菌落总数的检测方法.doc

ISO与美国FDA的不同处
食品微生物检查方法（FDA与ISO对比）
内容提纲：
l        菌落总数检测
l        大肠菌群及大肠杆菌检测
l        金黄色葡萄球菌检测
l        沙门氏菌检测
l        单核细胞增生李斯特氏菌检测
   菌落总数测定——菌落总数的概念
l        菌落总数是指在被检样品的单位重量（g）、容积（ml）或表面积（cm2）内，所含能于某种固体培养基上，在一定条件下培养后所生成的菌落的总数。
菌落总数测定——卫生学意义
l        鉴定食品被细菌污染的限度及卫生质量。
l        及时反映食品加工过程是否符合卫生规定，为被检食品卫生学评价提供依据。
l        通常认为，食品中细菌数量越多，则可考虑致病菌污染的也许性越大，菌落总数的多少在一定限度上标志着食品卫生质量的优劣。
FDA BAM 菌落总数测定流程
检样xg/mL+9xml稀释液（磷酸盐缓冲液）

适当十倍稀释样品

选择2~3个连续适宜稀释度
各取1mL分别加入灭菌平皿内
（每个稀释度做两个平行）

每皿内加入适量平板计数琼脂（PCA）
              35 ℃ 48 ± 2h

菌落计数
FDA BAM 菌落计数方法
l        选择25~250CFU之间的菌落进行计数，计算公式如下： N=∑C/（1*n1+0.1*n2）*d
l        所有平板的菌落数都局限性25CFU，报告EAPC/ml（g）为＜25*1/d。 EAPC：estimated aerobic plate count
l        所有平板的菌落数都超过250CFU，但局限性100/cm2 ，报告EAPC/ml（g）为最接近250CFU的平板菌落数的估计值，乘以相应的稀释度。
l        所有平板的菌落数都超过100/cm2 ，计算平板的面积（直径为90mm的平板面积为65cm2），估计最高稀释度每cm2的菌落数，乘以相应平板面积作为该稀释度的菌落计数结果，报告EAPC/ml（g）为＞65*100* 1/d。
l        无法计数的平板报告LA（Laboratory Accident）。
l        最终结果保存前两位有效数字。按照4舍6入，5是奇进偶不进。
ISO4833-2023 菌落总数测定流程

