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实验七流式细胞仪检测技术
免疫细胞是一组不均一的细胞群体。各种特定的细胞群其细胞表面表达有各自特异的表面标志分子，运用这些特异的表面标志，可以鉴定、分离和纯化相应的细胞群。随着单克隆抗体技术的诞生和免疫标记技术（特别是荧光标记技术）的发展，以及计算机科学的应用，使运用仪器的方法检测特异的细胞膜表面分子成为也许。本章介绍的荧光激活细胞分类技术就是采用单克隆抗体技术和免疫荧光标记技术，并结合光学检测和计算机分析技术而产生的鉴定和分离特定细胞亚群的技术。
实验原理
流式细胞仪（flowcytometer）是一种可以探测和计数以单细胞液体流形式穿过激光束的细胞检测装置，由于在检测中使用的细胞标志示踪物质为荧光标记物，因此，用来分离、鉴定细胞的流式细胞仪有被称为荧光激活细胞分类仪（fluorescenceactivatedcellsorter,FACS）,是分离和鉴定细胞群及亚群的一种强而有力的应用工具。其原理是在一组混合的细胞群中，加入特异的针对特定靶细胞表面分子的荧光标记单克隆抗体，这种特异单克隆抗体与其相应的抗原靶分子结合，结合后的荧光标记抗体停留在特定细胞的表面，称为荧光抗体标记的靶细胞；将具有被标记细胞的混合细胞群混悬在一定容积的上样缓冲液中，再通过FACS的进样吸管孔，仪器就会将细胞悬液制成以单细胞排列的微细流束。当每一个细胞通过仪器的激光束照射时，带在细胞上的荧光就会被相应的激光束激活并发出相应的荧光，通过敏感的光电倍增管即可检测到从细胞表面发出的荧光。根据测得的散射光（scatteredlight）可得到细胞大小及颗粒状态的信息；而从荧光的发射强度(fluorescenceemissions)则提供了结合在细胞上的抗体信息，进而也被反映了该细胞表面相应分子的表达情况。
在流式细胞仪分离装置中，返回到计算机的信号，可用来产生一种电荷，这种电荷以特定准确的时间通过FACS的吸管孔，在与吸管孔的液体流相相遇时，可将液体流打坏成只含一个细胞的微滴。具有电荷的微滴就会从主液体流中偏移，穿过一双极板。带正电荷的微滴被吸引至阴极，而带负电荷的被吸引至阳极。以这种方式特定的细胞亚群由于标记着不同的荧光抗体而带有不同的电荷，从而将目的细胞从混合的细胞群中分拣出来。
实验应用
流式细胞仪重要有两个最基本的用途：第一是可以定量分析鉴定活细胞表面表达的特异分子，第二是进行特定的活细胞群的分离和纯化。
1. 免疫细胞群的分类静止淋巴细胞之间从其外观形态难以区分，都是以致密的核及少量细胞质组成的小而圆的细胞为特性。然而，这些细胞确是由功能各异的不同细胞亚群所组成，各种细胞群表达各自特殊的表面分子。例如,B淋巴细胞上表达有特异的膜表面免疫球蛋白（mIg），而成熟的T淋巴细胞表面表达特异的CD3分子。T淋巴细胞又可进一步按其表达的不同表面标志细提成不同的亚群，如CD4+CD8-和CD4-CD8+亚群。因此，可由这些特性性的表面标志，将细胞分为不同的群或亚群。
2. 免疫细胞的分化发育免疫细胞分化发育的不同阶段，其表面标志也在不断地发生着变化。如胸腺细胞（发育过程中的T淋巴细胞），在发育的不同阶段从不成熟到成熟，其表面标志经历了从双阴性（CD4-CD8-）到双阳性（CD4-CD8-），直到单阳性（CD4+CD8-或CD4-CD8+）的过程。正常生理状态下，发育不同阶段的胸腺细胞以一定的比例存在于胸腺中。通过检测这些标志，即可鉴定某些因素（基因突变等）对胸腺细胞发育的影响。
3. 免疫细胞的分子表达免疫细胞的不同因素的影响下，其表达的分子也会发生变化。通过检测这些分子的变化，可分析细胞功能以及细胞分化状态等。例如，静止的T淋巴细胞不表达或低水平表达CD69分子；而一经活化，其表达CD69分子数量明显增长。因此，可通过检测这些活化标志的变化来鉴定细胞状态以及研究影响细胞活化状态的因素。
