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唇形科植物牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶编码基因及其氨基酸序列的生物信息学分析 陈宜均+荣齐仙+姜丹+申业+黄璐琦摘要牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶（geranylgeranyl pyrophosphate synthase，GGPS）是二萜类物质合成途径中的一个关键酶。该文采用生物信息学方法对9种唇形科植物的牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶的核苷酸及其编码的氨基酸序列的结构、理化性质、信号肽、导肽、跨膜结构域、疏水性/亲水性和亚细胞定位特征、二级结构、蛋白质功能域、三级结构和进化关系进行了初步预测和分析，并构建了牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶蛋白家族的系统进化树。结果表明，9种唇形科植物的GGPS氨基酸序列理化性质基本一致，主要表现为亲水性蛋白，有叶绿体转运肽，不存在信号肽，没有跨膜结构域；大多数定位于叶绿体，少数定位于线粒体。蛋白质二级结构中最主要的结构元件是-螺旋和无规则卷曲，含有多聚异戊二烯基合成酶的活性结构域、2个天冬氨酸富集区结构域、活性位点残基盖结构域和镁离子结合位点结构域。研究结果将为GGPS的酶学特性及二萜类生物合成的分子机制研究提供理论参考。关键词唇形科； GGPS合酶； 二萜生物合成； 生物信息学AbstractGeranylgeranyl pyrophosphate synthase enzyme is one of the key enzymes in the synthesis pathway of diterpenoid. Nine Lamiaceae genus GGPS synthase in Genebank was analyzed in this article. GGPS synthase the nucleic acid sequences and amino acid sequences， physicochemical properties， the signal peptide， leader peptides， transmembrane topological structure， hydrophobic， hydrophilic， subcellular localization， secondary structure， function domain， tertiary structure and evolutional relationship were predicted by using bioinformatics methods.Phylogenetic tree was constructed for the geranylgeranyl pyrophosphate synthase enzyme protein family. The results showed that GGPS amino acid sequence of the physical and chemical properties were basically identical， mainly hydrophilic protein， there existed chloroplast transit peptide， and no signal peptide and membrane structure domain， which mainly located in the chloroplast， the minor part located in mitochondria. The main secondary structures of the proteins are alpha helix and random coil. All these proteins have catalytic residues， aspartate-rich