（8：1：1V/V）为第一相，苯、丙酸、水（100：70：1V/V）为第二相；2、第一相展开后，取出挥发有机溶剂至干，然后可直接放入第二相中层析。举例：大豆异黄酮双向举例：大豆异黄酮双向纸层析分析方法研究纸层析分析方法研究第46页47薄层层析技术薄层层析技术一一一一、概述、概述、概述、概述薄层色谱法（薄层色谱法（ThinLayerChromatographyThinLayerChromatography，TLCTLC）是把吸附剂平铺在一个载体上成一薄层）是把吸附剂平铺在一个载体上成一薄层作固定相，以不一样溶剂作流动相，靠吸附剂毛作固定相，以不一样溶剂作流动相，靠吸附剂毛细现象，沿着一定方向移动，使样品中各组分，细现象，沿着一定方向移动，使样品中各组分，在薄层中吸附剂和展开剂之间，因为吸附与解吸在薄层中吸附剂和展开剂之间，因为吸附与解吸性质差异而得以相互分离。性质差异而得以相互分离。第47页48第48页49第49页50第50页51Cabinet喷雾抽气箱第51页52第52页53第53页54薄层层析优点薄层层析优点设备简单，操作方便设备简单，操作方便设备简单，操作方便设备简单，操作方便，消耗溶剂和吸附剂小，是，消耗溶剂和吸附剂小，是一个经济分离方法。一个经济分离方法。分离操作时间短。分离操作时间短。分离操作时间短。分离操作时间短。一个薄板展开只需十几分钟，一个薄板展开只需十几分钟，而且能够多个样品或不一样条件薄板同时展开，工而且能够多个样品或不一样条件薄板同时展开，工作效率高。作效率高。薄层制作技术简单薄层制作技术简单薄层制作技术简单薄层制作技术简单，依据试验要求能够方便更换，依据试验要求能够方便更换吸附剂和制成大小、厚度不一各种薄层。吸附剂和制成大小、厚度不一各种薄层。适应样品范围宽适应样品范围宽适应样品范围宽适应样品范围宽，从从ngng级微量检出到几十毫克制级微量检出到几十毫克制备量皆很轻易实现。样品性质从极性大到非极性化备量皆很轻易实现。样品性质从极性大到非极性化合物皆可适用。合物皆可适用。第54页55流动相更换方便流动相更换方便，各种多元混合溶剂皆可选作展开剂，比高效被相色谱法所能选取溶剂范围宽。可充分利用样品中各组分在多元混合溶剂中分配系数差异，实现高效率分离。一个普通TLC理论板数可到达几百块，有利于一些复杂样品分离。展开操作技术丰富多样展开操作技术丰富多样，如双向展开、圆形展开、屡次展开、旋转展开等，以适合用于各种复杂体系样品分离与制备。第55页56薄层色谱法缺点薄层色谱法缺点（1）试验重现性差。不一样试验室，不一样操作者，甚至同一操作者试验条件和结果极难完全重现，定量误差普通510。（2）试验条件和数据可比性较差。引发误差原因较多，如薄板制作技术不良引发薄层厚度不均一；薄板活化，贮放条件不严格引发板活度不规范；样品体系复杂等等，展开过程中展开剂组成改变也是影响展开结果原因之一。第56页57吸附剂选择吸附剂选择硅胶硅胶这是最惯用吸附剂，要求表面孔径在80100，粒度在2040m。硅胶硅胶H为不含粘合剂硅胶；硅胶硅胶G含13-15锻石膏(CaSO4.1/2H2O)；硅胶硅胶GF254是在硅胶中加入石膏和荧光指示剂，在波长为254nm紫外光激发下发出黄绿色荧光，有紫外吸收物质显色更清楚。0.5羧甲基纤维素羧甲基纤维素(CMC)第57页58u氧化铝应该注意氧化铝是一个含有催化活性吸附刑，有可能引发试样发生一些化学反应，如引发酯水解，醛酮酯水解，醛酮酯水解，醛酮酯水解，醛酮缩合，双键位置迁移，脱氯化氢，酮烯醇异构化缩合，双键位置迁移，脱氯化氢，酮烯醇异构化缩合，双键位置迁移，脱氯化氢，酮烯醇异构化缩合，双键位置迁移，脱氯化氢，酮烯醇异构化等。