荧光定量PCR原理扩增曲线市公开课一等奖百校联赛获奖课件.pptx

荧光定量荧光定量PCR技术专题技术专题第1页内容概要内容概要荧光定量荧光定量PCR原理原理荧光定量荧光定量PCR标识方法标识方法荧光定量荧光定量PCR解析方法解析方法 SYBR法试验流程及注意事项法试验流程及注意事项TIANGEN企业荧光定量产品选择指南企业荧光定量产品选择指南第2页实时定量实时定量PCR技术：技术：利用荧光信号改变实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量改变，经过Ct值和标准曲线关系对起始模板进行定量分析与常规与常规PCR技术比较：技术比较：对PCR扩增反应终点产物进行定量和定性分析，无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测荧光定量荧光定量PCR原理原理定义定义第3页扩增曲线扩增曲线荧光阈值荧光阈值Ct值值荧光定量荧光定量PCR原理原理惯用名词概念惯用名词概念第4页Cycle（循环数）（循环数）Rn（荧光强度）（荧光强度）BaselineLogliner phaseLogliner phase荧光基团荧光检测元件荧光定量荧光定量PCR原理原理扩增曲线扩增曲线第5页Cycle（循环数）（循环数）Rn（荧光强度）（荧光强度）BaselineLogliner phaseLogliner phase 前15个循环信号作为荧光本底信号（baseline）荧光域值缺省设置是315个循环荧光信号标准偏差10倍 手动设置：大于荧光背景值和阴性对照荧光最高值；进入指数期最初阶段 真正信号:荧光信号超出域值Threshold荧光定量荧光定量PCR原理原理荧光域值荧光域值第6页Ct值定义：值定义：PCR扩增过程中，扩增产物荧光信号到达设定阈值时所经过扩增循环次数Cycle（循环数）（循环数）Rn（荧光强度）（荧光强度）Ct value 荧光定量荧光定量PCR原理原理CtCt值值第7页Cycle numberCk 104Ck 102SampleLog of DNA concentration 模板DNA量越多，荧光到达域值循环数越少，即Ct值越小。Log模板起始浓度与Ct值呈线性关系。荧光定量荧光定量PCR原理原理CtCt值与模板起始量关系值与模板起始量关系第8页线性关系、扩增效率确认线性关系、扩增效率确认检测灵敏度确认检测灵敏度确认No template controlNo template control确认确认PCRPCR扩增效率（扩增效率（E E）:0.8-1.2:0.8-1.235Cycles35Cycles内可得到好定量结果内可得到好定量结果假如采取假如采取SYBRSYBR检测方法，检测方法，30Cycles30Cycles内内无非特异性产物扩增无非特异性产物扩增35 Cycles35 Cycles内无引物二聚体产生内无引物二聚体产生相关系数（相关系数（r r2 2）：大于）：大于0.980.98荧光定量PCR反应性确认第9页 定性分析研究：定性分析研究：杂合或纯合子判定，（SNPs）分析等 绝对定量研究：绝对定量研究：病毒和病原菌定量分析，基因拷贝数定量，GMO定量检测等 相对定量研究：相对定量研究：mRNA表示量分析，siRNA效果确认，基因芯片结果验证，差异显示结果验证等荧光定量荧光定量PCR技术应用技术应用第10页内容概要内容概要荧光定量荧光定量PCR原理原理荧光定量荧光定量PCR标识方法标识方法荧光定量荧光定量PCR解析方法解析方法 SYBR法试验流程及注意事项法试验流程及注意事项 TIANGEN企业荧光定量产品选择指南企业荧光定量产品选择指南第11页非特异性荧光标识非特异性荧光标识 SYBR Green I特异性荧光标识特异性荧光标识 TaqMan Probe惯用荧光标识方法惯用荧光标识方法第12页SYBRGreenI染料法染料法原理原理 SYBR Green I是一个结合于全部dsDNA双螺旋小沟区域含有绿色激发波长染料。