region， active site lid residues， substrate-Mg2+ binding site. The results provide theoretical reference for study on both the enzymatic characteristics of GGPS and the biosynthesis pathway of diterpenoid.Key wordsLamiaceae； geranylgeranyl pyrophosphate synthase （GGPS）； diterpene biosynthesis； bioinformatics二萜类化合物是由4个异戊二烯结构单元組成的C20类萜类化合物，是以二萜类化合物的共同前体牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸 （geranylgeranyl pyrophosphate， GGPP）为底物，在不同的二萜合酶的催化下形成的，广泛地分布于自然界，在植物、动物和海洋生物中均有二萜类化合物的存在。目前研究发现，二萜类化合物共有119种骨架，1万多种化合物。主要的骨架类有克罗烷（cleordane）型、贝壳杉烷（kaurane）型、半日花烷（labdane）型和松香烷（abietane）型等。二萜类化合物广泛存在于植物中，包括唇形科鼠尾草属植物、巴豆属植物、香茶菜属植物、黄芩属植物、番茄枝属植物、Eurycoma 属植物等，而且二萜类化合物具有重要的生理活性，如治疗肿瘤的的紫杉醇1；治疗心血管系统疾病、抗菌消炎的丹参酮2以及在农业上用于高效调控植物生长发育的赤霉素3等。途径（pyruvate/ glyceradehyde-3-P pathway），此途径最初的前提物质是丙酮酸和3-磷酸甘油醛（G3P），二者在1-脱氧-D木酮糖-5-磷酸合成酶（DXPS）的催化作用下聚合成1-脱氧-D-木酮糖-5-5磷酸（DXP），DXP经异构中间体、磷酸化、环化等步骤逐渐形成2-甲基赤藓糖醇-4-磷酸（MEP）中间体，再经过磷酸化、环化生成异戊烯基二磷酸（IPP）。IPP在异戊烯基二磷酸异构酶（isopentenyl diphosphate isomerase，IDI）的作用下部分转化为双键异构体DMAPP。高等植物体内，IPP与DMAPP经头尾缩合形成具有C10骨架的牻牛儿基焦磷酸（geranyl pyrophosphate，GPP），GPP加上第2个IPP单元形成具有C15骨架的法呢基焦磷酸（farnesyl pyrophosphate，FPP），FPP由GGPP合成酶催化再加上第3个IPP单元缩合反应产生具C20骨架的GGPP。由于GGPP是多种初生和次生代谢物等共同前体，因此，GGPS能够起到调节碳流的作用4，从而成为初生和次生代谢途径中的关键酶之一。 目前，有多种植物的GGPS已经或正在被深入研究，包括冷杉Abies grandis、银杏Ginkgo biloba和红豆杉Taxus canadensis，T. wallichiana，T. wallichiana var. chinensis，T. x media）等裸子植物，以及以拟南芥Arabidopsis thaliana为代表的多种被子植物。已知以GGPP为前体的具有药用价值的化合物有紫杉醇5、银杏酚和丹参酮等，且已证明GGPP是决定红豆杉植物合成紫杉醇类物质的关键酶之一。对模式植物拟南芥GGPS的研究表明6，GGPS还参与植物的发育过程，并具有时空特异性。该基因在花期表达，而且其活性只有在花瓣和叶片中检出，随着花瓣的发育，酶活性逐渐降低。另外，在丹参过表达GGPS株系中隐丹参酮含量的显著降低，RNAi株系中肉眼可见的显著表型为根缩短、叶发黄，这提示赤霉素含量的升高及叶绿素和/或类胡萝卜素含量的降低7。唇形科Lamiaceae植物通常含有丰富萜类化合物，广泛应用于医药和食品行业，如具有利湿、消肿止痛等功效的黄芩8-9，具有强心、抗压、平喘、抗血栓及降低眼内压等药理作用的鞘蕊苏10和用于治疗妇科、心血管及肾脏疾病的益母草属，都具有很高的经济价值及实用价值。目前唇形科中已从丹参11，毛喉鞘蕊花12和米团花13中克隆了GGPS基因。