4. 免疫细胞的分离如前所述，免疫细胞是一组极不均一的群体。所以在研究免疫细胞功能时，经常需要把某些特异的细胞分离和纯化。虽然免疫细胞分离的方法很多，但用FACS来纯化特定的细胞群是目前最为有效和方便的手段。例如，最近颇受关注的CD4+CD25+T淋巴细胞是一群具有免疫调节（免疫克制）功能的细胞群。在对其特点及功能进行研究时，首要的问题是分离该细胞群。用相应的单克隆抗体与其结合，再用FACS进行分离，就能得到纯度很高CD4+CD25+T淋巴细胞细胞群。而其他分离方法不仅分离过程烦琐，也很难控制无菌条件及保证细胞纯度。
实验方法
流式细胞仪的使用一般分为三个环节。第一，是仪器前阶段，涉及试剂的准备，细胞制备、细胞的荧光染色；第二，是流式细胞仪阶段，重要是仪器的操作；第三，是结果分析阶段。
（一） 细胞和试剂的准备
材料
（1）细胞样品：来源淋巴细胞或外周血的白细胞。
（2）荧光标记单克隆抗体：常用的有FITC（fluorescein-isothiocyanate）和PE(phycoerythrin)标记的单克隆抗体。
（3）封闭抗体：抗Fc受体抗体
免疫细胞表面一般表达有Fc受体，能和抗体的Fc段结合。封闭抗体的作用就是阻断荧光标记的单克隆抗体的Fc段与免疫细胞表面Fc受体结合所产生的非特异性的结果。
（1） FACS缓冲液：
1×PBS950ml
FCS40ml
10%叠氮钠溶液10ml
（2） 仪器缓冲液（FACS-flow）：仪器厂家提供
（3） FACS清洁液（FACSclean）和FACS洗净液（FACSrinse）：仪器厂家提供。
操作环节
（1） 单细胞悬液的制备：将1×105~1×107的细胞放入1.5ml离心管中3000r/min离心5分钟，弃上清；加入FACS缓冲液100μl悬浮细胞。
（2） 封闭细胞表面Fc受体：在环节1中加入Fc受体抗体0.5μl（0.5mg/ml），水浴3分钟。
（3） 细胞与荧光抗体结合：在环节2中加入荧光抗体1μl（0.5mg/ml），水浴30分钟。
（4） 洗细胞去除游离的荧光抗体：在环节3中加入FACS缓冲液350μl，轻轻混匀，3000r/min，离心5分钟，弃上清，反复环节（4）2次。
（5） 上样前解决：取100μl仪器缓冲液加入环节（4）获得的细胞沉淀中，轻轻混匀悬浮细胞，将细胞悬液移入FACS专用管中，准备进行仪器检测和分析。
（二） 仪器的操作
以FACSCaliburTM(BDBiosciences)仪器为例。仪器重要分为主机部分（涉及激光激活源，射流，射线探测器）和计算机部分（CELLQuestsoftwere）。仪器的操作分为使用前的准备、使用中的操作和使用后的清洗。
1.使用前的准备
（1）打开电源：涉及系统电源和主机部分电源。
（2）检查供液槽和废液槽：供液槽应含足够的仪器缓冲液，废液槽应在上次使用后清洗干净。
（3）使机器处在负亚状态，才干使细胞悬液被吸入至机器的吸管口。
（4）机器处在可应用状态时，指示灯会变成绿色。
2.使用中的操作
（1） 计算机部分——使用CELLQuest程序系统软件：
设定所要检测细胞的数量：一般设10000~20230个细胞。
命名本次实验：一般含使用者的姓名和实验日期。
打开记数部分：显示进入的细胞数以及检测一定量的细胞所需要的时间。
将微机与主机连接：控制检测时的预检测和实际检测。
主机设定：一般是已设定好的适合测定淋巴细胞的条件，涉及探测器的电压。探测器的电压是调空光电倍增管所能检测荧光密度的范围。
选择检测的波长和表达方式（plot）：假如用一种荧光抗体，一般选直方图（histogram）(表11-1)：假如用两种荧光抗体，常选点状二维图（dotplot）或轮廓线图（contourplot）表
CD69分子表达检测直方图的数值说明
a.anti-CD3(-)检测结果
marker
Left,right
events
%gated
%total
mean
Geo,mean
CV
median
PeakCh
All
1,9910
10000
100.00
100.00
12.06
4.59
1453.37
3.22
1
M1
1,105
9969
99.69
99.69
8.04
4.53
134.41
3.22
1
M2
105,9910
31
0.31
0.31
1304.57
309.78
223.13
164.00
112

