高中生物基因工程12基因工程的基本操作程序学案新人教版.docx

1．2　基因工程的基本操作程序

1．掌握目的基因获取的常见方法。(难点)
2．学会基因表达载体构建的方法和要求。(重点)
3．理解目的基因导入受体细胞的方法。(重点)
4．掌握目的基因检测与鉴定的具体操作。(重、难点)

　目 的 基 因 的 获 取

1．目的基因
(1)主要是指编码蛋白质的基因。
(2)一些具有调控作用的因子。
2．获取方法
(1)从基因文库中获取
①基因组文库：含有一种生物所有的基因。
②部分基因文库：含有一种生物的一部分基因，如cDNA文库。
(2)利用PCR技术扩增目的基因
①含义：是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。
②原理：DNA双链复制。
③条件：引物、DNA模板、Taq酶、四种脱氧核苷酸。
④过程。
a．目的基因DNA受热变性后解链为单链(90～95 ℃)。
b．引物与单链相应互补序列结合(55～60 ℃)。
c．在DNA聚合酶作用下进行延伸(70～75 ℃)。
d．重复循环多次。
⑤结果：每次循环后目的基因的量增加一倍，即成指数形式扩增(约为2n)。
(3)人工合成法
①条件：基因比较小，核苷酸序列已知。
②方法：通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成。

探讨：基因组文库和部分基因文库有什么区别？
提示：基因组文库包含一种生物的全部基因，部分基因文库只包含一种生物的一部分基因。
探讨：PCR过程中需要解旋酶吗？所需要的DNA聚合酶应具有什么特点？
提示：PCR过程中，DNA双链解开是在高温下完成的，不需要解旋酶；由于PCR过程温度较高，所以需要能耐高温的DNA聚合酶。
探讨：什么样的基因适合用DNA合成仪直接人工合成？
提示：基因比较小，且核苷酸序列已知。

1．目的基因获取方法的选择
(1)如果不知道目的基因的核苷酸序列，可以通过构建基因文库的方法，即通过用受体菌储存并扩增目的基因后，从基因文库中去获取目的基因。
(2)如果知道目的基因的核苷酸序列，而且基因比较小，可以通过DNA合成仪利用化学方法人工合成。
(3)如果只知道扩增目的基因的两端的核苷酸序列，而且基因又比较大，则可以通过PCR技术扩增目的基因。
2．目的基因获取过程的比较
(1)基因组文库：
供体生物→全部DNA→DNA片段→受体菌群→目的基因
(2)cDNA文库：
供体生物→mRNA→cDNA→受体菌群→目的基因
(3)PCR技术：
目的基因→大量目的基因
(4)人工合成：
→→→
3．PCR技术与DNA复制的比较
比较项目
DNA复制
PCR技术
区
别
解旋方式
解旋酶催化
DNA在高温下变性解旋
场所
细胞内(主要在细胞核内)
细胞外(主要在PCR扩增仪中)
酶
解旋酶、DNA聚合酶
耐热的DNA聚合酶
温度
细胞内温和条件
控制温度，需55 ℃～95 ℃高温
结果
合成DNA分子
合成DNA片段或基因
联系
(1)模板：均需要脱氧核苷酸双链作为模板
(2)原料：均为四种脱氧核苷酸
(3)酶：均需DNA聚合酶
(4)引物：都需要引物，使DNA聚合酶从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸

1．下列获取目的基因的方法中需要模板的是(　　)
①从基因文库中获取目的基因　②利用PCR技术扩增目的基因　③反转录法　④通过DNA合成仪利用化学方法人工合成DNA
A．①②③④　 B．①②③
C．②③④ D．②③
【解析】　PCR技术利用的是DNA双链复制原理，即将DNA双链之间的氢键打开，变成单链DNA，作为聚合反应的模板。反转录法是以目的基因转录成的信使RNA为模板，在反转录酶的作用下，先反转录形成互补的单链DNA，再合成双链DNA。①④则均不需要模板。
【答案】　D
2．下列关于cDNA文库和基因组文库的说法中，不正确的是 (　　)
【导学号：72240004】
A．cDNA文库中的DNA来源于mRNA的反转录过程
B．如果某种生物的cDNA文库中的某个基因与该生物的基因组文库中的某个基因控制的性状相同，则这两个基因的结构也完全相同
C．cDNA文库中的基因都没有启动子
D．一种生物的cDNA文库可以有许多个但基因组文库只有一个
【解析】　由于基因转录时只有编码区段才能转录，所以以mRNA反转录成的DNA就只有外显子区段，而缺少内含子和启动子等非编码区段，和原来的基因结构不相同。
【答案】　B

