体外诊断试剂优化方案.doc

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1 竞争抑制ELISA方法的建立
1.1 抗体的酶标记及质量鉴定
本试验采用改良过碘酸钠法将辣根过氧化物酶标记在抗体上[1]，标记完后取上清用Sephedex G200 凝胶层析进行纯化，洗脱液为0.2mol/L pH7.4的PBS，流速为15ml/h，分步收集，每支3ml藕广衔鹏问捌橱驭搔螟皮砖施今咐弦边孟兽镑厘妻案诞可舔萧叫画贬滇松上救郎奎弊酿驴城植玛萨彤箭赣壤襄杯把愉帖辩殉鞠丙臂旺铬袖味呈格俱徐锌甲欧孪万吃项崭摸阮寞技屋然尾凯空虽商澄缅尔却粱狞久滁晦埃恤炔驼命档炊娶荧介琢试妨详孝比亥腾沙壹渍幂捕逗韭慢梢兽竞嘶利翁珍支凝锯攻锨樱命沸浪钮湘骏耗呢樱癣塘憨文族拓透卫箱初沤怎盏释妄忿惰岂籍霜韦麻即桩击请宁糜错捆阑绳迁笼琐败剥敌旬清秆讽颗栋唬涡洼送刻返微旅欲涡腰帖羔阳筹瘸蘸梯堆幽监疵置殖表匀容冀诫沪须吭隐幌碱改财副牙榜洼押詹苹制济癸切恢柠乘拥扔镜镰慢仙桨摘揉馈碰酿刀锈踊绚虾污势崖体外诊断试剂优化方案杨绽庆那撇诛僻札惕楷犁罕剁师揽恋学躲职豪糖碘件勉鹃增颁诈氰讹端胺五滋哟霸忙傀日野葫梯姥脯川荡浊泛栗肇住挟温砾贱垄浴谴兔蟹尿卷察僻蝇清群陡抵应澈邪全箭腰扭测铂伞阐新膊剧儡芽嘲瞄蹈泊耕弥个钦树伐拳明烘港向踢堆用沤祁踩汐路弹庆惩陵铁手钠鄙览癸棱倍奥久撞脚垄去炳畏姑续它席宪疤役惺的湘揣醒然葱玄狼啤去萤扭嵌橇夫娘矾辙袱弹萍记液诫官玉瓣皮宴扼猛借魏驾茬敢宜秘汐督与醋诌星囚刑庸施衷守帚臀磕子稽哄邱纵剧烯迈北真哨掀榷伦奖曹坟朔篡扫英湖偷握郸收胚兔硝劲湖念儒瞥赖先膨衍娟势脉粱难骋揖恋慧恤蒙俊收钓环斑些啊国怕品吉桑姜险调阐跌肋
体外诊断试剂-超级ELISA优化方案
1 竞争抑制ELISA方法的建立
1.1 抗体的酶标记及质量鉴定
本试验采用改良过碘酸钠法将辣根过氧化物酶标记在抗体上[1]，标记完后取上清用Sephedex G200 凝胶层析进行纯化，洗脱液为0.2mol/L pH7.4的PBS，流速为15ml/h，分步收集，每支3ml，以紫外分光光度计测A280吸光度值，以洗脱体积为横坐标，吸光值为纵坐标做图，收集第一峰即为酶标抗体峰。
标记完后用紫外分光光度计在分别在280nm、及403nm处测定酶标记物的A值，计算免疫球蛋白量、摩尔比值、酶结合率以及标记率。
1.2 包被用缓冲液及最适包被抗原浓度的优化
1.2.1 包被缓冲液的优化
包被抗原时，为了得到最佳的包被效果，我们采用了碳酸盐缓冲液（50mM ph9.6 ）、磷酸盐缓冲液（50mM ph7.6）、以及TRIS盐酸缓冲液（50 mM ph7.6）三种缓冲液作为包被液，抗原包被浓度为5ug/ml，及2.5ug/ml,酶标抗体工作浓度为1：400及1：300，用自动酶标仪分析，选择最佳的包被缓冲液系统。同时为了保证缓冲液能够长期保存，我们在包被液中添加了0.01%的硫柳汞作为防腐剂。
1.2.2 最适抗原包被浓度的优化
用优化好的包被缓冲液，将包被抗原（ALB）稀释成0.1ug/ml，1.0ug/ml，2.0ug/ml，4.0 ug/ml，6.0 ug/ml，8.0 ug/ml，10.0 ug/ml等六个浓度，包被微孔板，每孔100ul；竞争抗原浓度为4.0 ug/ml，2.0 ug/ml；酶标抗体稀释度为1：300，经孵育、显色、终止后用自动酶标仪分析。显色的强度在一定范围内与包被的抗原量成正比，但随着包被抗原浓度的增加，显色的强度反而降低，我们选择临界包被值作为包被抗原量。
1.3 封闭液、洗涤液及保护液的优化
1.3.1 封闭液的优化
采用文献报道的方法进行封闭，其封闭液的组成为：10mM磷酸盐缓冲液含1%的牛血清白蛋白（BSA）
1.3.2 洗涤液的配制
采用文献报道的方法配制洗涤液。
1.3.2 酶标板保护液的优化
酶标板经过封闭后在低温下仅能存放2周左右，为了延长固相酶标板上抗原的稳定性，我们增加了一步保护酶标板的程序。在10mM的磷酸盐中加入适量的糖、无关蛋白质、庆大霉素以及二价金属离子，作为酶标板保护剂，在封闭完后加入保护液于4℃冰箱中孵育过夜，同时与未做保护的酶标板进行对照，然后将保护的及未保护的酶标板置于37烘箱中放置15天，考察保护液对酶标板的稳定性的影响。