b.abti-CD3(2ng/ml)检测结果
marker
Left,right
events
%gated
%total
mean
Geo,mean
CV
median
PeakCh
All
1,9910
10000
100.00
100.00
200.53
48.90
193.68
61.53
1
M1
1,100
5776
57.76
57.76
24.41
11.69
109.22
12.86
1
M2
100,9910
4237
42.37
42.37
440.31
344.57
114.76
361.90
417

c.abti-CD3(10ng/ml)检测结果
marker
Left,right
events
%gated
%total
mean
Geo,mean
CV
median
PeakCh
All
1,9910
10000
100.00
100.00
236.90
74.05
155.88
113.42
495
M1
1,90
4602
46.02
46.02
25.13
12.83
101.67
14.42
1
M2
90,9910
5425
54.25
54.25
415.81
327.83
102.28
349.12
495

CD4及CD8细胞点状二维图结果
quad
events
%gated
%total
Xmean
Xgeo.mean
Ymean
Ygeo.mean
UL
1614
16.14
16.14
3.68
2.99
346.86
291.03
UR
7425
74.25
74.25
99.38
76.39
308.36
256.26
LL
558
5.58
5.58
4.00
3.39
9.91
6.88
LR
403
4.03
4.03
123.32
93.65
7.14
4.35

不同的荧光物规定选择不同的激发波长，参见下表
用于FACS的荧光物
荧光物
激发波长（nm）
FITC
525(green)
PE
575(orabge-red)
RED613
610(red)
PI
620(red)
PerCP
650(red)
TRI-COLOR
650(red)
CyChrome
670(red)
(2)细胞的吸入：将装有细胞的FACS测定管放置到机器吸管孔处。
先预检测样品，然后进行实际检测。可根据细胞的浓度选择测定的速度（低、中或高）。所有的数据将自动存入微机。
3.使用后的清洗所有样品测定完后，要进行仪器的清洗。
（1）将装FACS清洁液的FACS管放置机器吸管孔，高速吸入1分钟。
（2）将装FACS洗净液的FACS管放置机器吸管孔，高速吸入1分钟。
（3）再将装FACS清洁液的FACS管放置机器吸管孔，高速吸入5分钟。
（4）同样再将装FACS洗净液的FACS管放置机器吸管孔，高速吸入5分钟。
（5）最后将一装有双蒸水的FACS管放置机器吸管孔后，关闭机器。
（6）将废液槽中的废液倒掉，并清洗干净废液槽。
应用举例
(一)小鼠胸腺细胞CD4及CD8分子表达的检测
a.简要说明
(1)细胞为小鼠胸腺细胞。
(2)抗体为PE标记的抗CD4抗体和FITC标记的抗CD8抗体。
b.结果以点状二维图（dotplot）表达，见表11-2。横坐标为CD8分子，纵坐标为CD4分子。所以右上代表双阳性细胞群，左下代表双阴性细胞群，左上代表CD4+CD8-的单阳性细胞群，右下代表CD4-CD8+单阳性细胞群。
c.结果分析胸腺中存在着发育不同阶段的胸腺细胞，这些发育不同阶段的胸腺细胞表达CD4及CD8分子存在着差异。上面的结果是正常小鼠胸腺细胞CD4及CD8分子的表达情况：①存在着4种亚群：CD4-CD8-的双阴性细胞群（5.6%），CD4+CD8+的双阳性细胞群（74.3%），CD4+CD8-的单阳性细胞群（16.1%）和CD4-CD8+的单阳性细胞群（4.0%）；②在这4种亚群中以CD4+CD8+的双阳性细胞群为主（75%）。
(二)小鼠脾细胞中T细胞和B细胞的组成
1.简要说明
（1） 细胞为小鼠脾细胞
（2） 抗体为PE标记的抗CD3抗体和FITC标记的抗CD45R抗体
2.结果以点状二维图表达，见表11-4。横坐标为B220分子，纵坐标为CD3分子。因此，左上为T细胞群，右下为B细胞群。
3.结果分析在脾脏中重要存在有两大类淋巴细胞群——T细胞和B细胞。其中B细胞占60%左右，T细胞占30%。
B220及CD3细胞点状二维图结果
quad
events
%gated
%total
Xmean
Xgeo.mean
Ymean
Ygeo.mean
UL
3067
30.67
30.67
2.36
2.08
87.39
50.96
UR
371
3.71
3.71
183.95
86.41
1888.23
141.27
LL
619
6.19
6.19
3.77
3.23
3.82
3.07
LR
5943
59.43
59.43
215.54
186.49
1.91
1.60

