四脊滑螯虾造血组织细胞培养条件的优化.pdf

第 卷 第 期应 用 海 洋 学 学 报，年 月 ，四脊滑螯虾造血组织细胞培养条件的优化刘林敏，阮灵伟，黄智豪，施 泓 收稿日期：资助项目：福建省自然科学基金（）；现代农业产业技术体系专项资金（）作者简介：刘林敏（），女，硕士研究生；：通讯作者：施泓（），女，博士，副研究员；：（自然资源部第三海洋研究所、自然资源部海洋生物遗传资源重点实验室，福建 厦门）摘要：稳定的体外细胞培养体系，可以为基因功能和宿主病原相互作用研究提供平台。本研究通过对四脊滑螯虾（）造血组织（，）细胞的体外培养条件进行优化，以期获得状态稳定、活力良好的造血组织细胞培养物。我们从四脊滑螯虾中分离提取造血组织细胞后，通过对培养基种类（、），谷氨酰胺浓度（、），胎牛血清浓度（、），以及体外培养温度（、）等培养条件进行优化。细胞形态观察和细胞活力分析结果表明，细胞在添加 青霉素链霉素、谷氨酰胺、胎牛血清的 培养基中状态最佳，在 培养温度下能存活 左右。这些培养条件将有利于四脊滑螯虾造血组织细胞的体外培养。关键词：海洋生物学；造血组织细胞；原代细胞；优化培养；四脊滑螯虾：中图分类号：文献标识码：文章编号：（）对虾养殖业在我国水产养殖经济中占据重要地位，但病害的持续暴发，制约着该产业的发展。白斑综合征病毒（，）是甲壳类动物，特别是对虾的主要病原体之一，自 年暴发以来，给全球虾类养殖产业带来了巨大的经济损失。的宿主范围广泛，能感染凡纳滨对虾（）、中 国 对 虾（）、克氏原螯虾（）、四脊滑螯虾（）、拟穴青蟹（）、红星梭子蟹（）等 多种甲壳类动物。的致死率高，是许多甲壳动物特别是对虾的最致命病原体，对虾通常在病毒侵染一周之内死亡。此外，桃拉综合征病毒（，）、黄头病毒（，）等病原体引起的疾病也严重影响着虾蟹产业的发展。为了研究这些病原体的致病机制，寻找对虾抗病防治方法，国内外涌现大批学者对病原体自身结构、功能基因、入侵方式，以及宿主自身免疫机制、病毒与宿主蛋白之间相互作用等进行了研究，但由于缺乏稳定的体外细胞培养体系，阻碍了这些研究工作的深入开展。因此稳定成熟的体外培养体系是目前虾类病害研究能否深入的关键因素之一。甲壳类动物的细胞培养目前仍处于原代培养阶段，尽管学者们对其展开了大量的研究和探索，但可稳定传代的细胞系仍未出现。人们对甲壳类动物细胞体外培养的研究最早始于 年，等在体外观察到云斑厚纹蟹（）的心脏细胞存在有丝分裂活性，但未对其进行传代培养。自此之后，学者们陆续进行了凡纳滨对虾、日本对虾（）、褐对虾（）、长毛对虾（）等多种对虾相关组织细胞培养的研究。目前心脏、卵巢和血淋巴等组织已在体外成功分离培养。甲壳动物的细胞培养在不同病原研究中发挥着一定的作用。例如，等最先对斑节对虾（）的淋巴细胞进行体外培养，并在其中进行斑节对虾杆状病毒（，）的制备。等和 等分离了克氏原螯虾的造血组织细胞，并利用该细胞进行 病毒复制和入侵机制研究。凡纳滨对虾原代血细胞培养也被用于 的体外增殖和发病机制研究。等在虾血细胞中 期刘林敏，等：四脊滑螯虾造血组织细胞培养条件的优化 研究 的感染机制。近年来，因螯虾个体大、易于室内养殖、取材简单方便等特点日渐成为甲壳动物细胞培养的首选对象。年，等从通讯螯虾（）的胃背部分离出了造血干细胞，这些细胞已被应用于甲壳动物包括对虾在内的基因及其相应蛋白质的功能研究。相比于通讯螯虾，四脊滑螯虾在我国的虾蟹养殖市场更常见，来源广泛，价格优廉，且二者亲缘关系相近，组织结构相似，成为我国甲壳动物细胞培养研究的优势品种。本实验室根据通讯螯虾造血组织的分离及培养方法，已建立四脊滑螯虾造血组织细胞体外培养体系，并利用该细胞平台筛选与 感染相关的信号途径。