基 因 表 达 载 体 的 构 建 与 转 化

(一)基因表达载体的构建——核心
1．基因表达载
体的组成

2．基因表达载体的功能
(1)使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代。
(2)使目的基因表达和发挥作用。
(二)将目的基因导入受体细胞
1．转化含义：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。
2．转化方法
(1)导入植物细胞
①最常用方法
农杆菌转化法：双子叶植物或裸子植物。
②其他方法
a．基因枪法：单子叶植物。
b．花粉管通道法。
(2)导入动物细胞
①常用方法：显微注射技术。
②常用受体细胞：受精卵。
(3)导入微生物细胞
①方法
a．用Ca2＋处理细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态(这种细胞称为感受态细胞)。
b．感受态细胞吸收重组表达载体DNA分子。
②受体细胞：原核细胞(使用最广泛的是大肠杆菌)。
③原核生物的特点：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少等。

探讨：用于构建基因表达载体的质粒为什么必须具有启动子和终止子？启动子和终止子与起始密码和终止密码是一回事吗？
提示：导入到受体细胞的目的基因的表达需要调控序列，因此在插入目的基因的部位之前需有启动子，之后需有终止子。不是一回事，启动子和终止子都在DNA上，在遗传信息转录时起作用。启动子是启动转录的开始，终止子是DNA分子上决定转录停止的一段DNA序列，其组成单位都是脱氧核苷酸。而起始密码子和终止密码子都是mRNA上三个相邻碱基。起始密码子决定翻译的开始，终止密码子决定翻译的停止。
探讨：农杆菌转化法利用了农杆菌的什么特性？
提示：农杆菌中的Ti质粒上的T­DNA(可转移的DNA)可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞的染色体DNA上。
探讨：植物基因工程常用的受体细胞为什么可以是体细胞，而动物基因工程一般只用受精卵？
提示：植物体细胞的全能性较高，可经植物组织培养过程形成完整植物体，因此受体细胞可以是体细胞；动物体细胞的全能性受到严格限制，因此动物基因工程中的受体细胞一般只用受精卵。

1．基因表达载体的构建过程
将切下的目的基因片段插入质粒的切口处，再加入适量DNA连接酶，形成一个重组DNA分子(重组质粒)。构建过程如下图所示：

2．将目的基因导入受体细胞的方法比较
生物类型
植物
动物
微生物
受体
细胞
体细胞
受精卵
原核细胞
常用
方法
农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法
显微注射技术
感受态细胞法
转化
过程
以农杆菌转化法为例：
将目的基因插入Ti质粒的T­DNA上
↓
转入农杆菌中
↓
导入植物细胞
↓
整合到受体细胞的DNA上
提取含目的基
因的表达载体
↓
显微注射
↓
受精卵发育
↓
具有新性
状的个体
Ca2＋处理细胞
↓
感受态细胞
↓
基因表达载体与
感受态细胞混合
↓
感受态细胞
吸收DNA分子

1．下列关于基因表达载体构建的相关叙述，不正确的是(　　)
A．需要限制酶和DNA连接酶
B．必须在细胞内进行
C．抗生素抗性基因可作为标记基因
D．启动子位于目的基因的首端
【解析】　基因表达载体的构建是指目的基因与载体结合，在此过程中需用同一种限制酶切割目的基因与载体，用DNA连接酶将相同的末端连接起来；基因表达载体的构建是在细胞外进行的；基因表达载体包括启动子(位于基因首端使转录开始)、终止子、目的基因和标记基因(鉴别受体细胞中是否含有目的基因，如抗生素抗性基因)。
【答案】　B
2．采用基因工程的方法培育抗虫棉，下列导入目的基因的做法正确的是
(　　) 【导学号：72240005】
①将毒素蛋白注射到棉受精卵中
②将编码毒素蛋白的DNA序列，注射到棉受精卵中
③将编码毒素蛋白的DNA序列，与质粒重组，导入细菌，用该细菌感染棉的体细胞，再进行组织培养
④将编码毒素蛋白的DNA序列，与细菌质粒重组，注射到棉的子房并进入受精卵
A．①②　 B．②③
C．③④ D．①④
【解析】　本题以抗虫棉培育为材料背景，主要考查基因操作中的第三步——将目的基因导入受体细胞。导入目的基因必须选择恰当的载体，以保证导入目的基因不被受体细胞降解，并成功地实现复制、转录和翻译。
【答案】　C