SYBR Green ISYBR Green ISYBR Green ISYBR Green I第13页热热热热 变变变变 性性性性引物退火引物退火引物退火引物退火延伸反应延伸反应延伸反应延伸反应SYBRGreenI染料法染料法作用机理作用机理第14页问题点：问题点：SYBRGreenI与双链与双链DNA进行结合后散发荧光，所以如进行结合后散发荧光，所以如果反应体系中有非特异性扩增或引物二聚体产生，也将果反应体系中有非特异性扩增或引物二聚体产生，也将同时被检测，从而可能造成检测结果不准确。同时被检测，从而可能造成检测结果不准确。SYBRGreenI染料法染料法问题点与关键点问题点与关键点关键点：关键点：设计适当引物，预防非特异性扩增！设计适当引物，预防非特异性扩增！第15页将温度与荧光强度改变求导将温度与荧光强度改变求导将温度与荧光强度改变求导将温度与荧光强度改变求导(-dI/dT)(-dI/dT)原始图谱原始图谱对数图谱对数图谱SYBRGreenI染料法染料法融解曲线融解曲线第16页融解曲线分析，单一峰融解曲线分析，单一峰无非特异性荧光无非特异性荧光定量准确定量准确融解曲线分析，出现杂峰融解曲线分析，出现杂峰其它产物出现非特异性荧其它产物出现非特异性荧光，所以定量不准确光，所以定量不准确SYBRGreenI染料法染料法融解曲线融解曲线第17页对对DNA模板没有选择性模板没有选择性适合用于任何适合用于任何DNA使用方便，无须设计复杂使用方便，无须设计复杂探针探针含有价格优势含有价格优势优优点点轻易与非特异性双链轻易与非特异性双链DNA结合，结合，产生假阳性产生假阳性但能够经过融解曲线但能够经过融解曲线分析，优化反应条件分析，优化反应条件对引物特异性要求较高对引物特异性要求较高不能进行多重定量不能进行多重定量缺缺 点点SYBRGreenI染料法染料法优缺点优缺点第18页Taqman探针法探针法原理原理 5端标识有汇报基团(Reporter,R)，如FAM、VIC等 3端标识有荧光淬灭基团(Quencher,Q)探针完整，R发射荧光能量被Q基团吸收，无荧光，R与Q分开，发荧光 Taq酶有 53外切核酸酶活性，可水解探针第19页Taqman探针法探针法工作机理工作机理热变性热变性热变性热变性引物和探针与模板退火引物和探针与模板退火引物和探针与模板退火引物和探针与模板退火延伸反应延伸反应延伸反应延伸反应探针探针探针探针汇报基团汇报基团汇报基团汇报基团淬灭基团淬灭基团淬灭基团淬灭基团探针探针探针探针DNADNADNADNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶引物引物引物引物R RR RR RR R第20页1、引物、探针设计：、引物、探针设计：探针Tm为68-70，30 bp,5不能有G，G可能会淬灭荧光素，引物尽可能靠近探针，扩增片段400 bp，引物Tm为59-60 2、反应参数确实定：、反应参数确实定：普通为：94，10-20S 60，30-60S（Taq酶53外切核酸酶活性在60 最高），也可经过温度梯度优化退火温度 3、优化引物和探针浓度：取得最小、优化引物和探针浓度：取得最小Ct值，最大信号值，最大信号/背景比值背景比值 引物浓度：50-900nM 探针浓度：50-250nM4、其它与常规、其它与常规PCR相同相同Taqman探针法探针法PCR体系建立体系建立第21页3 3 3 3 