也有学者利用四脊滑螯虾造血组织细胞平台对螯虾血细胞分群、外源基因过表达技术等展开一系列研究。目前，四脊滑螯虾造血组织细胞只能原代培养，暂未成功在体外进行传代；没有特定的培养基，只能在商品化的基础培养基如、昆虫培养基中额外添加营养物质来满足培养需求。但是通讯螯虾个体通常在 养殖，与四脊滑螯虾的生存环境、培养温度存在较大差异，因此在细胞培养条件上可能也存在不同。我们在实验中也发现了一些问题，如提取纯化的造血组织细胞在体外培养 后存在活力不佳、存活时间短、状态不稳定等问题，阻碍了实验的深入开展。因此本研究拟通过对四脊滑螯虾的造血组织细胞体外培养条件进行优化，提高细胞存活率，进而完善现有的螯虾造血组织细胞培养体系，为宿主病原相互作用的研究提供稳定的细胞平台。材料与方法 材料 实验动物和试剂四脊滑螯虾（）购自福建长泰养殖场，于水缸中饲养一周后使用，饲养温度为 ，螯虾体长约（），体重约（）；胎牛血清（，）、青霉素链霉素双抗（，双抗）购自美国 公司；谷氨酰胺（，）购自美国赛默飞公司；购自日本同仁公司；胶原蛋白酶型、胶原蛋白酶型、（）、培养基购自美国 公司；（高糖）培养基购自 公司；其余试剂为国产分析纯试剂。主要仪器倒置显微镜购自德国莱卡公司；细胞培养箱购自上海一恒科技有限公司；细胞计数器购自美国 公司；酶标仪购自美国赛默飞公司。实验方法 螯虾造血组织细胞的分离提取取数只健康的四脊滑螯虾用酒精棉球擦拭全身，手术剪沿螯虾头胸甲两侧剪至眼柄处，用手术刀将结缔组织小心切断，取眼柄齐平处一块三角形白色薄膜即螯虾造血组织；用 缓冲液（，）轻微冲洗 次。用镊子将薄纱左右聚集于一处，一次性夹起，置于胶原蛋白酶溶液（胶原蛋白酶型，胶原蛋白酶型，）中室温消化 。待造血组织消化至薄纱状，用枪头反复轻微吹打，以 ，离心 收集细胞。随后用 缓冲液清洗 次，离心收集细胞，视沉淀量加入适量添加有 双抗的 液体培养基重悬细胞。将细胞悬液透过 滤膜除去组织块。取 细胞悬液稀释 倍后用细胞计数器计数，用于后续操作。螯虾造血组织细胞的显微观察按“”的方法提取分离造血组织细胞，以个细胞 孔的密度接种于 孔细胞培养板中，细胞培养箱中静置 ，于倒置显微镜下观察细胞形态，并拍照记录结果。不同培养基的筛选按“”的方法提取分离造血组织细胞，孔细胞培养板中每孔接种 个细胞，后小心吸去原有培养基，分别加入仅添加有 双抗的、培养基，培养箱中培养 ，倒置显微镜下观察细胞形态，并拍照记录结果。不同 谷氨酰胺浓度的筛选按“”的方法提取分离造血组织细胞，在 孔细胞培养板中每孔接种个细胞，待细胞贴壁后小心吸去培养基，加入仅添加有 双抗以及、谷氨酰胺的 培养基，培养，此后每 半量更换培养基，用倒置显微镜观察第、天的细胞形态，并拍照记录结果。不同 浓度的筛选按“”的方法提取分离造血组织细胞，铺于 应 用 海 洋 学 学 报 卷 孔细胞培养板，密度为 个细胞 孔，待细胞贴壁后将培养基更换为添加有 双抗、谷氨酰胺以及、的 培养基，培养于 培养箱中，每 半量更换培养基，分别在第、天于倒置显微镜下观察细胞形态，并拍照记录结果。测定细胞活力按“”的方法提取分离造血组织细胞，以个细胞 孔的密度接种于 孔细胞培养板中，细胞培养箱中培养，分别在第、天将各组原有培养基除去，加入含 的 缓冲液，置于 培养箱中反应，在酶标仪中测定每孔 处的吸光度。每组设置 个复孔，及 个空白对照。不同培养温度的筛选按“”的方法提取分离造血组织细胞，以个细胞 孔的密度接种于两个 孔细胞培养板中，培养基为添加有 双抗、谷氨酰胺、的 培养基。