高级生物化学省公共课一等奖全国赛课获奖课件.pptx

高级生物化学高级生物化学Advancedbiochemistry第1页内容内容l核酸专题（李正文）核酸专题（李正文）l蛋白质专题（何冰）蛋白质专题（何冰）l代谢调控专题（韦海华）代谢调控专题（韦海华）第2页核酸核酸(NucleicAcid)l核酸结构核酸结构l核酸性质与研究方法核酸性质与研究方法l核酸研究新进展核酸研究新进展第3页核酸参考书核酸参考书l王琳芳，蛋白质与核酸，北京医科大学、中国协和医科大学王琳芳，蛋白质与核酸，北京医科大学、中国协和医科大学联合出版社，联合出版社，19981998l韦弗，分子生物学，科学出版社韦弗，分子生物学，科学出版社,麦格劳麦格劳-希尔国际企业希尔国际企业，l郜金荣郜金荣 ，分子生物学，武汉大学出版社，分子生物学，武汉大学出版社，19991999l阎隆飞阎隆飞，分子生物学，分子生物学，北京农业大学出版社北京农业大学出版社，19971997lDienbach,C.W.PCR Dienbach,C.W.PCR 技术试验指南，科学出版社，技术试验指南，科学出版社，19981998l苏慧慈，苏慧慈，原位原位 PCR PCR，科学出版社，科学出版社，19951995第4页第一章第一章 核酸结构核酸结构StructureofNucleicAcid第5页第一节第一节 核酸一级结构核酸一级结构(primarystructureofnucleicAcid)第6页一、概述一、概述核酸是主要生物大分子。核酸是主要生物大分子。l脱氧核糖核酸（脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid，DNA）：存在于细胞核和线粒体内，是贮存）：存在于细胞核和线粒体内，是贮存和携带遗传信息物质。和携带遗传信息物质。l核糖核酸（核糖核酸（ribonucleicacid，RNA）：存）：存在于胞浆中，参加遗传信息表示。在于胞浆中，参加遗传信息表示。第7页mRNA，信使核糖核酸，信使核糖核酸tRNA，转运核糖核酸，转运核糖核酸rRNA，核糖体核糖核酸，核糖体核糖核酸其中其中RNA又分为三类：又分为三类：第8页脱氧核糖核酸（脱氧核糖核酸（DNA）人人6010-9mg牛牛6510-9mg鼠鼠6610-9mg鸡鸡2610-9mg鸭鸭2110-9mg蟾蜍蟾蜍7310-9mg鲤鱼鲤鱼3310-9mg几个不一样生物细胞内几个不一样生物细胞内DNA含量含量第9页五碳五碳糖糖磷酸磷酸碱基碱基核苷核苷核苷酸核苷酸核糖核糖核糖核苷酸核糖核苷酸脱氧脱氧核糖核糖脱氧核苷酸脱氧核苷酸核酸基本单位核苷酸核酸基本单位核苷酸第10页腺嘌呤脱氧核苷酸脱氧核苷酸脱氧核苷酸DNADNA基本单位基本单位腺嘌腺嘌呤呤碱基碱基脱氧脱氧核糖核糖磷酸磷酸A G C T鸟嘌呤脱氧核苷酸胞嘧啶脱氧核苷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸鸟嘌鸟嘌呤呤胞嘧胞嘧啶啶胸腺胸腺嘧啶嘧啶第11页核糖核苷酸核糖核苷酸RNARNA基本单位基本单位腺嘌腺嘌呤呤胞嘧胞嘧啶啶碱基碱基核糖核糖磷酸磷酸鸟嘌鸟嘌呤呤A G C U尿嘧尿嘧啶啶鸟嘌呤核糖核苷酸腺嘌呤核糖核苷酸胞嘧啶核糖核苷酸尿嘧啶核糖核苷酸第12页l核酸一级结构核酸一级结构：是指核酸中核苷酸排列次序。：是指核酸中核苷酸排列次序。是其高级结构和功效基础。是其高级结构和功效基础。