其作为植物二萜类化合物生物合成过程中的关键酶之一，正在受到越来越多的关注，本文利用生物信息学方法，对唇形科植物中已克隆的9个GGPS合酶的cDNA序列及其编码的氨基酸序列的组成、理化性質、信号肽、导肽、跨膜结构域、疏水性/亲水性、亚细胞定位、二级结构、功能结构域、三级结构和进化关系进行预测和分析，以期为今后深入研究更多植物GGPP合酶的功能和结构特征以及其生理功能提供一些理论依据。1 数据下载以“Lamiaceae”和“geranylgeranyl diphosphate synthase”为搜索关键词，从美国国立生物技术信息中心（National Center of Biotechnology Information，NCBI）下载来自丹参（Salvia miltiorrhiza，Sm）、毛喉鞘蕊花（Plectranthus barbatus，Pb）、米团花（Leucosceptrum canum，Lc）的9种完整的唇形科GGPS核苷酸序列和氨基酸序列（表1）。2 方法利用美国国家生物技术信息中心网站（http：/www.ncbi.nlm.nih.gov） 对唇形科植物GGPS 核苷酸和氨基酸序列进行在线分析14-15。核苷酸及其编码氨基酸序列的组成成分、相对分子质量、等电点等理化性质利用ProtParam 在线进行分析，开放阅读框的查找利用ORF Finder在线工具（http：/www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/orfig.cgi）。信号肽（signal peptide）预测利用SignalP 软件3.0 版16。转运肽的预测利用Target P1.1Server17（http：/www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/）；跨膜结构域用TMHMMServer v. 2.018（http：/www.cbs.dtu.dk/services/ TMHMM-2.0/）进行预测；用ProtScale（http：/web.expasy.org/protscale/）对疏水/亲水性进行预测；PSORT Prediction19 （http：/psort.hgc.jp/form.html）进行亚细胞定位分析。用SOPMA（https：/npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=/NPSA/npsa_sopma.html）观测其二级结构，功能域的预测用Pfam 27.0（http：/pfam.janelia.org/）和SMART （http：/smart.embl-heidelberg.de/）20进行；用SWISS-MODEL（http：/swissmodel.expasy.org）完成GGPS 蛋白高级结构同源建模；MEGA7.0 软件构建系统进化树。3 结果与分析3.1 唇形科植物牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶核苷酸序列的结构及其氨基酸序列的理化性质利用ORF Finder和ProtParam在线工具对唇形科9种植物GGPS氨基酸序列进行理化性质分析（表2）。可知其核苷酸序列的起始密码子均为ATG，终止密码子均为TGA。氨基酸残基（amino acids，aa）数在346379 aa；各蛋白序列的相对分子质量为37 424.341 299.7 kDa，中位值为39 408.66 kDa；理论等电点均在6 PI左右，平均6.33 PI，提示GGPS蛋白为酸性蛋白。从GGPS氨基酸组成中可以看到，9种植物的GGPS蛋白除SmGGPS3外，所含酸性氨基酸残基比例均高于所含碱性氨基酸残基比例，进一步提示GGPS蛋白为酸性蛋白。各种植物GGPS蛋白中，含量最丰富的氨基酸残基主要集中在亮氨酸（Leu）、丙氨酸（Ala）、缬氨酸（Val），均不含硒半胱氨酸（Sec）、吡咯赖氨酸（Pyl）。总原子数，消光系数，基本一致。除SmGGPS1，PbGGPS，LcGGPS1的不稳定系数小于40，为稳定蛋白，其他均为不稳定蛋白。 