将两个细胞培养板分别置于、培养箱中培养，每 半量更换培养基，显微镜下观察细胞形态，并拍照记录结果。结果与讨论 原代造血组织细胞的显微观察将分离得到的原代造血组织细胞以 个细胞 孔的密度接种于 孔细胞培养板中，贴壁后置于显微镜下观察形态。如图（）所示，原代造血组织细胞培养放置 后，在培养皿底部贴壁，贴壁后形态多样，在细胞状态良好时细胞会伸出伪足。根据细胞形态可以分为 种类型的细胞，分别为圆形、纺锤形、长梭形、三角形、不规则形图（）（），这些细胞中细胞核均占据较大的比例。图 造血组织细胞的形态 （）造血组织细胞，（）（）不同形态的造血组织细胞；倒置显微镜，比例尺为 。不同培养基对造血组织细胞的影响为了筛选获得最佳的培养基，我们将分离的螯虾造血组织细胞以 个 孔的密度铺于 孔细胞培养板中，分别加入添加有 双抗的、种培养基，培养 后，用显微镜观察其形态。结果如图 所示，培养基中造血组织细胞形态多样，细胞边沿清晰，细胞状态良好图（）；培养基中细胞多数皱缩、黑化，细胞状态差图（）；培养基中细胞基本皱缩，胞内出现大量空泡，细胞状态最差图（）。由此可见，培养基最适合于螯虾造血组织细胞的体外培养。不同浓度 谷氨酰胺对造血组织细胞的影响为了了解不同浓度 谷氨酰胺对造血组织细胞的影响，我们调整了 培养基中 谷氨酰胺的浓度，进一步筛选最优培养条件。我们将提取分离的螯虾造血组织细胞以每孔 个细胞的密度铺于 孔细胞培养板中，置于 培养箱中培养。设置、的 谷氨酰胺浓度，分别在第、天拍照记录细胞状态。结果如图 所示，谷氨酰胺浓度对细胞形态的影响不是很明显，随着培养时间的延长，造血组织细胞的形态均会趋于圆球形。随后，我们用 法测定不同 谷氨酰胺浓度下的细胞活力，从结果图 可以看出，未添加 谷氨酰胺组在第 天时相比于第 天细胞活力明显下降。而添加不同浓度 谷氨酰胺的其他组细胞在第 天时细胞活力均明显提升，且细胞在添加有 谷氨酰胺的 培养基中活力最高，因此选取 谷氨酰胺浓度进行后续实验。期刘林敏，等：四脊滑螯虾造血组织细胞培养条件的优化 图 不同培养基对造血组织细胞的影响 （）培养基，（）培养基，（）培养基；倒置显微镜，比例尺为 。图 不同浓度 谷氨酰胺对造血组织细胞的影响 （）（）：无添加，（）（）：，（）（）：，（）（）：；倒置显微镜，比例尺为 。图 不同浓度 谷氨酰胺下造血组织细胞活力 “”表示，“”表示，“”表示，下同。不同浓度 对造血组织细胞的影响在添加 谷氨酰胺的基础上，我们设置、的 浓度，进一步对体外培养条件进行优化。造血组织细胞以 个 孔的密 应 用 海 洋 学 学 报 卷度在 培养箱中培养，分别拍照记录两周内的细胞状态，结果如图 所示，对造血组织细胞的形态会产生较大的影响。的 在培养第 天时会使细胞呈圆球形；在第 天时仍有大量细胞存活，细胞状态较为稳定，细胞形态不再出现明显变化，且相比于未添加 组细胞状态较好图（）（）。组的细胞在培养第 天时略有伸长，第 天时细胞伸长明显，细胞质中出现些许空泡图（）（）。组的细胞在培养第 天时略有伸长，第 天时在伸长的细胞中其细胞质出现明显的空泡，仅有少量细胞存活图（）（）。当我们延长培养时间至两周后，发现第 天时 组的细胞为圆球形，细胞状态仍较为稳定，而此时 组的细胞伸长明显，胞质出现大量空泡，细胞状态明显变差图（）（）。因此相比于 的，浓度更适合细胞较长时间的培养。同样的，我们用 法测定不同 浓度下的细胞活力，从结果来看，组无论是 还是 ，其细胞活力均明显的下降；组的细胞活力值均最高；组与无添加 组相比，细胞活力在不同时间点内均有小幅度上调，的值在不同时间点内也较为稳定（图）。