检样xg/mL+9xml稀释液（磷酸盐缓冲液）

适当十倍稀释样品

选择2~3个连续适宜稀释度
各取1mL分别加入灭菌平皿内
（每个稀释度做两个平行）

每皿内加入适量（12~15mL）
平板计数琼脂（PCA），
                 30±1 ℃ ，72 ±3 h

菌落计数
ISO4833-2023菌落计数方法
l        选择连续2个稀释度不超过300CFU的平板，且一个平板至少含15CFU进行计数，计算公式如下： N=∑C/（n1+0.1*n2）*d
l        所有平板的菌落数都局限性15CFU，计算2平板菌落的算术平均值m，液体样品：NE=m  固体样品： NE=m×d-1
l        无菌生长：液体样品：less than 1;     固体样品：less than 1 ×d-1
l        最终结果保存前两位有效数字。
菌落总数测定几点说明
l        由于检样中采用30/35℃有氧条件下培养，因而并不是样品中实际的总活菌数，一些特殊营养规定的细菌、厌氧菌、微需氧菌、以及非嗜中温细菌，均难以反映出来。
l        鉴于食品检样中的细菌细胞是以单个、成双、链状、葡萄状或成堆的形式存在，因而在平板上出现的菌落可以来源于细胞块，也可以来源于单个细胞，因而平板上所得菌落的数字不应报告活菌数，而应以单位重量、容积或表面积内的菌落数或菌落形成单位（colony forming units，CFU）报告。
菌落总数测定几点规定
l        每个样品从开始稀释到倾注最后一个平皿所用的时间不得超过15min，重要为防止细菌增殖和产生片状菌落。样液与琼脂应充足混合，避免将混合物溅到平皿壁和皿盖上。皿内琼脂凝固后，不要长时间放置，然后倒置培养，可避免菌落蔓延生长。
l        检样过程中应用稀释剂做空白对照，用以鉴定稀释液、培养基、平皿或吸管也许存在的污染。同时，检样过程中应在工作台上打开一块空白平板计数琼脂，其暴露时间应与检样时间相称，以了解检样在检查操作过程中有无受到来自空气的污染。
l        检样稀释液有时带有食品颗粒，为避免与细菌菌落发生混淆，可作一检样稀释液与平板计数琼脂混合的平皿，不经培养，于4 ℃放置，以便在计数检样时用作对照。
大肠菌群的定义
l        大肠菌群系指一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。
l        大肠菌群不是细菌学上的分类命名，而是根据卫生学方面的规定，提出的与粪便污染有关的细菌，即作为食品、水体等是否受过人畜粪便污染的指示菌，这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致。根据进一步的生化实验，可将这群细菌再分为大肠艾希氏菌（俗称大肠杆菌）、弗氏柠檬酸杆菌、肺炎克雷伯氏菌和阴沟肠杆菌等。  
大肠杆菌的定义
l        大肠杆菌（也称大肠埃希氏菌），分类于肠杆菌科，归属于埃希氏菌属。
l        大肠杆菌指革兰氏阴性无芽孢杆菌、乳糖发酵产酸产气、IMViC实验（靛基质、MR、V-P、柠檬酸盐实验）为++--或-+--的细菌。
l        与人类有关的大肠杆菌统称为致泻性大肠杆菌，涉及五种：肠毒素性大肠杆菌（ETEC）、致病性大肠杆菌（EPEC）、出血性大肠杆菌（EHEC）、侵袭性大肠杆菌（EIEC）、黏附性大肠杆菌（EAEC）。
卫生学意义
l        大肠菌群和大肠杆菌是评价卫生质量的重要指标，作为食品中的粪便污染指标。
l        食品中检出大肠菌群，表白该食品有粪便污染，既也许有肠道致病菌存在，因而也就有也许通过污染的食品引起肠道传染病的流行。大肠菌群数的高低，表白了粪便污染的限度，也反映了对人体健康危害性的大小。
l        大肠杆菌在外界存活时间与一些重要肠道致病菌接近，它的出现预示着某些肠道病原菌的存在，因此该菌是国际上公认的卫生监测指示菌。近年来，有些国家在执行HACCP管理中，将大肠杆菌检测作为微生物污染状况的监测指标和HACCP实行效果的评估指标。
大肠杆菌的生物学特性
培养特性：
l        大肠杆菌合成代谢能力强，在含无机盐、铵盐、葡萄糖的普通培养基上生长良好。最适生长温度为37℃，在42-44 ℃条件下仍能生长，生长温度范围15-46 ℃

大肠菌群及大肠杆菌测定
  ——MPN法检查流程（FDA BAM）
检样50g+450ml稀释液

适当十倍稀释样品

选择3个适宜的连续稀释度的样品稀释液，
每个稀释度接种三管LST肉汤（每管9mlLST肉汤并加有导管），
每管接种1mL
                                                 35℃ ，24 ± 2h ~48 ± 2h

  没有产气管                                             有产气管  

   报告阴性                                          
                          接种BGLB肉汤管                       接种EC肉汤
                                                                                                44.5±0.5 ℃ （水浴培养）
                                                                      24 ± 2h ~48 ± 2h
                         查MPN表报告结果           产气管接种EMB平板（35℃、18~24h）
                           （大肠菌群）                从EMB平板上挑取5个可疑菌转接到PCA斜                  
                                                      面，进行革兰氏染色、IMVC生化鉴定、接         种LST复检产气