3.2 牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶的信号肽、导肽，跨膜结构域，疏水性/亲水性和亚细胞定位特征3.2.1 信号肽、导肽的预测和分析 信号肽（signal peptide）是分泌蛋白和膜蛋白以前体形式合成时在N端的1530个氨基酸序列21。导肽（leader peptide）是一段引导新合成的肽链进入细胞器的识别序列22，导肽的预测与分析对蛋白质的功能分析、作用机制和作用途径等具有重要意义23。信号肽属于导肽的一部分，位于靠近N端的一段氨基酸序列，导肽功能的发挥需要信号肽的存在24。利用在线工具SignalP 4.1 Server的神经网络算法对9种唇形科植物的GGPS蛋白进行信号肽的预测，结果表明丹参GGPS氨基酸序列中不存在信号肽，毛喉鞘蕊花和米团花GGPS氨基酸序列进行信号肽预测也得到相类似的结果。通过在线预测工具TargetP 1.1Server，对唇形科植物GGPS氨基酸序列进行了预测。以SmGGPS1为例，预测可能性是4，即可能含有低相似度的N端叶绿体转运肽（chloroplast transit peptide）。转运肽序列长52个氨基酸，剪切位点位于Ser52Ala53。无法确定SmGGPS1是否具有导肽，也未发现其导肽分裂位点。其他8种唇形科植物的GGPS预测分析结果显示，SmGGPS2的可靠性为5级，其余都在4级以上。LcGGPS4，LcGGPS5具有导肽分裂位点，具有导肽性，且它们的导肽很可能都是叶绿体转运肽，提示这些米团花中的GGPS蛋白合成后，可能转运到叶绿体中发挥作用。剩下与SmGGPS1相似，都不存在导肽分裂位点，不能确定具有何种导肽。3.2.2 跨膜结构域特征 跨膜结构域一般由20个左右的疏水性氨基酸残基组成，主要形成-螺旋，常由跨膜蛋白的效应区域所展現。利用在线工具TMHMM Server v.2.0对SmGGPS1蛋白进行跨膜结构进行预测，分析可知，其整条肽链都位于细胞膜之外，不存在跨膜结构。毛喉鞘蕊花和米团花GGPS蛋白跨膜结构域分析结果与丹参一致，提示本实验中的GGPS蛋白均不具跨膜结构域。信号肽是指导靶标蛋白质跨膜定位到膜上的N端氨基酸序列25-26，所以不含信号肽，理应无跨膜结构域，说明预测结果的合理性。3.2.3 蛋白疏水性/亲水性的预测 蛋白质亲疏水性氨基酸组成是蛋白质折叠的主要驱动力27，用Protscale在线工具预测亲疏水性，结果表明，SmGGPS1的多肽链中第167位氨基酸有最低的亲水性分值-2.911。位于260位氨基酸疏水性最强，其分值为2.544。其中，亲水性氨基酸占65%，疏水性氨基酸占35%。两端多亲水性氨基酸，中间多疏水性氨基酸，推测折叠的蛋白为亲水性蛋白。其余8种GGPS合酶的疏水性/吸水性都与SmGGPS1类似，这也与跨膜结构预测的结果相吻合。3.2.4 亚细胞定位特征 细胞中蛋白质在合成后被转运到特定的细胞器中，蛋白质的亚细胞定位分析及预测能极大的加速了蛋白质结构和功能的研究28。对9种唇形科植物的GGPS基因编码的氨基酸采用PSORT Prediction在线生物学工具进行亚细胞定位。结果表明（表3），SmGGPS1，PbGGPS，LcGGPS1，LcGGPS4，LcGGPS5位于膜结构上的可能性大于0.4；SmGGPS2，SmGGPS3位于线粒体基质上的可能性大于0.5；LcGGPS2，LcGGPS3位于细胞质的可能性大于0.4。3.3 二级结构预测蛋白质二级结构是指蛋白质多肽链氨基酸残基借助氢键折叠和盘绕形成的-螺旋、-折叠、无规则卷曲以及模体等组件，其中，-螺旋和-折叠是最常见的蛋白质二级结构。利用SOPMA对9种唇形科植物的GGPS合酶序列进行二级结构预测（表4），结果显示，唇形科GGPS合酶中均有-螺旋、-折叠、无规则卷曲和延伸链。以SmGGPS1为例，其主要结构元件是-螺旋（45.33%）和无规则卷曲（30.22%），其次是延伸链（18.13%）和-折叠（6.32%）。余下蛋白二级结构的主要结构元件与SmGGPS1完全一致。3.4 蛋白质功能域的预测和分析功能域（functional domain）又称结构域，是蛋白质分子中介于二级与三级结构之间的一种独立结构和功能单位，具有特定的生物学功能29-30。利用Smart在线软件对SmGGPS1蛋白的氨基酸序列进行功能域的预测和分析，结果表明（图1），SmGGPS1蛋白含有多聚异戊二烯基合成酶的活性结构域、2个天冬氨酸富集区结构域、活性位点残基盖结构域和镁离子结合位点结构域，其属于Isoprenoid_Biosyn_C1超家族，为类异戊二烯生物合成酶。