所以氧化铝薄板应用比硅胶板少。第58页59u聚酰胺（腈纶、尼龙）聚酰胺（腈纶、尼龙）把聚酰胺粉铺成薄层板，可用于分离易生成氢键极性化合物，如酚类（鞣质）、黄酮、酸类（核苷酸、氨基酸）、醇类、醛、酮等。第59页60uDNS-氨基酸双向聚酰胺薄膜层析氨基酸双向聚酰胺薄膜层析u第一向：苯第一向：苯-冰乙酸体系冰乙酸体系u第二向：甲酸第二向：甲酸-水体系水体系u显色：黄绿色荧光（显色：黄绿色荧光（DNS-氨基酸）氨基酸）第60页61u络合薄层络合薄层硝酸银薄层u主要机理是因为C=C键能与硝酸银形成络合物，而饱和C-C键则不与硝酸银络合。所以在硝酸银薄层上，化台物可因为饱和程度不一样而取得分离，如碳原子相近不饱和醇、酸；u饱和化合物因为吸附最弱而Rf最高，含一个双键较含两个双键Rf值高，含一个三键较含一个双键Rf值高。u顺式与硝酸银络合较反式易于进行，可用来分离顺反异构体。第61页62u薄层板制作：手工、半自动、全自动、直接购置取硅胶G10g加30ml0.5CMC-Na水溶液，调成均匀糊状物，铺层于空气中晾干后，移至110烘箱活化30min（1051h），置于燥器中备用（可铺可铺成成10cm20cm10cm20cm板板8 8块块）第62页63第63页64展开剂选择方法展开剂选择方法ABCABCDD四元体系四元体系第64页65uA组分组分通常为展开剂中极性小，百分比大，它对样品不溶或微溶，在展开剂中主要是对样品起“输送输送剂剂”作用。如单独使用，不能使样品斑点移动。uB组分组分极性比A组分大，能使样品中各组分充分溶解，在展开过程中起“分配剂分配剂”作用。uC组分组分极性介于A与B溶剂之间，是展开剂“极性调极性调整剂整剂”，使A和B能够互溶。第65页66uD组分是组分是为改进样品中一些极性尤其大组分在展开中斑点拖尾或在原点不动，而加入强极性溶剂，如酸、碱等。其作用主要是“薄板活性调整剂薄板活性调整剂”。在展开剂中，D组分占百分比较小，必须严格控制加入量准确性。第66页67点样与展开点样与展开u点样时要控制点样量和点样次数。点样时要控制点样量和点样次数。普通：分析时几普通：分析时几到几十到几十微克，制备时几到几十毫克几到几十毫克u点样时，（点样时，（1）样品溶液必须是均一体系，应防止将）样品溶液必须是均一体系，应防止将非均相混浊溶液点到纸或板上非均相混浊溶液点到纸或板上。（2）溶液浓度应在）溶液浓度应在1左右左右，太稀对加样体积增加，引发斑点扩散。（3）配制样品溶液溶剂尽可能选取易挥发、极性较）配制样品溶液溶剂尽可能选取易挥发、极性较小溶剂，小溶剂，样品溶液太稀时可分屡次加样。第67页68第68页69（1）展开装置应密闭；（2）保持展开槽内展开剂蒸气充分饱和，以消除“边缘边缘效应效应”边缘效应边缘效应(edgedffect)：点于同一薄层上同一物质斑点，在色谱展开过程中，靠近薄层边缘处斑点Rf值与中心区斑点Rf值有所不一样，此种现象称为边缘效应。第69页70薄层层析定位薄层层析定位对展开后薄板进行定性与定量分析前提是确认板上各组分色班或色带位置，通常称显色。惯用显色方法有紫外荧光法、蒸气显色法和化学显色法等。第70页71薄层色谱显色剂薄层色谱显色剂显色剂显色剂：有硫酸、碘氯仿溶液、碱性高锰酸钾溶液、磷钼酸有硫酸、碘氯仿溶液、碱性高锰酸钾溶液、磷钼酸等通用显色剂，等通用显色剂，也有依据化合物分类，或特殊官能团设计专属性显色剂。