(三)活化T细胞CD69分子的表达
1.简要说明
（1） 成熟T细胞来自正常小鼠脾脏，经纯化而获得，通常情况下T细胞处在静止状态，而在不同浓度的抗CD3抗体的刺激下T细胞活化。
（2） 抗体为FITC标记的抗CD69抗体。
2.结果以直方图表达，参见表11-1。横坐标为荧光的强度，纵坐标为具有相应荧光强度的细胞数。
3.结果分析在没有抗CD3抗体刺激时，绝大多数处在静止状态的T细胞不表达CD69分子（CD69+0.3%）；在2μg/ml抗 CD3抗体刺激下，42.4%的T细胞表达CD69分子；在10μg/ml抗CD3抗体刺激下，54.3%的T细胞表达CD69分子。说明静止的T细胞不表达或表达较少的CD69分子，而活化的T细胞则表达高水平的CD69分子，并且该分子的表达随着活化的强度而增长。因此，检测CD69分子可作为T细胞活化的标志。
关键点
(1)减少非特异荧光染色
细胞的活性和状态：流式细胞仪不仅可探测细胞表面的荧光，也可探测细胞内的荧光。因此假如要检测细胞表面的分子，一定要保证细胞的活性，还应尽也许保持细胞静止，通常在4度进行操作。否则，荧光抗体进入死细胞内，会产生非特异结果。
封闭抗体的应用是必不可少的，由于大多数的免疫细胞表面都表达有Fc-R。细胞与抗体互相作用后，一定要用FACS缓冲液洗2~3次，以除去游离的抗体。
(2)单染色时以FACS最常用，FITC标记抗体荧光比较稳定并且价格合适。
(3)假如同时要检测两种以上的分子，一定要选择不同波长的荧光所标记的抗体。
实验八杀伤细胞功能的检测
杀伤功能是机体免疫功能的一个重要方面，免疫系统中有多种具有杀伤功能的靶细胞，如自然杀伤细胞（NK）、细胞毒性T细胞（CTL）具有ADCC作用的单核细胞巨噬细胞等。在体外，多种细胞因子（如IL-2）可明显促进某些效应细胞的杀伤功能（如LAK），此外，通过辨认靶细胞某些膜分子的抗体可介导重导向杀伤功能。本章重要介绍NK、LAK和重导向杀伤实验。由于混合淋巴细胞培养（MLC）可诱导出NK、CTL和LAK靶细胞，因此在本章一并介绍。
一.自然杀伤细胞（NK）和淋巴因子激活杀伤功能（LAK）的检测
原理
NK细胞存在于人或动物外周血、脾脏、淋巴结和骨髓中，能杀伤某些肿瘤细胞、病毒感染靶细胞，无需抗原或有丝分裂原刺激，也不依赖抗体或补体，在机体杀伤肿瘤、防御感染及免疫调节中发挥重要作用。
LAK是NK或T细胞在体外高剂量IL-2诱导下，获得能杀伤NK抵抗的肿瘤细胞的功能，在过继免疫治疗肿瘤中已得到广泛的应用。
通过将同位素51Cr掺入到NK的靶细胞K562（红白细胞白血病细胞）或LAK的靶细胞Libr（黑色素瘤细胞），按一定细胞比例与效应细胞（NK或LAK）孵育4小时，根据细胞上清中靶细胞被杀伤后所释放的51Cr水平计算出杀伤细胞的杀伤活性。
试剂和器材
1.细胞系：K562、LiBr
2.10%FCSRPMI1640
3．rHuIL-2
4.3H-TdR、51Cr
5．培养瓶、培养板、CO2孵箱、离心机
6．β-液闪仪、γ-计数仪
操作环节
1． 效应细胞的制备
NK功能效应细胞可取静止的PBMC，或经不同细胞因子诱导的PBMC。
LAK功能的效应细胞通常将PBMC或肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）或体液（癌性胸腺水）中分离的淋巴细胞（1106/ml）在具有高剂量IL-2（200~1000ul/ml）的10%FCSRPMI1640诱导2~5d而成。
2． 杀伤实验
重要有51Cr4h释放法和3H-TdR释放法，前者操作时间短，非常敏感；后者需要无菌操作，所需时间较长。
（1） 51Cr4h释放实验：
①收获处在对数生长期的靶细胞（K562、LiBr等），洗涤后调整细胞浓度为2×106/ml
②取1×106细胞（0.5ml），加Na251CrO4100uCi,37度孵育2~3h，每15min轻轻振摇一次。
③用10%FCSRPMI1640洗涤3次，每次800rpm、5min。
④重悬细胞浓度1×105/ml。
⑤96孔v型或U型培养板中，每孔加100ul（1×104细胞），设3个复孔。
⑥每孔加入100ul不同细胞浓度的效应细胞，最大释放组加入100ul1%TritonX-100；自然释放组加100ul完全培养基。
⑦200g离心1min。
⑧37度、CO2孵箱培养4h。
⑨200g离心1min。
⑩每孔取出100ul上清，β计数仪测定值。
计算：特异性杀伤率（%）=（实验组cpm-自然释放cpm）/（对照组-自然释放cpm）
（2） 3H-TdR释放实验
①收获处在对数生长期的靶细胞（K562、LiBr等），洗涤后调整细胞浓度为2×106/ml，加3H-TdR20uCi。
②7度孵育2~3h。
③用10%FCSRPMI1640洗涤3次，每次800rpm、5min，调整浓度为1×105/ml。
④96孔U型或平底培养板中，每孔加100ul（1×104细胞），设3个复孔。
⑤每孔加入100ul不同细胞浓度的效应细胞，最大释放组加入100ul1%TritonX-100；自然释放组加100ul完全培养基。
⑥CO2孵箱培养18~24h。
⑦每孔取出100ul上清，加入胰蛋白酶（终浓度0.15%）和DNA酶（终浓度为0.0125%）
⑧继续孵育30min。
⑨用细胞收集仪收获于玻璃纤维纸上。
⑩烤干后，β计数仪测定值。
计算：特异性杀伤率（%）=（1-实验组cpm/对照组cpm）×100%
（二） 注意事项
1．每次实验最佳取3~4个不同的效应细胞/靶细胞比例，常用效靶比例为100：1、50：1、25：1、12.5：1。
2．诱导LAK细胞过程中要注意无菌操作。
3．避免同位素污染。
根据实验需要，可采用纯化的NK细胞作为效应细胞，常用Percoll不连续密度梯度离心纯化NK细胞（见表）。
用Percoll不连续密度梯度离心纯化人NK细胞