淬灭基淬灭基淬灭基淬灭基团团团团淬灭基团性质淬灭基团性质淬灭基团性质淬灭基团性质提议使用5汇报基团TAMRATAMRATAMRATAMRA荧光物质荧光物质荧光物质荧光物质FAM,HEX,TET,JOEFAM,HEX,TET,JOEFAM,HEX,TET,JOEFAM,HEX,TET,JOE等等等等EclipseEclipseEclipseEclipse非荧光物质非荧光物质非荧光物质非荧光物质FAM,HEX,TET,FAM,HEX,TET,FAM,HEX,TET,FAM,HEX,TET,JOE,TAMRA,ROXJOE,TAMRA,ROXJOE,TAMRA,ROXJOE,TAMRA,ROX等等等等Taqman探针法探针法荧光标识物选择荧光标识物选择第22页 高度特异性高度特异性 重复性好重复性好 可进行多重定量可进行多重定量优优 点点 只适合一个特定目标只适合一个特定目标 委托企业标识，价格较高委托企业标识，价格较高 不易找到本底低探针不易找到本底低探针缺缺 点点Taqman探针法探针法优缺点优缺点第23页不一样定量方法比较不一样定量方法比较方法方法优点优点缺点缺点适用范围适用范围SYBR Green I SYBR Green I 方法方法适用性广灵敏方便廉价引物要求高引物要求高易出现非特异性带易出现非特异性带不能进行多重定量不能进行多重定量适合科研中对各种目标基因定量分析，基因表示量研究，转基因重组动植物研究TaqMan TaqMan 方法方法特异性高特异性高重复性好重复性好多重定量多重定量价格高价格高只适合特定目标只适合特定目标病原体检测，疾病耐药基因研究,药品疗效考评遗传疾病诊疗第24页内容概要内容概要荧光定量荧光定量PCR原理原理荧光定量荧光定量PCR标识方法标识方法荧光定量荧光定量PCR解析方法解析方法 SYBR法试验流程及注意事项法试验流程及注意事项 TIANGEN企业荧光定量产品选择指南企业荧光定量产品选择指南第25页绝对定量解析方法绝对定量解析方法第26页Sample25绝对定量定义绝对定量定义 Log（起始浓度）与循环数呈线性关系，经过已知起始拷贝数标准品 可作出标准曲线,即得到该扩增反应存在线性关系 依据样品Ct值，就能够计算出样品中所含模板量第27页质粒标准品制备质粒标准品制备PCRPCR目基因克隆质粒提取，质粒提取，质粒提取，质粒提取，ODODODOD值定量，将质粒梯度稀释作为标准品使用值定量，将质粒梯度稀释作为标准品使用值定量，将质粒梯度稀释作为标准品使用值定量，将质粒梯度稀释作为标准品使用目基因目基因目基因质粒质粒目基因基因组基因组DNADNA第28页拷贝数计算：拷贝数计算：待测样本浓度（ng/ul）OD26040稀释倍数样本分子量=碱基数324待测样本拷贝数（copies/ul）=待测样本浓度/样本分子量61014倍比梯度稀释方法：倍比梯度稀释方法：1v原液(标准品i)+9v稀释缓冲液，得标准品ii1v标准品ii+9v稀释缓冲液，得标准品iii1v标准品iii+9v稀释缓冲液，得标准品iv1v标准品iv+9v稀释缓冲液，得标准品v质粒标准品稀释方法与拷贝数计算质粒标准品稀释方法与拷贝数计算第29页 方方 法：法：从血液中提取病毒DNA，以TaqMan探针法进行荧光定量检测 试试 剂：剂：TIANGEN企业探针法试剂RealMasterMix（Probe）（目录号：FP203）标准品：标准品：质粒标准品浓度为106、105、104、103；2个重复；设阴性空白对照 试验步骤：试验步骤：提取HBV DNA；设计特异引物；设计TaqMan探针并标识探针；荧光定量扩增；结果分析：获取血液样品中HBV DNA准确copy数。绝对定量试验例绝对定量试验例乙肝病人血液中乙肝病人血液中HBVHBV绝对定量绝对定量第30页SampleSamplecopies/mlcopies/mlCt1Ct1Ct2Ct2Mean CtMean CtSTDSTD标准品510328.1828.6428.410.16标准品510425.2525.1425.190.04标准品510522.1122.4622.280.12标准品510618.6318.9218.770.10未知样品?20.5620.4520.50.05空白对照NoneNone试验数据试验数据绝对定量试验例绝对定量试验例乙肝病人血液中乙肝病人血液中HBVHBV绝对定量绝对定量第31页扩增效率（扩增效率（E）计算）计算 