1碘蒸气对很多化合物显黄棕色。20.5碘氯仿溶液对很多化合物显黄棕色。3碘碘化钾溶液对很多化合物显黄棕色。碘0.2g，碘化钾0.4g，加水到100m1。45磷钼酸乙醇溶液喷后120烤，还原性物质（多羟基、烯烃、炔烃、醛类等）显蓝色，再用氨水熏，背景变为无色。第71页72第72页73u荧光薄层：u有些化合物本身无色，在紫外灯下也不显荧光或较弱，又无适当显色剂时u吸附剂中加入荧光物质制成荧光薄层进行层析，薄层板本身显荧光，样品斑点不显，但吸收紫外光形成暗斑。u254nm紫外光激发下显出荧光，如锰激化硅酸锌；365nm紫外光激发下发出荧光，如银激化硫化锌硫化镐第73页74薄层层析定性薄层层析定性薄层色谱分离后薄层色谱分离后薄层色谱分离后薄层色谱分离后定性分析最可靠方法定性分析最可靠方法定性分析最可靠方法定性分析最可靠方法还是将样还是将样还是将样还是将样品斑点从吸附剂上洗脱下来，除去溶剂后用有机波品斑点从吸附剂上洗脱下来，除去溶剂后用有机波品斑点从吸附剂上洗脱下来，除去溶剂后用有机波品斑点从吸附剂上洗脱下来，除去溶剂后用有机波谱分析法进行结构分析。谱分析法进行结构分析。谱分析法进行结构分析。谱分析法进行结构分析。第74页75薄层色谱定量分析薄层色谱定量分析u（1）溶剂洗脱）溶剂洗脱分光光度测定法，分光光度测定法，方法误差在5以内，已成为国内外许多工业产品质量控制标准化方法。u（2）在板上原位直接定量测定法）在板上原位直接定量测定法。即测定斑点面积法，误差较大，普通1015之间；或测定斑点光密度法，误差较小，普通510。第75页76薄层层析在天然药品化学中应用薄层层析在天然药品化学中应用u1证实两个天然化合物相同或同类；证实两个天然化合物相同或同类；u2测定混合物中组分数目；测定混合物中组分数目；u3决定适合用于柱层析分离用溶剂；决定适合用于柱层析分离用溶剂；u4监控柱层析、萃取等分离过程；监控柱层析、萃取等分离过程；u5监控一个反应进程。监控一个反应进程。第76页77应用举例：文字色料薄层色谱检验应用举例：文字色料薄层色谱检验u确定种类、判定成份以确定产地、销售范围u民事案件：伪造、变造文书第77页78圆珠笔油染料成份检验圆珠笔油染料成份检验不一样种类蓝色圆珠笔油样品薄层色谱图不一样种类蓝色圆珠笔油样品薄层色谱图不一样种类蓝色圆珠笔油样品薄层色谱图不一样种类蓝色圆珠笔油样品薄层色谱图正丁醇正丁醇-乙醇乙醇-水水-36%乙酸乙酸体系体系第78页79第四章惯用书写字迹色料薄层色谱分析第四章惯用书写字迹色料薄层色谱分析第一节薄层色谱分析法概述第二节对纯蓝墨水字迹薄层色谱分析第三节对蓝黑墨水字迹薄层色谱分析第四节对红墨水字迹薄层色谱分析第五节对黑墨水字迹薄层色谱分析第六节对碳素墨水字迹薄层色谱分析第七节对签字笔字迹薄层色谱分析第八节圆珠笔油墨薄层层析分析第九节黑色签字笔十年发展改变研究第十节黑色字迹与文件判定第79页80分配层析之分配层析之反相硅胶层析反相硅胶层析u所谓反相是指用非极性固定相和极性流动相组成色谱体系。如在支持物上涂上一层高碳原子疏水性强烷烃类，洗脱液用极性强溶剂，如甲醇和水混合物。则被分离样品中极性强物质不被吸附，最先洗下来，得到很好分离效果。u以2040 m无定形硅胶（或球形硅胶）为载体，与十十八烷基三氯硅烷八烷基三氯硅烷进行键合制备出C18反相硅胶键合相（也称ODS柱），它可完成高效液相色谱7080分析任务。另外还有C8、C4、苯基、氰基等。u流动相通常为甲醇/水体系或乙腈/水体系。