加样细胞
梯度顺序
1
2
3

4
5
Percoll浓度（%）

40.0
42.5
45.0
47.5
50.0
细胞回收率（%）
100
1.6
3.5
8.5
28.5
21.5
LGL（%）
12
5
82
74
7
2
LU/107细胞
42
16
192
143
4
1
1个溶解单位（Lyticunit,LU）为一定效应细胞30%溶解（杀伤）5×103/靶细胞（K562）的水平。
如需进一步纯化LGL，可通过除去具有高亲和性羊红细胞受体细胞（T细胞），由于NK细胞只具有低亲和性的绵羊红细胞受体（ER）。具体方法是将Percoll分离的位于第2、3梯度间的细胞洗涤后，调整细胞浓度为5×106/ml，移入试管，加入2mlFCS和2ml1×108/mlSRBC，100g离心5min，29度孵育1h，轻轻重悬细胞，叠加于3mlFicoll上，400ug室温下离心30min，界面不形成花环的细胞即为LGL，纯度可大于90%。
在用PBMC作为效应细胞进行NK活性测定期，如想除去PBMC悬液中混杂的红细胞，可用蒸馏水低渗的方法除去红细胞，而不用NH4Cl方法，由于后者可减少NK功能。
在小鼠NK实验中必须注意小鼠的品系和周龄。
不同小鼠系NK活性的差别
NK高水平系
CBA/J
C3H/J
C57BL/6
C57BL/10
DBA2
NK低水平系
A/Sn
A/J
AKR
SJL
BALB/c
三周内或3月龄以上小鼠的NK水平一般很低。
二、混合淋巴细胞培养
混合淋巴细胞培养（MLC）或称混合淋巴细胞反映（MLR）以往为用于器官移植前的组织配型，以测定受体和供体重要组织兼容性抗原（HLA抗原）兼容的限度。由于MLC中淋巴细胞接受同种异型抗原的刺激而发生活化、增殖，产生种类众多的细胞因子，促进NK、LAK和CTL等杀伤细胞的分化，因此MLC又是免疫调节研究中常用的实验模型。
原理
两个无关个体功能正常的淋巴细胞在体外混合培养时，由于HLAⅡ类抗原不同，可互相刺激对方的T细胞发生增殖，此外双向混合淋巴细胞培养（twowayMLC）；若将其中一方的淋巴细胞先用丝裂酶C解决或射线照射使之细胞中DNA失去复制能力，但仍能刺激另一方淋巴细胞发生转化，称为单向混合淋巴细胞培养（onewayMLC）。两个个体间HLA抗原差异限度越大，反映越强烈，可通过细胞数量、形态检查或3H-TdR掺入率检测反映细胞的增殖水平。EB病毒转化的B淋巴细胞表达高水平的HLAⅡ类抗原，常作为单向混合淋巴细胞培养中的刺激细胞。
试剂器材
1．细胞：刺激细胞N23细胞系，反映细胞：外周血单个核细胞。
2．10%FCSRPMI1640培养基。
3．照射源：60Co装置
4．细胞培养瓶、培养板、滴管、吸管等。
5．CO2孵箱、超净台。
操作环节
1．刺激细胞的准备：常用的刺激细胞有EB病毒转化的B淋巴细胞（如N23细胞）或PBMC。取处在对数生长期的N23细胞，离心后重悬于新鲜完全培养基中，调整细胞数为1×106/ml~2×106/ml，移置于塑料培养瓶或者50ml离心管中，用60Co照射3000rad。
2．反映细胞的准备：分离纯化待检个体的PBMC。
3．LC：按2×106PBMC与1×105经3000rad照射的N23细胞的比例，重悬于4ml10%FCSRPMI1640,放置于小培养瓶中进行MLC，培养瓶保持直立，培养4d内不要晃动，第5d加入1ml新鲜培养基。如要测定3H-TdR掺入率，一般可在MLC的第5d进行；如要检测MLC中NK、LAK或特异性杀伤性T淋巴细胞（CTL），一般在7~10d左右收获效应细胞。杀伤细胞功能检测参见本章“自然伤细胞和淋巴因子激活的杀伤细胞的杀伤功能”，所不同的是CTL的靶细胞选用作为刺激细胞的N23细胞。
注意事项
1．注意无菌操作
2．刺激细胞接受照射剂量要准确，是细胞暂时存活，但失去增殖的能力。
3．可用RAJI或Daudi细胞作为刺激细胞，也可将不同的细胞混合作为刺激细胞。不同刺激细胞与反映细胞的合适比例有所不同，应做预实验选择最佳的实验条件。