   查MPN表报告结果（大肠杆菌）                                      

大肠菌群测定——MPN法检查几点说明
l        MPN检索表：
   MPN检索表只给了三个稀释度，如改用不同的稀释度，则表内数字应相应减少或增长10倍。
l        初发酵和证实实验：
    1）两步法进行了两次乳糖发酵实验。初发酵和证实实验所用培养基不同，但都是为了证实培养物是否符合大肠菌群的定义，即“在37℃分解乳糖产酸产气”。
    2）初发酵阳性管，不能肯定就是大肠菌群细菌，通过证实实验后，有时也许成为阴性。有数据表白，食品中大肠菌群检查环节的符合率，初发酵与证实实验相差较大。因此，在实际检测工作中，证实实验是必需的。
l        产气量与倒管：
    在乳糖发酵实验工作中，经常可以看到在发酵倒管内极微少的气泡（有时比小米粒还小），有时可以碰到在初发酵时产酸或沿管壁有缓缓上浮的小气泡。实验表白，大肠菌群的产气量，多者可以使发酵倒管所有充满气体，少者可以产生比小米粒还小的气泡。假如对产酸但未产气的乳糖发酵如有疑问时，可以用手轻轻打动试管，如有气泡沿管壁上浮，即应考虑也许有气体产生，而应作进一步实验。
大肠杆菌测定——EMB选择性分离鉴别
EMB平板典型大肠杆菌菌落特性：
中心黑色或紫红色，有或无绿色金属光泽
大肠杆菌测定——EMB选择性分离鉴别
l        EMB是一种弱选择性培养基，一些球菌也可在该培养基上生长；
l        高压灭菌可使得美蓝还原从而使培养基的颜色呈不均一橘黄色，轻轻摇动培养基可以恢复原有的正常紫色，倾注平板前应先摇匀；
l        大肠杆菌在该培养基上并不一定总是呈现绿色的金属光泽；
l        该培养基受可见光易使其中的成分氧化，储存及培养细菌时都应在避光条件
大肠杆菌测定——革兰氏染色
基本环节：
l        将涂片在火焰上固定，滴加结晶紫染液，染1min，水洗；
l        滴加革兰氏碘液，作用1min，水洗；
l        滴加95%乙醇脱色约15～30s,直至染色液被洗掉，不要过度脱色，水洗；
l        滴加番红复染液，复染1min，水洗、待干、镜检。
l        结果：革兰氏阳性菌呈紫色，革兰氏阴性菌呈红色。
大肠杆菌测定——生化鉴定
（表略）
金黄色葡萄球菌——概述
l        根据《伯杰氏鉴定细菌学手册》，按葡萄球菌的生理化学组成，将葡萄球菌分为金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、表皮葡萄球菌(S. epidermidis)和腐生葡萄球菌(S. saprophyticus)，其中金葡多为致病性菌，表葡偶尔致病。
l        金黄色葡萄球菌是人类化脓性感染中最常见的病原菌。可引起局部化脓性感染，如疖、痈、皮下脓肿、外科切口及烧伤创面的感染；也可引起肺炎、伪膜性肠炎、肾盂肾炎、心包炎等多系统的化脓性感染；还可引起败血症、脓毒症等全身性感染。葡萄球菌的致病力强弱重要取决于其产生的毒素和侵袭性酶。  

金黄色葡萄球菌——生物学特性
金黄色葡萄球菌呈球形，直径0.8μm左右，排列成葡萄串状 ，无芽孢，无荚膜。
金黄色葡萄球菌——生长特性
l        金黄色葡萄球菌在肉汤中呈浑浊生长，在胰酪胨大豆肉汤内有时液体澄清，菌量多时呈浑浊生长
金黄色葡萄球菌检查——方法合用性
l        MPN法：合用于检测带有大量竞争菌的食品及其原料和未经解决的含少量金黄色葡萄球菌的食品。
l        直接平板计数法：合用于检查金黄色葡萄球菌数不小于10/g（ml）的食品。
l        增菌培养法：合用于检查具有受损伤的金黄色葡萄球菌的加工食品。
金黄色葡萄球菌检查——直接平板计数法
（FDA BAM &ISO）
检样（50g+450mL稀释液）

                                         适当十倍稀释样品

选择2~3个连续适宜稀释度

吸取1ml菌液按照0.3mL、0.3mL、0.4mL分别涂布于
3块90mmBaird-Parker平板上（做平行实验）
                                                 35℃ ，45~48 h
确证实验

报告

FDA BAM 金黄色葡萄球菌检查——MPN法
检样（50g+450mL稀释液）

适当十倍稀释样品

选择3个适宜的连续稀释度的样品稀释液，
每个稀释度接种三管10% NaCl TSB肉汤，
每管接种1mL
             35℃ ，48 ±2 h
从生长的管中接种1环划线于 Baird-Parker平板上
         35℃ ，48 h
确证实验

