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1、 异烟肼含量测定分析方法验证方案 验证原因： 验证类型： 新项目验证 再验证 其它 √ 预验证 回顾性验证 转移验证 √ 方法描述： 本分析方法为中国药典2010版二部方法。为确保其检测结果准确，对该分析方法的专属性、精密度（系统精密度、方法精密度、中间精密度）、线性和范围、准确度、耐用性进行评价。 验证依据： 中国药典2010年版分析方法（295页） 验证时间： 2010年07月09日～2010年07月10日 验证项目组成员及职责： 部门 成员 职责 QC 仪器
2、设备的确认 QC 分析方法编写 QC 分析测试 QC 数据评估 质量部 审核批准 验证内容:- 序列号 确认测试项目 可接受标准 01 01. 1 01. 2 仪器设备的确认 高效液相色谱仪的确认 天平的确认 符合仪器设备的确认要求 符合仪器设备的确认要求 02 02.1 具体测试内容 系统精密度 配置1份异烟肼工作标准溶液，连续进针6次，记录异烟肼峰面积、保留时间。 异烟肼峰面积RSD≤2.0%,保留时间RSD≤2.0%。异烟肼理论塔板数大于4000，拖尾因子在0.9～1.4之间。 02.2 方法精密度 平
3、行配制同一批样品的6份样品溶液，每份溶液进样2针，计算样品含量及其相对标准偏差。 样品含量的RSD≤2.0%。 02.3 线性和范围 以异烟肼工作标准品溶液的浓度为100%，配制20%、60%、100%、140%、180%浓度的工作标准品溶液，每个浓度的标准品溶液进样1次，计算出回归方程和相关系数R。 R≥0.999 02.4 准确度 以异烟肼工作标准品溶液的浓度为100%，取同一批样品，配制浓度为80%、100%和120%的样品溶液各3份，每份进样2针。计算其回收率。 该定量方法的回收率应为98.0%～102.0%。 02.5 耐用性 配制异烟酸和异烟肼混
4、合溶液，按下列条件改变方法，稳定后按顺序进样，计算异烟肼的理论塔板数，混合溶液中异烟酸和异烟肼的相对保留时间RRT。 a. 改变流速为0.9ml/min和1.1ml/min。 b. 改变柱温为23℃和27℃。 c. 改变流动相缓冲液与甲醇配比为83:17和87:13。 d. 同一填料不同色谱柱。 理论塔板数大于4000，拖尾因子在0.9～1.4之间,分离度R＞1.5，相对保留时间RRT偏差绝对值不大于20％。 03 03.1 03.2 03.3 03.4 程序及文件 液相色谱仪校正规程 液相色谱仪操作规程 分析天平校正规程 分析天平操作规程 符合要求 符合
5、要求 符合要求 符合要求 验证前准备： a) 人员培训： 培训人姓名 培训时间 培训内容 b) 仪器设备、标准品和试剂： 仪器设备 仪器名称 型号 编号 校验有效期 高效液相色谱仪 MODEL200 标准品和试剂 名称 级别 厂家 批号 c) 样品 名称 厂家 批号 验证过程： 色谱条件 色谱条件 色谱柱：agilent ODS-
6、2 长度：250cm ，内径：4.6mm ，填料 C18 ，填料粒度：5µm 检测波长：262nm，带宽30 柱温：25℃ 进样量：20µl 流速：1.0ml/min 流动相A：0.02mol/l磷酸氢二钠溶液（用磷酸调pH至6.0），流动相B：甲醇 A:B=85:15 停止时间：12min 1. 系统精密度 1.1. 溶液配制 系统精密度溶液：取异烟肼10mg，置100ml容量瓶中，精密称量，用水溶解并稀释至刻度。 1.2验证过程及结果 系统精密度溶液连续进样6次，记录其异烟肼峰面积、保留时间。 可接受标准：异烟肼峰面积RSD≤2.0%,保留时间RSD≤2.0%。
7、 序号 保留时间(min) 峰面积 1 2 3 4 5 6 RSD% 结论： 2. 重现性试验（方法精密度） 2.1. 溶液配制 2.1.1. 对照溶液：取异烟肼工作标准品10mg，精密称量，置100ml容量瓶中，用水溶解并稀释至刻度。 2.1.2. 方法精密度溶液：取异烟肼样品10mg置100ml容量瓶中，精密称定，用水溶解并稀释至刻度。用此方法配置同一批号的样品溶液6份。 2.2. 验证程序及结果 工作标准品溶液进2针，样品溶液各进2针。记录异烟肼峰面积，计算样品含量。 可接受标准：异