实验九吞噬功能实验
一．中性粒细胞吞噬功能测定
试剂与材料2g/LNBT盐水（室温搅拌1小时或80度水浴中搅拌溶解，滤纸过滤，4度保存有效期3~6个月），用时与Ph7.20.15mol/LPBS等量混合，即为工作液。肝素、甲醇溶液、10g/L沙黄水溶液、小试管、毛细滴管、玻片、温箱以及显微镜等。
实验环节采用硝基蓝四氮唑还原实验。
（1） 试管法：
肝素抗凝血0.1ml滴于小试管底部，再加入等量NBT应用液

37度，30分钟（中间摇动一次），再置室温15分钟

摇匀，用毛细管取一滴放于玻片一端，做血涂片

立即用电吹风吹干，甲醇溶液固定1分钟，10g/L沙黄水溶液染色5分钟

PBS冲洗、自然干燥、油镜检测
(2)微量法：
取硅油解决的1mm×75mm的毛细管取末梢血至30mm处

立即吹入硅油解决的凹玻片中，与1/30量的0.05%肝素溶液混合

加等量的1g/LNBT，轻轻摇动混合，湿盒内，37度，室温15分钟

用毛细管吸去表层上清液，用硅油解决的毛细管吹数次混匀

吸出少许制成血片，空气干燥，沙黄水溶液染色，油镜观测
实验结果血片中有10%以上的中性粒细胞的胞质中有蓝紫或蓝黑颗粒沉着，其沉着颗粒形状大小不一，有的呈大块状，有的呈点状或放射状。
关键问题NBT配制一定要完全溶解，滤液要呈透明的淡黄色，储存于棕色瓶中，NBT应用液应于用前配制。血涂片规定推出尾部，不可过厚或过薄。血液与NBT要充足混合，保温时间不能过长。
二．小鼠巨噬细胞吞噬功能测定
试剂与材料：
昆明种小鼠（体重18－22g）、用生理盐水配制的10g/L淀粉溶液、2％鸡红细胞、肝素注射液、瑞士－姬姆萨染液、注射器、毛细管、解剖用品。
实验环节：
小鼠腹腔注射10g/L淀粉溶液2ml
↓
24h后，小鼠腹腔注射2％鸡红细胞1ml
↓
30min后，小鼠脱臼处死，腹腔内注射0.2ml肝素注射液，揉动腹部
↓
毛细管吸取腹腔液，滴一滴于玻片上，将毛细管平放于液滴上展开液滴，自然干燥
↓
瑞士－姬姆萨染液染色5min，pH7.2PBS浸泡5－6min自然干燥后，油镜观测
结果鉴定观测巨噬细胞吞噬鸡红细胞的情况计数200个局势细胞，以及其中吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数，计算吞噬百分率。