核苷酸之间经过核苷酸之间经过3 3,5,5 -磷酸二酯键磷酸二酯键连接连接第13页二、一级结构序列测定二、一级结构序列测定（一）（一）限制性内切酶限制性内切酶(Restrictionendonuclease)1定义：在原核生物中存在能识别外源定义：在原核生物中存在能识别外源DNA双链中双链中46个碱基对组成特异序列，并在个碱基对组成特异序列，并在此序列某位点水解外源此序列某位点水解外源DNA，这类酶称，这类酶称限制性限制性内切酶。内切酶。作用位点称作用位点称靶位点。靶位点。核酸一级结构第14页限制性内切酶l限制性内切酶主要存在于原核生物中，大多数来限制性内切酶主要存在于原核生物中，大多数来自于细菌体内，与相伴存在甲基化酶共同组成细自于细菌体内，与相伴存在甲基化酶共同组成细菌限制菌限制-修饰体系，限制外源修饰体系，限制外源DNA、保护内源、保护内源DNA。l1970年年Smith等分离到第一个限制性核酸内切酶，等分离到第一个限制性核酸内切酶，为为DNA分子体外剪切奠定了技术基础。分子体外剪切奠定了技术基础。第15页限制性核酸内切酶命名：限制性核酸内切酶命名：普通是以微生物属名第一个普通是以微生物属名第一个字母字母（大写）（大写）和种名前两个字母组成，第四个字母表示菌和种名前两个字母组成，第四个字母表示菌株株(品系品系)。字母后面罗马字则是简单地表明该种生物中不。字母后面罗马字则是简单地表明该种生物中不一样限制酶分离先后次序。比如，分离自产色链霉菌一样限制酶分离先后次序。比如，分离自产色链霉菌(Streptomyces achromogenes)两种限制酶被分别命名为两种限制酶被分别命名为SacI和SacII。比如限制酶比如限制酶Hinc和和Hind则是分别来自流则是分别来自流感嗜血菌感嗜血菌(Haemophilus influenzae)c和和d血清型菌株。血清型菌株。2限制性核酸内切酶命名和种类限制性核酸内切酶命名和种类迄今为止，已经有上千种限制酶被分离纯化，从当前迄今为止，已经有上千种限制酶被分离纯化，从当前已商品化已商品化100各种限制酶识别序列能够看出，限制酶所识别各种限制酶识别序列能够看出，限制酶所识别DNA序列大多数都富含序列大多数都富含胞嘧啶胞嘧啶(C)和鸟嘌呤和鸟嘌呤(G)。限制性内切酶第16页I I I I型限制性内切酶型限制性内切酶型限制性内切酶型限制性内切酶限制性内切酶限制性核酸内切酶种类：限制性核酸内切酶种类：l最早从大肠杆菌中发觉最早从大肠杆菌中发觉EcoK、EcoB就属于就属于I类酶。类酶。其分子量较大；反应过程中除需其分子量较大；反应过程中除需Mg2+外，还需要外，还需要S-腺苷腺苷-L甲硫氨酸、甲硫氨酸、ATP；在；在DNA分子上没有特异性分子上没有特异性酶解片断酶解片断.lI型限制性内切酶能识别型限制性内切酶能识别DNA分子内非甲基化特分子内非甲基化特定序列，但切割是随机，且切割位点远离识别位点，定序列，但切割是随机，且切割位点远离识别位点，不能生成特定片段，所以，不能生成特定片段，所以，I类酶作为类酶作为DNA分析工分析工具价值不大具价值不大。第17页IIIIIIII型限制性内切酶型限制性内切酶型限制性内切酶型限制性内切酶限制性内切酶lII类酶有类酶有EcoRI、BamHI、HindII、HindIII等。等。其分子量小于其分子量小于105道尔顿；反应只需道尔顿；反应只需Mg2+；最主要；最主要是在所识别特定碱基次序上有特异性切点，因而是在所识别特定碱基次序上有特异性切点，因而DNA分子经过分子经过II类酶作用后，可产生特异性酶解片类酶作用后，可产生特异性酶解片断，这些片断可用凝胶电泳法进行分离、判别。酶断，这些片断可用凝胶电泳法进行分离、判别。酶切后可形成粘性末端或平整末端切后可形成粘性末端或平整末端。lII型限制性内切酶能识别型限制性内切酶能识别DNA分子中特定序列，分子中特定序列，大部分含有回文结构。