报告
FDA BAM 金黄色葡萄球菌确证实验
1.凝固酶实验
l        方法：从平板上至少挑取1个可疑金黄色葡萄球菌菌落，移种到TSB/BHI肉汤中，置35℃培养18-24h。取肉汤培养物0.3mL同0.5mL凝固酶实验兔血浆充足混合，置35℃培养，定期观测是否有凝块形成，至少观测6h。实验中需同时做已知阳性和阴性对照。
l        结果鉴定：以内容物完全凝固，使试管倒置或倾斜时不流动为阳性。部分凝固（2+和3+）的必须进行生化鉴定加以证实。
FDA BAM金黄色葡萄球菌确证实验
2.革兰氏染色
l        对所有的可疑培养物都要进行革兰氏染色。
3.生化鉴定
l        过氧化氢酶实验
l        葡萄糖厌氧运用实验
l        甘露醇厌氧运用实验
l        金葡溶菌酶敏感性实验
l        耐热核酸酶实验（辅助
ISO 金黄色葡萄球菌检查——MPN法
检样（xg+9xmL稀释液）

适当十倍稀释样品

选择3个适宜的连续稀释度的样品稀释液，
每个稀释度接种三管
modified Giolitti and Cantoni broth，
                  37℃ ，24~48 h
从变黑或出现黑色沉淀的管中
接种1环培养物于 Baird-Parker平板上
               37℃ ，48 h
确证实验

报告
沙门氏菌属简介
l        1880年E. Berth一方面发现伤寒沙门氏菌，1885年Salmon与Smith又分离出猪霍乱沙门氏菌，以后取Salmon氏之名为本菌属之名。
l        沙门氏菌属是一群符合肠杆菌科定义并与其血清学相关的革兰氏阴性、需氧性、无芽孢杆菌。本菌属种类繁多，抗原结构复杂，现已发现2023多个血清型，我国已发现血清型近200个。
沙门氏菌属——生物学特性
形态特性：
     革兰氏阴性，大小为1~3×0.4~0.9μm的两端钝圆的短杆菌，无芽孢，一般无荚膜，除鸡沙门氏菌和雏沙门氏菌以外，都有周身鞭毛，运动力强。
培养特性：
l        沙门氏菌需氧或兼性厌氧，10-42 ℃都可生长，最适生长温度为37℃，最适pH为6.8~7.8。
l        营养琼脂平板上：35~37℃培养18~24h，其菌落大小一般为2~3mm，光滑、湿润、无色、半透明、边沿整齐。
l        血平板上：中档大小的灰白色菌落。
沙门氏菌属的抗原
l        菌体抗原（O抗原）
l        表面抗原（K抗原）：Vi抗原和M抗原
l        鞭毛抗原（H抗原）
l        纤毛抗原
FDA BAM沙门氏菌检查流程
前增菌                   25g样+225mL乳糖肉汤 （肉制品、肉副产品、动物产品）
匀质2min，室温放置60 ±5min
混合均匀，测定调节PH6.8 ±0.2
35℃、24 ± 2h
选择性增菌
0.1ml+10mlMM（RV）                            1ml+10mlTTB
42℃、24h
                      （水浴培养）                        35℃、24h         43℃、24h（水浴培养）
                                                含菌量高           含菌量低
分离培养                       划线接种 选择性培养基（BS、XLD、HE）
       35℃、24~48h（BS）
生化鉴定                   每个平板挑取至少2个可疑菌（涉及典型和非典型各2个）
接种TSI三糖铁、LIA赖氨酸铁高层斜面（LIA高层深4cm）
（松盖以保持有氧条件防止产生过多H2S）
35℃、24±2h
                 弃去       尿素酶实验        卫矛醇、  氰化钾、丙二酸钠、吲哚实验
阳性               阴性

血清学                             血清学实验——沙门氏菌的分类

报告结果

ISO6579沙门氏菌检查流程
前增菌                               25g样+225mLBPW
匀质
             37±1℃、18 ± 2h

选择性增菌
0.1ml+10mlRVS                                      1ml+10mlMKTTn
                41.5 ± 1℃、24 ± 3h                                 37 ± 1℃、24 ± 3h
（水浴培养）