第80页81C18、C8、ODS、ODS2、RP18填料填料u硅胶基质；高聚物小球基质；氧化铝；氧化锆uODS：Octadecylsilane，十八烷基硅烷u碳载量：色谱柱键全固定相含碳量。普通碳载量高，柱容量大，分离极性差异较小比很好u孔径、比表面积第81页82ODS填料选择指南填料选择指南第82页83第83页84亲水基团疏水基团第84页85第85页86第86页87第87页882.10.5离子交换层析离子交换层析u离子交换剂是一个不溶性高分子化合物，其分子（或其经过化学反应引进）含有解离性离子交换基团，当一定量水溶液经过交换柱时，能与存在溶液中阳离子或阴离子物质起交换作用，而这种交换是可逆。u强（弱）酸型阳离子交换剂SO3H，COOHu强（弱）碱型阴离子交换剂N-(CH3)3X，NH2u亲水性离子交换剂（凝胶离子交换）可用于蛋白、多糖、生物碱分离。第88页89去离子水是怎样制得？去离子水是怎样制得？第89页90样品样品强酸型阳离子强酸型阳离子酸性、中性化合物酸性、中性化合物强碱性阴离子强碱性阴离子中性化合物中性化合物吸附碱性化合物吸附碱性化合物及两性化合物及两性化合物稀NaOH洗脱酸性化合物酸性化合物第90页912.10.6凝胶层析和亲和层析凝胶层析和亲和层析u亲和层析：亲和层析：是利用生物大分子之间有专一亲和力专一亲和力而到达分离纯化层析方法优点优点：1.纯化过程简单、快速纯化过程简单、快速2.分离效率高分离效率高3.试验条件温和试验条件温和缺点缺点：1.针对某一分离对象就需要制备专一针对某一分离对象就需要制备专一吸附剂和建立对应试验条件吸附剂和建立对应试验条件2.配基选择及其与基质共价结合需配基选择及其与基质共价结合需要烦琐操作步骤要烦琐操作步骤第91页92第92页93含有专一性亲和力生物分子对含有专一性亲和力生物分子对：酶酶底物（包含酶竞争性抑制剂和辅底物（包含酶竞争性抑制剂和辅酶因子）酶因子）特异性抗原特异性抗原抗体抗体激素激素受体受体DNA互补互补DNA或或RNA凝集素和糖蛋白凝集素和糖蛋白第93页94应具备特征：应具备特征：1.有丰富可供活化化学基团，并在温有丰富可供活化化学基团，并在温和条件下能与配基共价结合。和条件下能与配基共价结合。2.惰性，非专一性吸附无或足够小。惰性，非专一性吸附无或足够小。3.多孔网状结构。多孔网状结构。4.良好机械性能，含有好液体流动性。良好机械性能，含有好液体流动性。5.有很好物理和化学稳定性。有很好物理和化学稳定性。载体选择载体选择琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶、葡聚糖凝胶琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶、葡聚糖凝胶第94页95应具备特征：应具备特征：1.对于欲纯化生物物质应含有专一亲和性对于欲纯化生物物质应含有专一亲和性2.必须具备能被修饰功效基团必须具备能被修饰功效基团固相化技术：固相化技术：将配基以共价键连接于不溶于水固相将配基以共价键连接于不溶于水固相基质上制成固相化吸附剂基质上制成固相化吸附剂配基选择配基选择第95页96亲和法举例亲和法举例亲和层析法分离豌豆凝集素u 原理原理 亲和层析技术利用豌豆凝集素可与葡聚糖凝亲和层析技术利用豌豆凝集素可与葡聚糖凝胶发生特异性结合，再用含葡萄糖氯化钠溶液将豌豆胶发生特异性结合，再用含葡萄糖氯化钠溶液将豌豆凝集素洗脱下来。比较豌豆凝集素和杂蛋白对兔红细凝集素洗脱下来。比较豌豆凝集素和杂蛋白对兔红细胞凝集作用差异来进行判定。