大部分含有回文结构。IIII型限制性内切酶识别型限制性内切酶识别DNADNA序列普通长度是序列普通长度是4 4、5 5和和6 6个碱基对。个碱基对。第18页3限制性内切酶识别序列与酶切特点限制性内切酶识别序列与酶切特点(1)限制酶识别限制酶识别DNA特异序列含有回纹结构序特异序列含有回纹结构序列。列。(2)限制酶识别序列限制酶识别序列4-6个碱基对。个碱基对。现在已从各种微生物中发觉上千种限制酶，现在已从各种微生物中发觉上千种限制酶，它们识别序列长度最短是它们识别序列长度最短是4个核苷酸，最长为个核苷酸，最长为8个核苷酸。基因克隆过程中使用频率最高是识个核苷酸。基因克隆过程中使用频率最高是识别别6个碱基正确限制酶。个碱基正确限制酶。限制性内切酶第19页EcoRI识别位点识别位点GAATTC53CTTAAG35AATTCG5-粘性末端粘性末端HindIII识别位点识别位点TTCGAAAAGCTT5335AGCTTA5-粘性末端粘性末端限制性内切酶第20页HaeIII识别位点识别位点PstI识别位点识别位点GGCC53CCGG35CTGCAG53GACGTC35GGCCCCGG平整末端平整末端CTGCAG3-粘性末端粘性末端限制性内切酶第21页在已发觉限制性内切酶中，近百种酶识别次序已被在已发觉限制性内切酶中，近百种酶识别次序已被确定。有很多起源不一样酶有相同碱基识别次序，这种酶确定。有很多起源不一样酶有相同碱基识别次序，这种酶称为称为“异源同功酶异源同功酶”(isochizomer)。应该注意是，这些。应该注意是，这些酶即使有相同识别次序，但它们酶即使有相同识别次序，但它们切点并不完全一样。切点并不完全一样。比如比如XmaI和和SmaI都识别六核苷酸都识别六核苷酸CCCGGG，但，但XmaI切点切点在在cCCGGG，而，而EmaI切点则在切点则在CCCGgGG，前者切割，前者切割DNA分子，形成带有分子，形成带有CCGG粘性末端粘性末端DNA片段，而后者片段，而后者并不形成粘性末端。并不形成粘性末端。当然，也有识别次序和切点都相同酶，如当然，也有识别次序和切点都相同酶，如HapII、HpaII、MnoI，都在识别次序，都在识别次序CCGG内有一相同切点，内有一相同切点，HalIII和和BsuRI一样在识别次序一样在识别次序GGCC内有一相同切点。内有一相同切点。限制性内切酶第22页用限制性内切酶把用限制性内切酶把DNA切割成一定大小切割成一定大小片断，这些酶解片断排列次序就叫片断，这些酶解片断排列次序就叫DNA限制限制酶图谱。酶图谱。图谱制作简单，将纯化图谱制作简单，将纯化DNA用不一样限用不一样限制性内切酶切割，进行凝胶电泳分析，确立制性内切酶切割，进行凝胶电泳分析，确立了了DNA限制酶图谱后，就能够测定每个限制酶图谱后，就能够测定每个DNA片断碱基次序，最终排列出完整片断碱基次序，最终排列出完整DNA分子碱分子碱基次序。基次序。(二）二）DNA限制酶图谱限制酶图谱核酸一级结构第23页（三）（三）DNA序列测定序列测定DNA序序列列测测定定技技术术从从60年年代代最最早早提提出出构构想想至至今今，已已经经日日臻臻完完善善，测测定定序序列列技技术术也也越越来来越越简简化化，在在各各项项研研究究工工作作中中地地位位也也日日趋趋主主要。要。核酸一级结构第24页DNA序列分析战略序列分析战略DNA序列测定l对于较小片断（500bp)DNA,可直接利用质粒系统（如PUC18，PUC19等）测序。