E=10-1/斜率 1 =10-1/-3.17 1 =2.031 1.03 标准曲线制作：标准曲线制作：利用利用Mean Ct 作图可得到标准曲线作图可得到标准曲线y=-3.17x+37.52 R2=0.9988绝对定量试验例绝对定量试验例乙肝病人血液中乙肝病人血液中HBVHBV绝对定量绝对定量 相关系数（相关系数（相关系数（相关系数（R R R R2 2 2 2）：大于）：大于）：大于）：大于0.980.980.980.98，越靠近，越靠近，越靠近，越靠近1 1 1 1，结果可信度越高。，结果可信度越高。，结果可信度越高。，结果可信度越高。扩增效率（扩增效率（扩增效率（扩增效率（E E E E）：）：）：）：0.8-1.2,0.8-1.2,0.8-1.2,0.8-1.2,越靠近越靠近越靠近越靠近1 1 1 1，越理想。，越理想。，越理想。，越理想。第32页未知样品拷贝数计算未知样品拷贝数计算将Ct值带入线性方程：20.5=-3.1726 X+37.52QuantityUnknown=105.36 =229087 copies 绝对定量试验例绝对定量试验例乙肝病人血液中乙肝病人血液中HBVHBV绝对定量绝对定量X=20.5-37.52-3.1726=5.36第33页相对定量解析方法相对定量解析方法第34页理论上目基因表达量分析条件Sample BSample BSample BSample BSample ASample ASample ASample A目基因扩增效率相同RNARNARNARNA提取效率相同提取效率相同提取效率相同提取效率相同细胞起始数相同细胞起始数相同细胞起始数相同细胞起始数相同实际目基因表达量分析相对定量必要性相对定量必要性第35页以上条件不可能同时得到满足，必须用以上条件不可能同时得到满足，必须用内对照基因内对照基因（管家基因）（管家基因）进行校正，进进行校正，进行相对表示量分析。行相对表示量分析。第36页管家基因管家基因管家基因管家基因 维持细胞基本代谢活动所必须基因维持细胞基本代谢活动所必须基因维持细胞基本代谢活动所必须基因维持细胞基本代谢活动所必须基因,如：如：如：如：GAPDHGAPDHGAPDHGAPDH、ActinActinActinActin、18S rRNA18S rRNA18S rRNA18S rRNA等等等等筛选方法筛选方法筛选方法筛选方法 依据文件提供依据文件提供依据文件提供依据文件提供 经过详细试验筛选经过详细试验筛选经过详细试验筛选经过详细试验筛选相对定量分析相对定量分析管家基因筛选管家基因筛选0 0 0 01 1 1 12 2 2 23 3 3 34 4 4 45 5 5 56 6 6 6Sample1Sample1Sample1Sample1Sample2Sample2Sample2Sample2Sample3Sample3Sample3Sample3Sample4Sample4Sample4Sample4试验组试验组试验组试验组试验值试验值试验值试验值-Actin-Actin-Actin-ActinGAPDHGAPDHGAPDHGAPDH-2-microglobulin-2-microglobulin-2-microglobulin-2-microglobulinHPRTHPRTHPRTHPRTP P P P P P O O 第37页双标准曲线法双标准曲线法2-Ct法法相对定量分析相对定量分析两种惯用分析方法两种惯用分析方法第38页 经过标准曲线对对照样品、待测样品目标基因及管家基经过标准曲线对对照样品、待测样品目标基因及管家基因进行定量，然后依据计算公式求得相对值即为相对表因进行定量，然后依据计算公式求得相对值即为相对表示量。示量。