胞凝集作用差异来进行判定。器材器材 1.1.层析柱层析柱2.2.恒温孵育箱恒温孵育箱3.3.反应板反应板第96页971 1）亲和层析分离）亲和层析分离 SephadexG-50装柱，用1mol/LNaCl洗脱液平衡5分钟,加样6滴。加样后马上开始搜集洗脱液，每管搜集3ml，控制流速1015滴/分钟，待杂蛋白洗脱后，开始换0.2mol/L葡萄糖NaCl洗脱液进行洗脱，每管搜集3ml。搜集约10管后，用1mol/LNaCl洗脱液平衡柱5分钟，此柱即可再生。第97页982 2）豌豆凝集素生物活性测定）豌豆凝集素生物活性测定 取反应板一块，分别在各孔中加入对照生理盐水、杂蛋白洗脱液、豌豆凝集素搜集液各二滴再加入兔红细胞悬液1滴，置37保温10分钟，取出后用玻棒在反应孔轻轻搅动，比较各孔凝集情况，并解释结果。第98页99各种层析分离原理及应用领域各种层析分离原理及应用领域层析分类层析分类分离原理分离原理应用领域应用领域吸附色谱吸附能、氢键各种有机化合物分离、制备分配色谱疏水分配作用各种有机化合物分离、制备凝胶色谱溶质分子大小高分子分离，分子量及其分布测定离子交换色谱库仑力无机离子、有机离子分离亲和色谱生化特异亲和力蛋白、抗体、酶分离，生物和医药分析手性色谱立体效应手性异构体分离、药品纯化第99页100各种层析方法分离效能比较各种层析方法分离效能比较类型填充剂颗粒直径（um）N有效/t普通气相填充柱毛细管气相层析柱经典柱层析薄层层析不规则硅胶微粒层析柱多孔硅胶微球1300.20.5150755103610250.020.221123第100页1012.10.7 2.10.7 气相色谱气相色谱 GCGC 惰性气体作为流动相，利用分配系数差异，组分在两相间屡次（103-106）分配，因为固定相对组分保留能力不一样，经过一定柱长后彼此分离，次序离开色谱柱进入检测器，产生信号经放大后，在统计器上描绘出各组分色谱峰。第101页102第102页103可替换可替换Porakak系列系列第103页104第104页105第105页106第106页107第107页108第108页109第109页110第110页111第111页112第112页113固定液发展带动毛细管柱和气相色谱发展固定液发展带动毛细管柱和气相色谱发展u十二烷基苯磺酸铝u非高聚物，产品稳定u分离范围广,不但可分离弱极性烷烃、芳烃、酯、酮,尤其对极性较强有机羧酸有独特分离能力,可不经衍生直接进样分析u耐老化第113页114GC优点优点、高灵敏度：可检出10mg-10克物质，可作超纯气体、高分子单体痕迹量杂质分析和空气中微量毒物分析。、高选择性：可有效地分离性质极为相近各种同分异构体和各种同位素。、高效能：可把组分复杂样品分离成单组分。、速度快：普通分析、只需几分钟几十分钟即可完成。、应用范围广：即可分析低含量气、液体，亦可分析高含量气、液体，可不受组分含量限制。、所需试样量少：普通气体样用几毫升，液体样用几微升或几十微升。、设备和操作比较简单仪器价格廉价。第114页115 气相色谱仪气相色谱仪gaschromatographicinstruments岛津GC气相色谱仪第115页116气相色谱结构流程气相色谱结构流程1-1-载气钢瓶；载气钢瓶；2-2-减压阀；减压阀；3-3-净化干燥管；净化干燥管；4-4-针形阀；针形阀；5-5-流量计流量计;6-;6-压力表；压力表；4-4-针形阀；针形阀；5-5-流量计流量计;6-;6-压压力表；力表；9-9-热导检测器；热导检测器；10-10-放大放大器；器；11-11-温度控制器；温度控制器；12-12-统计仪；统计仪；载气系统载气系统进样系统进样系统色谱柱色谱柱检测系统检测系统温控系统温控系统第116页117载气系统载气系统u作为气相色谱载气气体，要求要化学稳定性好；纯度作为气相色谱载气气体，要求要化学稳定性好；纯度高；价格廉价并易取得；能适合于特定检测器。