三、人巨噬细胞吞噬功能测定
实验材料
（1）斑蟊浸液制备：斑蟊以95％乙醇溶液制成10％酊剂，室温下浸泡2周后使用。
（2）人巨噬细胞的获取：取滤纸片蘸斑蟊酊，置于一侧前臂皮肤上，在滤纸片上盖一塑料片，再以清洁纱布固定4～5小时，取下滤纸片，再用塑料瓶盖将局部罩上，以防形成的水疱破裂，48小时即可形成完整的水疱。
实验环节
取水疱渗出液0.5ml，加5％鸡红细胞悬液0.01ml
↓
混匀，置37℃水浴30分钟（每10分钟轻轻摇摆一次）
↓
1000r/min离心5分钟，弃上清，留少许液体混匀细胞涂片
↓
用甲醇溶液固定后，用瑞士－姬姆萨染色，油镜观测
关键点细胞涂片要轻，以免推破巨噬细胞。涂片不可过厚或过薄，以免影响观测结果。
斑蟊酊剂皮肤炎性渗出液大多再1～ml，最多的可达6ml，渗出液中所含巨噬细胞平均为30％～40%，最多可达80％。抽取水疱液时，将皮肤消毒后，用无菌注射器抽取，盛于无菌试管中；局部敷以无菌纱布，24小时后取下纱布。用此方法病人无痛苦及不良反映。
实验十细胞因子活性检测
检测细胞因子对阐明机体免疫应答及其调节机制、免疫相关疾病的发生、发展规律和知道临床治疗均具有重要意义。细胞因子的检测重要分为免疫学、生物学和分子生物学三种检测方法。免疫学方法重要采用双位点ELISA法定量检测细胞因子，分子生物学方法重要检测细胞因子mRNA表达水平。本部分只介绍生物学方法检测细胞因子活性，其原理是根据细胞因子对特定的依赖性细胞株（即靶细胞）的促增殖作用，以增殖细胞中的DNA合成或酶活性为指标，间接推算出细胞因子的生物学活性单位。
一、IL-1生物学活性检测
白细胞介素-1（IL-1）重要是由活化的单核-巨噬细胞合成和分泌的一种细胞因子，具有活化淋巴细胞、协同刺激胸腺细胞增殖、参与抗体产生和促炎症反映等多种生物学功能。IL-1有IL-1α和IL-1β构成，结协议种受体，表现相同的生物学活性。用于检测IL-1生物活性的方法有多种，如小鼠胸腺细胞增殖法、D10G4.1细胞增殖法、EL-4细胞测定法等。
小鼠胸腺细胞增殖法
IL-1与小鼠胸腺细胞共同培养时，IL-1可刺激小鼠胸腺细胞增殖。进一步通过3H-TdR掺入法或染料摄入法鉴定小鼠胸腺细胞增殖量，推定IL-1的生物学活性。通过检测IL-1的生物学活性，可了解单核-巨噬细胞等的功能。
试剂与材料
（1）10%FCS-RPMI-1640培养液。
（2）LPS用10%FCS-RPMI-1640配制10ug/ml。
（3）刀豆蛋白A（ConA）用10%FCS-RPMI-1640配制2.5ug/ml。
（4）3H-TdR
（5）C57BL小鼠，6~10周龄，雌雄均可。
操作流程
（1）小鼠巨噬细胞产生IL-1的诱导
①常规收集小鼠腹腔巨噬细胞，10%FCS-IMDM培养液悬浮细胞2×106/ml，接种于24孔培养板，0.5ml/well。
每孔加20ug/mlLPS0.15ml，37度，5%CO2孵育36~48小时。
③此时培养上清内含巨噬细胞分泌的高水平IL-1，收集培养上清，12023r/min离心15分钟，将上清移入新的1.5ml试管中，-20度冻存。
（2）IL-1的生物学活性测定
①胸腺细胞的制备：颈椎脱位处死小鼠，无菌取胸腺至于平皿中，加入5ml10%FCS-IMDM培养液，200目不锈钢网制成单个细胞悬液；1500r/min离心10分钟，再用5%Hank’s液洗涤细胞2次后，重悬于10%FCS-IMDM培养液中，调细胞浓度为1.0×107/ml。
②加样：取胸腺细胞加入96孔细胞培养板，0.1ml/well。再加入IL-1待测样品或IL-1标准品，50ul/well，实验孔再加入50ulConA（终浓度0.625ug/ml），同时设培养液对照孔（0.1ml细胞+0.1ml培养液）、ConA对照（0.1ml细胞+50ul培养液+50ulConA），均设3复孔。37度，5%CO2孵育36~60小时。
③3H掺入：每孔加1.85×1010uBq/20ul（0.5uCi/20ul）3H-TdR，继续培养8小时。
④测定：多孔细胞收集器收集细胞于玻璃纤维滤纸上，用β液体闪烁仪测定3H-TdR
掺入量（cpm）以净cpm值（实验孔-ConA对照孔cpm值）为纵坐标，相应的不同稀释浓度IL-1标准品为横坐标，在半对数图纸上绘制出标准曲线，再从标准曲线上查出待测样品中的IL-1含量。
关键点
（1）吸取LPS刺激的小鼠巨噬细胞培养上清时，必须离心，以除去细胞及细胞破碎成分。