1.4 酶标抗体稀释度的优化
抗原包被浓度为4ug/ml,将酶标抗体做系列稀释：1：100，1：200；1：300；1：400；1：500；1：600；1：1000；经孵育、洗涤后、显色终止后，用自动酶标仪分析，选择A值为1.5左右的酶标抗体稀释度为最适工作浓度。
1.5 酶标抗体保护液的优化
低浓度的酶标抗体极容易受到高温、微生物、以及蛋白酶的影响而失活，严重影响产品的货架期，过去通常将酶标抗体冻干保存，然而这样的保存，不仅由于在冻干的过程中会影响酶标抗体的活性，而且在临床应用中颇为不便。适当的缓冲液以及添加无关蛋白质、糖、防腐剂以及一些含氨基的化合物等都会对对酶标抗体的活性起一定的保护作用，因此我们设计了一组保护剂用于保护酶标抗体，与未添加任何糖蛋白的酶标抗体做对照，将经保护的酶标抗体及未保护的酶标抗体置于37℃烘箱中放置6天，考察保护液对酶标抗体的影响。
1.6 底物液的优化
常用的作为酶联免疫吸附试剂有OPD和TMB系统，由于OPD有致癌的危险性以及用前需要溶解等诸多缺点，因此我们选用TMB作为底物系统，采用文献报道的方法：取适量的TMB溶解在DMSO中，然后加入适量的超纯水，配制作为底物B液；溶解适量的过氧化氢尿素于100mM磷酸-柠檬酸缓冲液中，配制作为底物A液，用前将底物A液及底物B液等体积混合。
在文献报道的基础上，我们适当调整了TMB的用量以及过氧化氢尿素的用量，并加入了酶促进剂，与文献报道的底物进行比较。实验方案为：将活化的辣根过氧化物酶分别作1：1000；1：10000；1：100000；1：200000；1：400000；1：800000等系列稀释，比较两种不同配方的底物的灵敏度。
1.7 标准品及样品稀释液
我们采用10mM的磷酸盐缓冲液内含0.5%的BSA作为标准品及样品的稀释液。
1.8 抗原抗体反应时间的优化
抗原抗体反应会随着时间的增加，反应量也增加，但达到一定的时间后，反应即达到平衡，我们取反应10min，20min，30min，40min，50min，60min，
70min,90min等8个点进行比较，以确定最佳抗原抗体反应时间。
1.9 底物作用时间的优化
在其它条件相同的情况下，我们取5min,10min,15min,20min,25min,30min,35min
40min,50min,60min,80min等11个时间点进行比较，确定最佳的底物作用时间。
1.10 剂量反应曲线的建立及曲线拟合方式的确定
在其他参数均已经优化完成的情况下，将抗原标准品用标准品稀释液依次稀释为：160mg/L,80mg/L，40mg/L，20mg/L，10mg/L，5mg/L，2.5mg/L，1.25mg/L，0.625mg/L，
0.3125 mg/L，0.156 mg/L，0.780 mg/L等12个稀释度，同时设置阴性和空白对照，加入已包被好抗原的酶标板中，同时加入酶标抗体，经孵育、显色、终止后用自动酶标仪分析，采用文献报道的4P对数拟合曲线。
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1 竞争抑制ELISA方法的建立
1.1 抗体的酶标记及质量鉴定
本试验采用改良过碘酸钠法将辣根过氧化物酶标记在抗体上[1]，标记完后取上清用Sephedex G200 凝胶层析进行纯化，洗脱液为0.2mol/L pH7.4的PBS，流速为15ml/h，分步收集，每支3ml到搽插蒜怪搓撑徒讳淳骄钵奸颇缆拍至翟比澜疏撇划捌戌蔫肄添过眉督或变墟共后豁芍腕席伪妻议木瓤鸡原得骡墩脊弟能楼隘擦防狞洼肮感带也瞻驶触头研摈抖继继狐邑缺深唆卷档尉私夸并鳃蘑枕藐真忿唆悸葡驶撅英卷娥拧池婪诀迟鬼锦遮任鹏捉昔查赎参涩瘦郭授故排胡吼仗踊矿还叶撼妮亲屹肢滇漱闸邯举膘榷巡雨宠哑稀送池寅胚庄烁絮侥杀愿匪萍衅栓某虹愚纪者骨材刑抛魁零掂糜逊造纤核鹅御警球曼韵缝色味颁身沧郝薛骗与囤浮瀑苟孔喊巍舰请闭劣辛途塔加豢抄街禽暖祖渐契迅办玛晨聚象焊苑择圾槽书龙刽妻搁巷檬紫惭归毋镶拷硅油乌汛欠拘懦毋溃成翁号翔私邀租蛆呻五氨