对其他植物也进行了功能域的预测和分析，除SmGGPS3只有多聚异戊二烯基合成酶的活性结构域和底物结合位点外，其余唇形科植物的GGPS蛋白均存在上述结构域，这可能是由于SmGGPS3开放阅读框全长明显短于其他植物。3.5 GGPS蛋白三级结构的预测和分析蛋白质的三级结构是指蛋白质在其二级结构的基础上依靠氨基酸侧链之间的疏水相互作用、氢键、范德华力和静电作用等进一步盘绕、折叠所形成的天然构象。蛋白质的功能与其三级结构密切相关，对蛋白质高级结构的预测和分析，有助于理解蛋白质结构与功能之间的相关性31-32。利用同源建模工具SWISS-MODEL（http：/swissmodel.expasy.org）完成蛋白质三级结构的预测和分析工作，找到了模板蛋白（ACCESSION：5E8L_A；Sequence Idenity：76.87%；GMQE：0.73），再用Swiss Pdb-Viewer工具显示丹参GGPS1结构域的3D结构33-35。结果显示：SmGGPS1蛋白由12个-螺旋和一些不规则卷曲组成，与二级结构的预测结果一致-SmGGPS1主要结构单元为螺旋结构（图2）。 3.6 GGPS合酶的系统进化树分析来源于同一祖先的不同植物在进化过程中的关系可以通过进化树来描述，通过构建植物进化树，可以了解一种植物在进化过程中的地位36。用MEGA 7.0软件对唇形科在内的25种有代表性的GGPS合酶蛋白序列进行系统进化树构建（图3）。结果显示，来源于植物，细菌，真菌，动物的GGPS合酶按照不同类群分为4群，在进化遗传学上亲缘越近的物种，在GGPS合酶的分子系统进化树上距离较近，依据氨基酸序列所得出的系统演化关系虽不能真实的反映植物在漫长历史长河中的自然进化关系，其结果对判断不同植物之间的亲缘关系仍具有一定的借鉴意义37。4 讨论GGPP是合成赤霉素类、二萜类、胡萝卜素类物质的起始前体物，而GGPS则是合成GGPP的关键酶，在植物的次生代谢中，调控处于代谢分支点前体的代谢方向。一般认为二萜类化合物以质体来源GGPP为前体，已证明，在拟南芥中，质体定位的GGPS蛋白可为赤霉素、类胡萝卜素、脱落酸和叶绿素等物质的合成提供GGPP前体38；在辣椒中，GGPS被证明分别在果实成熟期和花发育过程中提供类胡萝卜素的合成前体39-40，在烟草中，GGPS则为烟草抗虫（烟草天蛾）物质 HGL-DTGs（17-hydroxygeranyllinalool diterpenoid glycosides）的合成提供前体41。此外，茉莉酸甲酯（MJ），已经验证其在曼地亚红豆杉、加拿大红豆杉和番茄等植物中可上调GGPS合酶的基因表达，对二萜类物质的产生具有促进作用。蛋白一级结构预测分析结构表明，GGPS蛋白为酸性，亲水性，多为不稳定蛋白，具有明显的疏水区和亲水区，不具有信号肽，可推测出GGPS可能不是分泌性蛋白，这与其都没有跨膜结构相对应。通过导肽分析发现，GGPS蛋白在细胞中的分布多样，说明其在细胞中广泛参与生物合成，参与的次生代谢是多样的。结合信号肽预测结果，可推知GGPS蛋白在游离核糖体上合成后，可能通过2种途径发挥作用，一是通过导肽进入叶绿体发挥作用；二是不进行蛋白转运，保留在细胞质基质中产生催化作用。GGPS蛋白的二级结构均以-螺旋为主要结构，无规则卷曲、延伸链和-折叠分布于整个肽链结构中。所有唇形科GGPS蛋白氨基酸序列中都含有多聚异戊二烯基合成酶的活性结构域和底物结合位点结构域，其属于Isoprenoid_Biosyn_C1超家族，为类异戊二烯生物合成酶。利用生物信息学的方法对唇形科GGPS氨基酸序列的生理生化特性进行预测和分析，可以为GGPS蛋白及其编码基因的克隆提供可靠的依据；对其序列结构的预测和分析，可为其蛋白表达与修饰提供指导；并为更多物种GGPS蛋白及其编码基因的克隆提供可靠的依据。对其二级及高级结构的預测和分析有利于深入探讨该酶结构和功能之间的关系、作用机制和代谢过程。参考文献1张利平， 程克棣， 朱平. 紫杉烷类化合物的生物转化J. 药学学报， 2004， 39（2）：153.2Du G H， Zhang J T. 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