8、烟肼含量的RSD≤2.0%。 样品批号： 称样量（mg） 峰面积 含量％ RSD％ 1 2 平均值 结论： 3. 线性和范围 3.1. 溶液配制 3.1.1. a供试品溶液：取异烟肼50mg，置100ml容量瓶中，精密称量，用水溶解并稀释至刻度，混匀，即得。 3.1.2. 线性点溶液：精密移取a供试品溶液5ml、2ml、1ml、分别置10ml容量瓶中，用水稀释至刻度，得到浓度约为50ug/ml（d供
9、试品溶液）、100ug/ml（c供试品溶液）、250ug/ml（b供试品溶液）、500ug/ml （a供试品溶液）的线性点溶液，再精密移取1ml b供试品溶液1ml置100ml容量瓶中，用水稀释至刻度，得到浓度约为2.5ug/ml（e供试品溶液）。 3.2. 验证程序及结果 按色谱条件分别对线性点溶液进行分析，每个溶液进样1次。以浓度为X轴，主峰峰面积平均值为Y轴，画出线性图，求出回归方程，计算线性相关系数R。 可接受标准：R≥0.999 项目 （X1） （X2） （X3） X4） （X5） 线性点溶液浓度(ug/ml) 异烟肼峰面积
10、 线性范围（ug/ml） 线性回归方程 相关系数R 结论： 4. 准确度 4.1. 溶液配制 4.1.1. 对照溶液：取异烟肼10mg，置100ml容量瓶中，精密称量，用水溶解并稀释至刻度，混匀，即得。 4.1.2. 准确度溶液：以对照溶液浓度为100%，配置80%、100%和120%浓度的准确度溶液。即分别取同一批异烟肼样品8mg、10mg、12mg至100ml容量瓶中，精密称量，用水溶解并稀释至刻度。每个浓度的准确度溶液配制3份。 4.2. 验证程序及结果 按照色谱条件分别对对照溶液和准确度溶液进行分析，每个溶液各
11、进2针，按外标法计算准确度溶液中异烟肼含量，计算其回收率。 可接受标准：该定量方法的回收率应为98.0%～102.0%。回收率 RSD≤2.0%。 样品批号 相应含量 称样量（mg） 峰面积 实测量（mg） 回收率％ 1 2 平均值 80％ 100％ 120％ 结论： 5. 耐用性 5.1. 溶液配制 5.1.1. 混
12、合溶液：精密称取10mg异烟酸和10mg异烟肼样品置100ml容量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，混匀，即得。 5.2. 验证过程及结果 按下列条件改变方法，原条件溶液和改变色谱条件的顺序进样，计算异烟肼的理论塔板数,拖尾因子。计算相对保留时间RRT偏差绝对值。 a. 改变柱温为23℃和27℃ b. 改变流速为0.9ml/min和1.1ml/min。 c. 改变0.02mol/l磷酸氢二钠溶液(磷酸调pH至6.0)与甲醇配比为87:13和83:17。 d. 选用同一填料的两个不同色谱柱比较 可接受标准：理论塔板数大于4000，拖尾因子在0.9～1.4之间。分离度R＞1.5，相对保留时
13、间RRT偏差绝对值不大于20％。 条件 异烟肼理论塔板数 异烟肼拖尾因子 原条件 a 0.9ml/min 1.1ml/min b 23℃ 27℃ c 87:13 83:17 d 色谱柱1 色谱柱2 条件 异烟酸 RRT 偏差绝对值％ 原条件 a 23℃ 27℃ b 0.9ml/min 1.1ml/min c 87:13 83:17 d 色谱柱1 色谱柱2 结论：
14、 验证结论：验证结果见表 验证项目 可接受标准 验证结果 判定 系统精密度 异烟肼的峰面积及保留时间的RSD％均不大于2.0％。异烟肼理论塔板数大于4000。 方法精密度 RSD％不大于2.0％ 线性和范围 线性回归系数R应大于0.999 准确度 回收率在98.0％-102.0%之间 耐用性 理论塔板数大于4000，拖尾因子在0.9～1.4之间。分离度R大于1.5，相对保留时间RRT偏差绝对值不大于20％ 偏差及处理： 分析方法验证过程中出现的所有偏差都要记录并有效评估和处理。 再验证 再验证周期为3年。 验证负责人/日期 审核人/日期 批准人/日期
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