（2）ConA应选择淋巴细胞转化实验的亚剂量，即选择可以激活胸腺细胞，又不引起明显增殖的量，假如ConA过量，则不能有效反映IL-1的刺激活性。
二、IL-2生物学活性检测
白细胞介素-2（IL-2）是由活化的辅助性T细胞分泌的一种细胞增殖因子，具有促T细胞增殖和维持T细胞体外长期生长的作用。CTLL-2为IL-2依赖细胞株可用作IL-2生物学活性定量检测。本实验采用MTT分析法，通过测定CTLL-2细胞的增殖量，拟定IL-2生物学活性单位。检测IL-2的生物学活性，可以间接了解辅助性T细胞的功能。
试剂与材料
（1）1）10%FCS-RPMI-1640培养液，含2mmol/L谷氨酰胺、25mmol/LHEPES、10U/ml青霉素、100ug/ml链霉素。
（2）MTT（4，5-dimethythiazoyl-zyl2,5-diphenylterrajoliumbromiole）用PBSA缓冲液配制成1mg/ml浓度工作液，4度避光保存。
（3）IL-2标准品。
（4）PHA（200ug/ml）。
操作流程
（1）人外周血T细胞分泌IL-2的诱生：
①人PBMC分离：采用常规淋巴细胞分层液浓度梯度离心法分离PBMC，用10%FCS-RPMI-1640培养液调整细胞浓度为
加样：接种细胞悬液于24孔培养板，每孔0.5lml，每孔再加PHA0.5ml，37度，5%CO2孵育48小时。
③回收上清：吸出细胞培养上清，12023r/min离心15分钟，收集上清，-20度冻存。
（2）IL-2生物活性测定
①CTLL-2细胞制备：取传代培养24~48小时对数生长期的CTLL-2细胞，用培养液离心洗涤2次，每次1000r/min离心5分钟，再用10%FCS-RPMI-1640培养液调制细胞浓度为1×105/ml。
②加样：将细胞接种于96孔培养板，每孔0.1ml。同时将待测样品和标准品做倍比稀释，每孔加入0.1ml，每个稀释浓度均设3复孔。另设培养液对照孔（100ul细胞+100ul培养液）。37度，5%CO2孵育40小时。
③MTT掺入：轻轻吸取上清液100ul，加MTT（1mg/ml）100ul，37度，5%CO2孵育2小时。
④测定：离心培养板，2023r/min，5分钟，吸弃上清液，每孔加100ulDMSO，作用30分钟，用酶标测定仪于波长570nm测吸光值（A）。
⑤计算：用标准品浓度和相应的净A570nm值（实验孔-阴性对照孔的A570nm值）绘制标准曲线。根据标准曲线求出待测样品IL-2水平。
关键点
（1）CTLL-2细胞存活率应大于95%。
（2）因标本中含IL-4等，可影响IL-2的测定，最佳采用抗IL-4mAb吸附剂除去IL-4。
三、IL-4生物学活性检测
IL-4重要是由TH细胞活化后产生的一种细胞因子。CT.4S细胞为IL-4的依赖细胞株，对IL-2呈现低反映性，其增殖反映与IL-4的活性呈正相关系。检测IL-4的生物学活性水平，可间接了解TH2细胞及与抗体介导的一些体液免疫的功能。
试剂与材料CT.4S细胞株，A23187（钙离子载体）（用生理盐水配制成0.1ug/ml浓度）。其他同IL-2测定。
操作流程
（1）IL-4诱生
①人PBMC分离：淋巴细胞分层液常规分离PBMC，用10%FCS-IMDM培养液调细胞浓度为1×106/ml。
②加样：将细胞接种于24孔细胞培养板，每孔0.5ml。再分别加0.25mlPHA（200ug/ml）和0.25A23187（0.2ug/ml），37度，5%CO2孵育24小时。
③回收上清：将细胞培养板1500r/min离心10分钟，收集细胞培养上清液，-30度冻存。
（2）IL-4生物学活性测定
CT.4S细胞悬液制备①

接种细胞于96孔培养板②

加待测样品和标准品③

加3H-TdR④

收集细胞，测定3H-TdR掺入量⑤

绘制标准曲线，计算待测样品的IL-4的活性单位⑥
*注：
①用0.25%胰酶消化、收集生长旺盛的贴壁CT.4S细胞；经Hank’s液离心洗涤2次后，10%FCS-RPMI-1640培养液调制细胞浓度为1×105/ml。
②接种细胞于96孔细胞培养板，每孔0.1ml。
　　③加入适当稀释的待测样品和标准品，每孔０.１ml。每个样品设３个复孔，同时设培养液对照。37度，5%CO2孵育４８小时。
　　④与⑤同IL-2。
⑥以cpm为纵坐标，相应的不同稀释浓度IL-4标准品浓度为横坐标，在半对数图纸上绘制出标准曲线，