高；价格廉价并易取得；能适合于特定检测器。u惯用载气有氢气、氮气、氩气、惯用载气有氢气、氮气、氩气、氦气氦气、二氧化碳气等、二氧化碳气等等。等。u载气为何要净化？应怎样净化（净化器）？载气为何要净化？应怎样净化（净化器）？除去载气中一些有机物、微量氧，水分等杂质除去载气中一些有机物、微量氧，水分等杂质不纯净气体作载气，可造成柱失效，样品改变，氢不纯净气体作载气，可造成柱失效，样品改变，氢焰色谱可造成基流噪音增大，热导色谱可造成判定器焰色谱可造成基流噪音增大，热导色谱可造成判定器线性变劣等。普通均采取化学处理方法除氧，如用活线性变劣等。普通均采取化学处理方法除氧，如用活性铜除氧；采取分子筛、活性碳等吸附剂除有机杂质；性铜除氧；采取分子筛、活性碳等吸附剂除有机杂质；采取硅胶，分子筛等吸附剂除水分。采取硅胶，分子筛等吸附剂除水分。第117页118色谱柱色谱柱(分离柱分离柱)色谱柱色谱柱:色谱仪关键部件。色谱仪关键部件。柱材质柱材质:不锈钢管或玻璃，不锈钢管或玻璃，内径内径3-63-6毫米。长度可依毫米。长度可依据需要确定。据需要确定。柱填料柱填料:粒度为粒度为60-8060-80或或80-10080-100目标色谱固定相。目标色谱固定相。第118页119第119页120u固定相：固定相：ATSE-30,ATOV-1组成：组成：100%甲基聚硅氧烷甲基聚硅氧烷极性：非极性极性：非极性应用：碳氢化合物应用：碳氢化合物同类型号：同类型号：DB(HP)-1、AC1、SPB-1、CPSIL5、DM-1、RT-1使用温度：使用温度：50300u固定相：固定相：ATXE-60组成：组成：25%氰乙基甲基聚硅氧烷氰乙基甲基聚硅氧烷极性：中极性极性：中极性应用：酯、硝基化合物应用：酯、硝基化合物同类型号：同类型号：DB(HP)-225、AC225使用温度：使用温度：0280固定液使用固定液使用第120页121u固定相：固定相：ATFFAP组成：聚乙二醇组成：聚乙二醇TPA改性改性极性：极极性：极性性应用：酸、醇、醛、酯、腈、酮、基油应用：酸、醇、醛、酯、腈、酮、基油同类型号：同类型号：DB(HP)FFAP、SP-1000、Supecl-NUKOL、AC20使用温度：使用温度：50250u固定相固定相:AT农残农残号号AT农残农残号号组成：组成：极性：极性：应用：六六六、应用：六六六、DDT等含氯农药拟除虫菊酯类、含磷类农药等含氯农药拟除虫菊酯类、含磷类农药同类型号：同类型号：SPB-608、HP-608使用温度：使用温度：25300第121页122第122页123毛细管柱内径毛细管柱内径u0.53mm含有近似填充柱负荷量，总柱效则远远超出填充柱。含有近似填充柱负荷量，总柱效则远远超出填充柱。到达一样分离度时，到达一样分离度时，0.53mm大口径柱分析时间显著快于填充柱。大口径柱分析时间显著快于填充柱。可方便采取柱上进样或直接进样技术，适合于分析不太复杂样可方便采取柱上进样或直接进样技术，适合于分析不太复杂样品，是填充柱理想替换柱。品，是填充柱理想替换柱。0.32mm柱效稍低于柱效稍低于0.25mm常规柱，负荷量大于常规柱常规柱，负荷