相对值相对值=校正值校正值=目基因定量结果管家基因定量结果管家基因定量结果待测样品校正值待测样品校正值对照样品校正值对照样品校正值相对定量分析相对定量分析双标准曲线法双标准曲线法公式：公式：第39页优点：分析点：分析简单，试验优化相化相对简单缺点：缺点：对每一个基因，每一每一个基因，每一轮试验都必需做都必需做标准曲准曲线应用：基因表示用：基因表示调控研究中最控研究中最惯用与公用与公认两种相两种相对定量方法之一定量方法之一相对定量分析相对定量分析双标准曲线法双标准曲线法检测样品检测样品管家基因管家基因H H目标基因X定量结果定量结果定量结果定量结果校正值校正值相对量相对量对照样品对照样品6391.56391.5343.4343.40.05370.05371.0001.000待测样品待测样品1 18589.78589.717.317.30.00200.00200.0370.037待测样品待测样品2 27432.97432.91946.11946.10.26180.26184.8744.874试验数据试验数据第40页公式：公式：F=2相对定量分析相对定量分析2 2 法法优点：无需作标准曲线优点：无需作标准曲线缺点：假定扩增效率为缺点：假定扩增效率为 100%；假定标准曲线及每次扩增之际间效率都保持一致；假定标准曲线及每次扩增之际间效率都保持一致；试验条件优化较为复杂试验条件优化较为复杂应用：基因表示调控研究中最惯用与公认两种相对定量方法之一应用：基因表示调控研究中最惯用与公认两种相对定量方法之一 待测组目基因平均Ct值待测组管家基因平均Ct值对照组目基因平均Ct值对照组管家基因平均Ct值CtCt第41页试验数据：试验数据：Sample 处理前 处理后 Jun(MeanCt)GAPDH(MeanCt)E18161717.41.951.952-Ct法：假设目基因和参照基因扩增效率都接近100%Ct（处理前）18171 Ct（处理后）1617.4=1.4Ct=Ct（处理后）Ct（处理前）1.412.4比率（处理后/处理前）=2Ct2（2.4）=5.3 所以所以JunJun基因在处理后表示水平比处理前高基因在处理后表示水平比处理前高5.35.3倍倍修正方法：假如我们知道目标基因和参考基因有相同扩增效率，但扩增效率不等于修正方法：假如我们知道目标基因和参考基因有相同扩增效率，但扩增效率不等于2，那么，那么2Ct能够修正为：能够修正为：ECt，比如扩增效率为，比如扩增效率为1.95，那么计算公式可修正为，那么计算公式可修正为1.95Ct相对定量分析相对定量分析2-Ct2-Ct法法第42页内容概要内容概要荧光定量荧光定量PCR原理原理荧光定量荧光定量PCR标识方法标识方法荧光定量荧光定量PCR解析方法解析方法 SYBR法试验流程及注意事项法试验流程及注意事项 TIANGEN企业荧光定量相关产品企业荧光定量相关产品第43页SYBR法试验流程及注意事项法试验流程及注意事项样品制备样品制备模板准备模板准备引物设计引物设计反应条件优化反应条件优化浓度确定浓度确定技能要求技能要求环境要求环境要求误差控制误差控制数据分析数据分析仪器介绍仪器介绍RT上机上机反应体系优化反应体系优化试剂选择试剂选择分析方法分析方法第44页样品制备样品制备环境要求环境要求模板准备模板准备数据分析数据分析RT上机上机浓度确定浓度确定SYBR法试验流程及注意事项法试验流程及注意事项无RNase环境使用无RNase耗材专用RNase-free工具高纯度，浓度均一高纯度，浓度均一高纯度，浓度均一高纯度，浓度均一RNARNARNARNA分光光度计检测电泳检测第45页RT反应体系优化反应体系优化试剂选择试剂选择样品制备样品制备模板准备模板准备数据分析数据分析上机上机AMVM-MLVQuantSuper下游反应数确定反转录体积选择应用引物高效、全长高效、全长高效、全长高效、全长cDNAcDNAcDNAcDNASYBR法试验流程及注意事项法试验流程及注意事项第46页模板准备模板准备