分离培养        划线接种选择性培养基（XLD和第二种选择性培养基，如 BS）
37℃、24~48h（BS）
每个平板挑取至少5个可疑菌进行纯培养和确认实验
        37℃、24±3h

生化鉴定              TSI、尿素酶、赖氨酸脱羧酶、β-牛乳糖、V-P、 吲哚实验

血清学                                 血清学实验——沙门氏菌的分类

报告结果

沙门氏菌检查选择性分离培养
XLD琼脂：
FDA BAM——典型菌落：粉色菌落，带或不带黑色中心。许多沙门氏菌培养物可呈现大的具光泽的黑色中心或几乎为所有黑色的菌落。
        ——非典型菌落：黄色带或不带黑色中心。
ISO——中心黑色、周边由于指示剂颜色的改变而出现红色的轻微透明带。
菌名        菌落形态
鼠伤寒沙门氏菌         红色，有黑心
伤寒沙门氏菌        红色，有黑心
弗氏志贺氏菌        红色
大肠埃希氏菌         黄色，有胆盐沉淀环
粪链球菌         -

沙门氏菌检查选择性分离培养
BS琼脂：
FDA BAM——典型菌落：产硫化氢菌落黑色有金属光泽、棕褐色或灰色，菌落周边的培养基通常开始呈褐色，但随着培养时间的延长而变为黑色，并有晕环效应；
         ——非典型菌落：有些菌株不产生硫化氢，形成灰绿色菌落，周边培养基不变色。

沙门氏菌检查选择性分离培养
HE琼脂：
FDA BAM——典型菌落：兰绿色至兰色，多数菌株产硫化氢，菌落带或不带黑色,中心或几乎全黑色。
         ——非典型菌落：乳糖阳性的菌株为黄色中心黑色或全黑色。

沙门氏菌检查生化鉴定
TSI：
典型反映：斜面产碱（K）：红色；底部产酸（A）：黄色；产H2S：黑色（少数不产）

沙门氏菌检查——几点注意
l        冷冻样品解冻需在45℃以下，有自动调温器自控的水浴锅内不断搅拌进行15min或在2-8℃，18小时内软化。
–        为保证检查的准确性，必须在选择性培养基上挑取足够数量的菌落进行生化和血清学鉴定。
l        进行生化反映时，应以纯培养物进行实验，如出现血清学阳性，而生化反映特性不符合时，应对接种物进行纯化，用纯化后的培养物重新进行生化实验。
–        测试中应同时接种阳性对照菌株。
李斯特菌属简介
l        《伯杰氏鉴定细菌学手册》第9版中，李斯特菌属有7个种：单核细胞增生李斯特氏菌（L. monocytogenes）、英诺克李斯特氏菌（L. innocua） 、西尔李斯特氏菌（L. seeligeri） 、威尔斯李斯特氏菌（L. welshimeri） 、绵羊李斯特氏菌（L. ivanovvi） 、格氏李斯特氏菌（L. grayi） 、默氏李斯特氏菌（L. murrayi） 。
l        单核细胞增生李斯特氏菌是李斯特氏菌病的致病菌，可引起动物的感染，也可引起人的感染。
单核细胞增生李斯特氏菌——生物学特性
培养特性
l        生长温度为2~42℃（冷藏不能阻止该菌的生长），最适生长温度为35~37℃。20~25 ℃培养有动力，37 ℃培养动力消失；在显微镜下观测该菌新鲜的室温肉汤培养物可见翻筋斗运动。
l        在pH3.8~4.4仍能生长，在pH中性至弱碱性（9.6）、氧分压略低、二氧化碳张力略高的条件下该菌生长良好，在6.5%NaCl肉汤中也能良好生长。
l        血平板上：菌落通常不大呈灰白色，刺种血平板可产生窄小的β溶血环。
FDA BAM单核细胞增生李斯特氏菌检查流程
检样25g

增菌                                 EB增菌液基础225mL
         30℃   4h
加入抑菌剂
  30℃   20h                         30℃   44h
选择性分离培养       接种OXA和 PALCAM           接种OXA和 PALCAM
  35℃   24-48h                      35℃   24-48h