综上，在小幅上调细胞活力的同时，能保证细胞较长时间稳定存活，因此为本实验最佳 浓度。图 不同浓度 对造血组织细胞的影响 （）（）：无添加（、），（）（）：（、），（）（）：（、），（）（）：（、），（）（）：和 的细胞状态；倒置显微镜，比例尺为 。不同培养温度对造血组织细胞的影响按照上述优化后的培养条件（培养基中添加 双抗、谷氨酰胺、），将提取纯化的原代螯虾造血组织细胞分别在、培养 期刘林敏，等：四脊滑螯虾造血组织细胞培养条件的优化 图 不同 浓度下的造血组织细胞活力 箱中进行体外培养，用倒置显微镜观察细胞状态。结果表明 的培养条件下细胞能存活更久，细胞在 时伪足消失，细胞整体拉长呈长梭形，之后随着培养时间的延长细胞逐渐变为圆形，存活时间为 左右图（）（）；培养条件下细胞会在一周左右由原先的梭形变为圆形，存活时间为 左右图（）（）。图 不同培养温度下造血组织细胞的状态 （）（）：下第、天细胞状态，（）（）：下第、天细胞状态；倒置显微镜，比例尺为 。讨论虾类细胞缺乏稳定的体外培养体系使得宿主病原相互作用的深入研究进展缓慢，原代细胞在体外的稳定培养可以为深入研究提供平台。近年来虾类病害频发，病毒检测、疫苗制备和机制研究等工作的开展使得虾类细胞的体外培养逐渐成为研究热点。由于 对昆虫细胞不具有侵染性，因此无法利用成熟的昆虫细胞系来实现病毒的特异性侵染和调控机制的研究。目前，克氏原螯虾已被证明能够被 侵染，其病理切片与对虾相似，且造血组织能人工感染并复制，这在一定程度上代替了对虾细胞。克氏原螯虾与四脊滑螯虾亲缘关系相近，本研究对四脊滑螯虾造血组织细胞的体外培养条件优化，即培养基的选择、培养基添加物及最佳浓度的选择、体外培养温度的选择等，以期为宿主与病毒关系的研究提供稳定的细胞平台。螯虾通常包含 种类型的造血组织细胞，型细胞和 型细胞具有增殖能力，型和 型细胞是颗粒细胞的前体，型细胞是半颗粒细胞的前体。本研究对四脊滑螯虾的造血组织细胞进行提取，接种于细胞培养板中，在倒置显微镜下也观察到了 种类型的细胞，与 等的结果一致，这些细胞也具有很大的细胞核，及较少的细胞质。培养基通常是原代细胞在体外稳定存活的关键 应 用 海 洋 学 学 报 卷因素之一。研究者们对甲壳动物原代细胞不同培养基的测试主要有 ，和 等，其中 被认为是最适合甲壳动物细胞的基础培养基。例如，有学者选用、培养基对四脊滑螯虾神经细胞进行体外培养，其中细胞在改良的 中状态更好。螯虾血细胞在改良的 培养基中体外培养 时，细胞活力仍保持在 左右。本研究采用常见的、及 培养基对四脊滑螯虾造血组织细胞进行培养。分离纯化的造血组织细胞在贴壁之后更换添加有 双抗的、培养基，培养 之后在倒置显微镜下可观察三者细胞形态出现明显的区别。培养基中造血组织细胞形态多样，细胞状态良好。研究表明，培养基含有更多的氨基酸和维生素，且在培养过程中不需要额外的二氧化碳来中和细胞代谢引起的 变化，因此更适合虾细胞的体外培养。目前基础的培养基通常不能够满足甲壳动物细胞的体外生存，研究者们常通过添加、虾自身提取物、氨基酸、生长因子等营养物质来满足细胞体外生存的需求。为此，等根据血淋巴的氨基酸组成，配制了 种不同的补充剂，并额外添加脯氨酸和葡萄糖。结果显示加入虾血淋巴培养基（）补充剂的血细胞形态良好，细胞增殖明显。不同虾器官（肌肉、脑、神经节、眼柄、卵巢和眼睛）的提取物对原代淋巴细胞培养性能影响的研究结果表明：的眼提取物或 的卵巢提取物能促进凡纳滨对虾淋巴器官原代培养的细胞活力。谷氨酰胺是细胞代谢必不可少的氨基酸，其参与细胞核酸及蛋白质的合成，缺乏 谷氨酰胺细胞会因营养不良而死亡。