第25页DNA序列分析战略序列分析战略DNA序列测定对于大片段对于大片段DNA，可采取：，可采取：l限制性片断亚克隆法限制性片断亚克隆法对对DNA进行酶切分析，确定酶谱后，以适当限制性内切酶降进行酶切分析，确定酶谱后，以适当限制性内切酶降解以制备各种长度限制酶片断，并亚克隆到测序载体上建立亚解以制备各种长度限制酶片断，并亚克隆到测序载体上建立亚克隆库，然后测亚克隆克隆库，然后测亚克隆DNA序列，经过排列分析，确定序列，经过排列分析，确定DNA片片断全序列断全序列l随机法（鸟枪测序法）随机法（鸟枪测序法）利用一定方法将目标利用一定方法将目标DNA随机打断成大小不一样片断并随机打断成大小不一样片断并取得亚克隆，搜集这些亚克隆取得亚克隆，搜集这些亚克隆DNA资料，经过计算机处理而取资料，经过计算机处理而取得目标得目标DNA全部序列。全部序列。第26页DNA序列测定DNA序列测定方法序列测定方法l传统序列测定技术有两种，传统序列测定技术有两种，Sanger等等(1977)提出酶法及提出酶法及Maxam和和Gibert(1977)提出化学降提出化学降解法。解法。第27页双脱氧链终止法双脱氧链终止法lSanger双脱氧链终止法使用特异引物双脱氧链终止法使用特异引物在在DNA聚合酶作用下进行延伸反应，在聚合酶作用下进行延伸反应，在DNA合成反应合成反应混合物混合物4种普通种普通dNTP中，加入少许一个双脱氧中，加入少许一个双脱氧核苷三磷酸核苷三磷酸(ddNTP)作为链终止剂，因为作为链终止剂，因为ddNTP在脱氧核糖在脱氧核糖3位置缺乏一个羟基，不能位置缺乏一个羟基，不能与后续与后续dNTP形成磷酸二酯键，从而使形成磷酸二酯键，从而使DNA链链中止。中止。DNA序列测定第28页双脱氧链终止法双脱氧链终止法第29页双脱氧链终止法双脱氧链终止法l反应产物是一系列核苷酸链，它们将分别终反应产物是一系列核苷酸链，它们将分别终止模板链每一个止模板链每一个A，每一个，每一个C，每一个，每一个G或每或每一个一个T位置上。位置上。第30页ReactionRequirementsforDideoxySequencingofDNADNA序列测定第31页第32页化学降解法化学降解法l化学降解法原理是用一些专用化学试剂修饰各种碱化学降解法原理是用一些专用化学试剂修饰各种碱基，使对应糖苷键变得不稳定，在哌啶作用下，糖苷基，使对应糖苷键变得不稳定，在哌啶作用下，糖苷键断裂，从而得到以特定碱基结尾一系列键断裂，从而得到以特定碱基结尾一系列DNA片段，片段，经电泳分离，推断出碱基序列。经电泳分离，推断出碱基序列。DNA序列测定第33页化学降解法化学降解法经过大量筛选，发觉以下几个试剂与哌啶一起作经过大量筛选，发觉以下几个试剂与哌啶一起作用，能够在特定碱基部位断键：用，能够在特定碱基部位断键：1硫酸二甲酯哌啶硫酸二甲酯哌啶在在G处断键处断键2HCl+哌啶哌啶在在A和和G处断键处断键3水合肼哌啶水合肼哌啶在在C和和T处断键处断键4水合肼水合肼2MNaCl+哌啶哌啶在在C处断键处断键第34页化学裂解法测定化学裂解法测定DNA序列示意图序列示意图第35页DNA序列测定l近年来伴随近年来伴随PCR技术和技术和M13噬菌体及噬菌噬菌体及噬菌体载体发展，也因为现成合成引物唾手可得体载体发展，也因为现成合成引物唾手可得及测序反应日臻完善，双脱氧链终止法得到及测序反应日臻完善，双脱氧链终止法得到广泛应用，市场上多数厂家生产测序试剂盒，广泛应用，市场上多数厂家生产测序试剂盒，测序仪器均按此原理设计，测序仪器均按此原理设计，第36页DNA序列测定l标识物种类也日益增多，除了放射性标识标识物种类也日益增多，除了放射性标识外，还有各种荧光标识，除了标识在特异外，还有各种荧光标识，除了标识在特异引物上，还可标识在引物上，还可标识在ddNTP上，还可同时上，还可同时将四种不一样荧光分别标识在将四种不一样荧光分别标识在A，C，G，T上，在一个反应中完成测序，各种核酸混上，在一个反应中完成测序，各种核酸混合物在经过荧光检测系统时，可依据四种合物在经过荧光检测系统时，可依据四种不一样荧光一次性将测序阅读完成。