　目 的 基 因 的 检 测 与 鉴 定

1．分子水平检测
(1)检测转基因生物DNA上是否插入了目的基因。
方法：DNA分子杂交技术。
(2)检测目的基因是否转录出mRNA。
方法：分子杂交技术。
(3)检测目的基因是否翻译成蛋白质。
方法：抗原—抗体杂交技术。
2．个体水平鉴定
包括抗虫、抗病的接种实验，以确定是否有抗性及抗性程度。基因工程产品需要与天然产品活性进行比较等。

探讨：目的基因能否在真核生物中稳定遗传的关键是什么？如何检测？
提示：目的基因是否插入受体细胞的染色体DNA上，这是其能否在真核生物中稳定遗传的关键。检测方法是采用DNA分子杂交技术。
探讨：什么是基因探针？如何检测目的基因是否开始发挥功能？
提示：基因探针是用放射性同位素标记的目的基因的单链DNA片段。从转基因生物中提取mRNA，用标记的目的基因作探针，与mRNA杂交，如果显示出杂交带，则表明目的基因转录出了mRNA，意味着目的基因开始发挥功能
探讨：检测棉花中导入的抗虫基因是否表达的最简便的方法是什么？
提示：用叶片饲养棉铃虫，观察棉铃虫是否死亡。

目的基因的检测与鉴定在不同方面的比较
类型
步骤
检测内容
方法
结果显示
分子
检测

导入
检测
目的基因是否导入受体细胞
DNA分子杂交技术(DNA和DNA之间)
是否成功显示出杂交带
表达
检测
目的基因是否转录出mRNA
核酸分子杂交技术(DNA和mRNA之间)
是否成功显示出杂交带　　
目的基因是否翻译出蛋白质
蛋白质分子杂交(抗原和抗体之间)
是否成功显示出杂交带　　
个体生物
学水平的
鉴定　　
①确定是否具有抗性及抗性程度
②基因工程产品与天然产品的活性是否相同
①抗虫或抗病的接种实验
②基因工程产品与天然产品活性的比较
是否赋予了预期抗性或蛋白质活性

1． DNA探针是利用放射性同位素等标记的特定DNA片段。当DNA探针与待测的非标记单链DNA(或RNA)按碱基顺序互补结合时，形成标记DNA—DNA(或标记DNA—RNA)的双链杂交分子，可检测杂交反应结果。用某人的胰岛素基因制成DNA探针，能与之形成杂交分子的是(　　)
【导学号：72240006】
①该人胰岛A细胞中的DNA　②该人胰岛B细胞中的mRNA　③该人胰岛A细胞中的mRNA　④该人肝细胞中的DNA
A．①③④　 B．①②③
C．①②④ D．②③④
【解析】　DNA单链能与其互补链及其转录产生的mRNA分子互补配对而形成杂交分子；人体细胞中都有胰岛素基因，但此基因只有在胰岛B细胞中才能得到表达。
【答案】　C
2．转基因抗虫棉培育过程中要对Bt基因导入受体细胞后是否可以稳定维持和表达进行检测与鉴定，其中利用到碱基互补配对原则的有(　　)
①检测棉花的DNA上是否插入了Bt基因　②检测Bt基因是否在棉花细胞转录出mRNA　③检测Bt基因是否在棉花细胞翻译成蛋白质　④检测Bt基因是否赋予了棉花抗虫特性
A．①② B．①③
C．②③ D．②④
【解析】　检测棉花的DNA上是否插入了Bt基因和检测Bt基因是否在棉花细胞转录出mRNA都是用标记的目的基因作探针进行分子杂交，因此都要进行碱基互补配对；检测Bt基因是否在棉花细胞中翻译成蛋白质需进行抗原—抗体杂交，检测Bt基因是否赋予了棉花抗虫特性需要做抗虫接种实验，这两项技术都没有涉及碱基互补配对原则。
【答案】　A