生化鉴定                               TSA-YE纯培养
          30℃ 24-48h

典型运动                                   TSB-YE
过氧化氢酶实验
革兰氏染色
溶血实验

ISO单核细胞增生李斯特氏菌检查流程

测试样品（x g或x mL）+9x mL一次增菌培养基（Half Fraser肉汤）
          30℃培养24±2h
1mL培养液加入                                        划线接种Oxford琼脂
10mL二次增菌培养基中                                   和PALCAM琼脂
（Fraser肉汤）
        35℃或37℃培养48±2h                                  30℃、35℃或  
                                                                 37℃培养24-48h
划线接种Oxford琼脂                                          
和PALCAM琼脂
30℃、35℃或37℃培养24-48h

李斯特菌属的确证：
                             挑取可疑菌接种TSAYE培养基
            过氧化氢酶实验
革兰氏染色
动力实验

                                  单核细胞增生李斯特菌的确证：
          溶血实验
             碳源运用实验
                                         CAMP（协同溶血）实验        

单核细胞增生李斯特氏菌——溶血实验
l        制备5~7%羊血琼脂平板。
l        挑取TSAYE平板上的典型菌落刺种血平板，刺种时避免接触到平板底部和使琼脂破裂，同时接种阳性（单核细胞增生李斯特氏菌）和阴性（英诺克李斯特氏菌）对照。
l        单增呈现狭窄、清楚、明亮的β-溶血；
l        西尔李氏菌出现弱的溶血现象；
l        绵羊李氏菌通常呈宽的、轮廓清楚的β-溶血；
l        英诺克李氏菌不产生溶血现象。
单核细胞增生李斯特氏菌——协同溶血实验（CAMP）
l        方法：在羊血琼脂平板上平行接种β-溶血金黄色葡萄球菌（S.aureus）和马红球菌(R.equi),在它们中间垂直划线接种可疑菌，与两线相近但不相交，在30℃培养24h-48h,检查平板中垂直接种点对溶血环的影响。
l        结果：靠近金黄色葡萄球菌接种点的单增李斯特氏菌的溶血增强，西尔李斯特氏菌的溶血也增强，绵羊李斯特氏菌在马红血球附近的溶血增强。
ISO李斯特氏菌鉴定反映

种别        溶血性        产酸        CAMP实验
                鼠李糖        木糖        金黄色葡萄球菌        马红球菌
L.monocytogenesL. innocuaL. ivanovviL. seeligeriL. welshimeriL. grayiL. murrayi        +-+(+)---        +v--v-v        --+++--        +--(+)---        --+----
v: vatiable reaction(+): weak reaction+: >90% of positive reaction -: no reaction

FDA李斯特氏菌属的区别
种别        溶血性        毒力a        糖发酵c
                        甘露醇        鼠李糖        木糖
L.monocytogenesL. ivanovvi L. innocua L. welshimeriL. seeligeriL. grayiL. murrayi b        ++--+--        ++-----        -----++        +-vv-vv        --++-+-
a: mouse testv: variable biotypesb: 硝酸盐还原实验阳性，其它种该反映为阴性。c: 葡萄糖、麦芽糖、七叶苷糖发酵实验所有为阳性。

几种常用稀释缓冲液介绍
l        磷酸盐缓冲液
    储备液的制备：称取34g磷酸二氢钾溶解于500ml蒸馏水中，用1NNaOH
    溶液调整pH值为7.2，再用蒸馏水稀释至1000ml，121℃高压灭菌
    15min，于冰箱中储存。
    稀释液的制备：取1.25ml储备液，用蒸馏水稀释至1000ml，定量分
    装，121℃高压灭菌15min备用。
l        0.85%生理盐水
    称取8.5gNaCl溶解于1000ml蒸馏水中，定量分装，121℃高压灭菌
    15min备用。
l        0.1%蛋白胨水
    称取1g蛋白胨溶解于1000ml蒸馏水中，定量分装，121℃高压灭菌
    15min备用。蛋白胨水对细菌细胞有更好的保护作用，不会由于在稀释
    过程中使检样中原已受损伤的细菌细胞导致死亡。
l        无菌水