本研究在 基础培养基中添加不同浓度的 谷氨酰胺，结合细胞形态观察与细胞活力分析表明 谷氨酰胺对细胞形态并无明显的影响，但是参照 的值可以看出，添加有谷氨酰胺的造血组织细胞活力更高，因此的 谷氨酰胺更适合进行造血组织细胞的体外培养。是最常见的添加物，其中含有合成培养基无法代替的细胞生长因子、激素、粘附因子等。研究者们通常在基础培养基中添加 的 以提高细胞的活力。本研究中尽管 组的 值均最高，但结合细胞状态，该组延长培养时间至第 天时胞质出现空泡，细胞状态变差。而添加 的造血组织细胞状态在 内保持稳定，且细胞活力相对不添加 组有小幅提高，因此 更适合造血组织细胞在体外长时间的稳定培养。同时发现，越高的 浓度，造血组织细胞状态越差。这在前人的研究中也有发现，例如，对原代肝胰腺细胞的优化培养中发现培养基中添加超过 会抑制细胞的存活，且存活率低于未添加 组。在螯虾血细胞的体外培养中也发现随着 浓度的增加，细胞状态更差。推测 中的细胞生长因子等一些未知成分能够诱导造血组织细胞进行过度分化，以致加速细胞的代谢，使细胞因自身营养耗尽而快速凋亡。温度对细胞的存活具有直接的影响。螯虾适应能力强，个体通常可以在 之间生存，但其组织或细胞更脆弱，对温度也更敏感，培养温度通常在 之间。温度越高细胞代谢越旺盛，往往也加速细胞的衰老；温度越低细胞代谢越慢，在体外能存活更久。本研究结果显示造血组织细胞在 时稳定存活 左右，相比于 细胞存活时间延长一周。尽管 的培养条件能使造血组织细胞存活更久，但该温度偏低不适合一些实验的开展，如 的增殖、细胞化合物的筛选等，因此选择 进行造血组织细胞的体外培养。结论本研究对四脊滑螯虾原代造血组织细胞的体外培养条件进行优化，通过对培养基类别、谷氨酰胺浓度、浓度、培养温度进行筛选，最终获得了最佳培养条件，即 中添加 双抗、谷氨酰胺、，于 下贴壁培养。在最适培养条件下，原代造血组织细胞能在体外存活 左右。这将为体外深入研究病毒的感染及宿主的免疫防御机制提供合适的细胞平台。参考文献：，（）：，：，期刘林敏，等：四脊滑螯虾造血组织细胞培养条件的优化 ，（）：，（）：，（）：，（）：，：，：，：，：姚德福，阮灵伟，施泓 凡纳滨对虾 分子克隆及表达特征分析 应用海洋学学报，（）：，（）：马艳丽，李钫，杨丰 白斑综合症病毒极早期蛋白 相互作用蛋白的筛选 应用海洋学学报，（）：，（）：，（）：，：，（）：，（）：，：，（），：，（）：，（），（）：，（），（）：，；，（）：，（），（）：，（）：冯廷廷 红螯螯虾胚胎发育及不同饵料对其生长的影响 海口：海南大学，：，：，：，：魏静，陆承平，杨丛海 用对虾的致病病毒人工感染克氏原螯虾 南京农业大学学报，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（），（）：应 用 海 洋 学 学 报 卷 ，（）：张岩，段虎，金松君，等 红螯螯虾 神经细胞的原代培养 水产学报，（）：，（），（）：段虎 红螯螯虾（）血细胞培养及细胞免疫学研究 北京：中国科学院大学，：，（），：，（）：樊廷俊，汪小峰，史振平，等 碱性成纤维细胞生长因子与胰岛素样生长因子对中国对虾淋巴细胞培养物的协同诱导作用 海洋学报，（）：，（）：李敏，张丽莉，王国栋，等 杂色鲍原代细胞培养方法的优化及其在基因功能研究中的应用 安徽农业科学，（）：，（）：郑玉忠，刘亚群，刘昂，等 凡纳滨对虾肝胰脏原代细胞培养体系的优化 饲料工业，（）：，（）：，（），（）：，（，）：，（）（），（，），（，），（，），（），：；：（：）（责任编辑：肖 静）