1．基因工程的基本操作程序有：①使目的基因与运载体相结合；②将目的基因导入受体细胞；③检测目的基因的表达是否符合特定性状要求；④提取目的基因。正确的操作顺序是(　　) 【导学号：72240007】
A．③②④① B．②④①③
C．④①②③ D．③④①②
【解析】　基因工程的主要操作步骤顺序是：目的基因的获取→基因表达载体的构建→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定。
【答案】　C
2．下列不属于获取目的基因的方法是(　　)
A．利用DNA连接酶复制目的基因
B．反转录法
C．从基因文库中获取目的基因
D．利用PCR技术扩增目的基因
【解析】　本题考查目的基因的获取方法及DNA聚合酶和DNA连接酶的区别。对目的基因(DNA片段)进行复制需利用DNA聚合酶而不是DNA连接酶。
【答案】　A
3．下列关于基因表达载体的构建描述错误的是(　　)
A．基因表达载体的构建是基因工程的核心
B．基因表达载体的构建包括目的基因、启动子、终止子、标记基因等部分
C．目的基因主要是指编码蛋白质的结构基因
D．构建的基因表达载体都是相同的
【解析】　基因表达载体的构建是基因工程的第二步，也是基因工程的核心；一个基因表达载体的组成除目的基因外还必须具有启动子、终止子、标记基因等部分；目的基因主要是指编码蛋白质的结构基因；由于受体细胞不同，基因表达载体的构建也会有差别，不可能都是相同的。
【答案】　D
4．1957年，生物学家了解到，病毒感染的细胞能产生一种因子，这种因子能作用于其他细胞，干扰病毒的复制，故将其命名为干扰素；从1987年开始，用基因工程方法生产的干扰素进入了工业化生产，并且大量投放市场。
(1)若已知干扰素的氨基酸序列，则获取目的基因的较简单方法是
目的基因还可以从____________________文库获取，而从cDNA文库中不一定能得到，原因是__________________________________________________
_______________________________________________________________。
(2)用限制酶处理质粒和目的基因后，用________酶处理，可形成基因表达载体，该载体的化学本质是________。
3)转基因技术是否成功，需要对受体细胞进行分子水平的检测，首先是检测受体细胞____________上是否插入了目的基因，这是目的基因能否在真核生物中稳定遗传的关键。检测方法是采用_________________________________。
最后还要检测目的基因是否翻译成了相应的蛋白质，利用的技术是______________。
【解析】　(1)若已知干扰素的氨基酸序列，则可以通过反转录法获得目的基因；cDNA文库是部分基因文库，因为cDNA是由生物发育的某个时期的mRNA反转录产生的，所以cDNA中不一定有目的基因，最好从基因组文库中获取。(2)用限制酶处理载体和目的基因后，将目的基因与载体连接，需要使用DNA连接酶处理，基因与载体的化学本质是相同的，都是DNA。(3)检测目的基因使用DNA分子杂交技术；检测蛋白质采用的是抗原—抗体杂交技术。
【答案】　(1)人工合成法　基因组　cDNA是由生物发育的某个时期的mRNA反转录产生的(其他合理答案也可)
(2)DNA连接　DNA　(3)染色体的DNA　DNA分子杂交技术　抗原—抗体杂交技术
课堂小结：
网络构建
核心回扣

1.基因工程的基本操作程序有：①目的基因的获取；②基因表达载体的构建；③将目的基因导入受体细胞；④目的基因的检测与鉴定。
2.目的基因是指编码蛋白质的基因和具有调控作用的因子。其获取方法有：①从基因文库中获取；②利用PCR技术获取；③人工合成。
3.基因表达载体由目的基因、启动子、终止子和标记基因组成。
4.将目的基因导入植物细胞的方法有：①农杆菌转化法；②基因枪法；③花粉管通道法。
5.将目的基因导入动物细胞常用的方法是显微注射法。
6.目的基因的检测方法有DNA分子杂交技术、分子杂交技术和抗原—抗体杂交技术。有时还需进行个体生物学水平的鉴定。