引物设计引物设计浓度确定浓度确定环境要求环境要求误差控制误差控制RT样品制备样品制备数据分析数据分析上机上机核酸制备区反应液制备区制作标准曲线设定浓度区间评价引物使用mix降低系统误差设置重复（3次）设置空白和阴性对照均一反应液和模板混合物均一反应液和模板混合物均一反应液和模板混合物均一反应液和模板混合物GC：5060Tm：5065单个碱基重复4个无二级结构扩增加度：100200bp第47页反应体系优化反应体系优化上机上机反应条件优化反应条件优化RT样品制备样品制备模板准备模板准备数据分析数据分析反应体积5ul，推荐2050ulMg2调整，酶活调整引物浓度优化，模板量优化退火温度优化：梯度PCR延伸时间：产物长度决定扩增效率：90110重复性：std0.2标准曲线：R0.99或R2 0.98SYBR法试验流程及注意事项法试验流程及注意事项标准品待测样本阳性对照阴性对照第48页技能要求技能要求误差控制误差控制仪器介绍仪器介绍上机上机试剂选择试剂选择RT样品制备样品制备模板准备模板准备数据分析数据分析自配realmastermixRCHO-Lightcycler seriesROTOGEN-RG seriesBIO-RAD Opticon seriesABI-7seriesBioerLinegene series分装控制内参控制机器校正控制平滑曲线，重复性好，灵敏度高平滑曲线，重复性好，灵敏度高平滑曲线，重复性好，灵敏度高平滑曲线，重复性好，灵敏度高SYBR法试验流程及注意事项法试验流程及注意事项第49页 Rotor-gene6000 Rotor-gene6000 Rotor-gene6000 Rotor-gene6000 MiniOpticon MiniOpticon MiniOpticon MiniOpticon Mx3005PMx3005PMx3005PMx3005PTMTMTMTM LINE-GENE FQD-LINE-GENE FQD-LINE-GENE FQD-LINE-GENE FQD-66A66A66A66A ABI PRISM 7500ABI PRISM 7500ABI PRISM 7500ABI PRISM 7500 iQ5 Real-Time PCR Detection System iQ5 Real-Time PCR Detection System iQ5 Real-Time PCR Detection System iQ5 Real-Time PCR Detection System 第50页数据分析数据分析仪器介绍仪器介绍分析方法分析方法上机上机RT样品制备样品制备模板准备模板准备相对定量：2Ct法绝对定量：标准曲线法可靠，准确数据可靠，准确数据可靠，准确数据可靠，准确数据SYBR法试验流程及注意事项法试验流程及注意事项第51页内容概要内容概要荧光定量荧光定量PCR原理原理荧光定量荧光定量PCR标识方法标识方法荧光定量荧光定量PCR解析方法解析方法 SYBR法试验流程及注意事项法试验流程及注意事项 TIANGEN企业荧光定量相关产品企业荧光定量相关产品第52页TIANGEN企业荧光定量产品企业荧光定量产品SYBRGreen法法探针法探针法FP203RealMasterMix(Probe)以以DNA为模板为模板FP202RealMasterMix（SYBRGreen）以以RNA为模板为模板FP302QuantqRT-PCR(SYBRGreen)KitFP303Quant一步法一步法qRTPCR(SYBRGreen）第53页TIANGEN企业荧光定量产品优势企业荧光定量产品优势试剂盒中使用改良后Hotmaster Taq Polymerase，含有高效率、高灵敏度、高特异性特点各种不一样试验缓冲液，满足不一样试验需求高效Quant系列逆转录酶，满足RT需求独特Mg2自动调整，随时确保为PCR提供最正确Mg2浓度第54页谢谢！第55页