不一样荧光一次性将测序阅读完成。第37页质粒测序方法质粒测序方法 l一、材料：一、材料：l1、测序、测序DNA聚合酶聚合酶33U/ll2、酶稀释缓冲液、酶稀释缓冲液l3、反应缓冲液、反应缓冲液第38页l4、ddATP混混合合物物：dATP,dCTP,dGTP,dTTP各各150M，ddATP3MlddCTP混混 合合 物物：dATP,dCTP,dGTP,dTTP各各150M，ddCTP3MlddGTP混混 合合 物物：dATP,dCTP,dGTP,dTTP各各150M，ddGTP3MlddTTP混混 合合 物物：dATP,dCTP,dGTP,dTTP各各150M，ddTTP3M质粒测序方法第39页l5、甲酰胺上样缓冲液、甲酰胺上样缓冲液l6、标识引物、标识引物2pmol/ll7、1.5ml薄壁离心管薄壁离心管l8、PCR自动热循环仪自动热循环仪质粒测序方法第40页二、操作过程二、操作过程1、取取4个个0.2l薄薄壁壁管管，分分别别标标识识A，C，G，T，置于冰上。，置于冰上。质粒测序方法2、分别加入、分别加入3lddATP混合物，混合物，ddCTP混合混合物，物，ddGTP混合物，混合物，ddTTP混合物至标好混合物至标好A，C，G，T管内，盖好盖子，以防蒸发。管内，盖好盖子，以防蒸发。第41页3、用用酶酶稀稀释释液液稀稀释释测测序序DNA聚聚合合酶酶：4个个反反应应需需用用7l稀稀释释缓缓冲冲液液加加3l测测序序DNA聚聚合合酶酶，从从而得到而得到10l浓度为浓度为10U/l测序测序DNA聚合酶。聚合酶。质粒测序方法第42页4、配制反应混合液：、配制反应混合液：反应缓冲液反应缓冲液3l2pmol/l标识引物标识引物1l待测质粒待测质粒DNA0.2g/l1l水水14l稀释好酶稀释好酶2l总体积总体积20l质粒测序方法第43页5、混混匀匀后后在在标标好好A，C，G，T管管内内分分别别加加入入5l反反应混合液，混匀加应混合液，混匀加1020l石蜡油。石蜡油。6、进行、进行PCR循环：循环：注注意意：退退火火温温度度主主要要依依赖赖于于引引物物特特异异序序列列，以以及及模板纯度，下面仅介绍普通程序：模板纯度，下面仅介绍普通程序：95预变性预变性1分钟分钟5030”7060”9530”共共30个循环。个循环。质粒测序方法第44页7、加、加8l甲酰胺上样缓冲液，混匀甲酰胺上样缓冲液，混匀8、取、取2l电泳电泳9、假假如如是是荧荧光光标标识识，可可由由测测序序仪仪自自动动分分析析测测序序结结果果；假假如如标标识识物物为为放放射射性性，则则凝凝胶胶电电泳泳结结束束后后用用胶胶片片放放射射自自显显影影，然然后后以以胶胶片上读结果。片上读结果。质粒测序方法第45页MegaBACE instrument质粒测序方法第46页第47页SequenceAnalyzer质粒测序方法第48页第二节第二节 核酸高级结构核酸高级结构一、一、DNADNA二级结构二级结构（1 1）二级结构含义）二级结构含义:DNA二级结构是指二级结构是指DNA双螺旋结构。双螺旋结构。绝大多数绝大多数DNA是由两条多脱氧核苷酸链组是由两条多脱氧核苷酸链组成双链分子或双链环状分子，只有少数病毒为成双链分子或双链环状分子，只有少数病毒为DNA单链环状分子（如单链环状分子（如M13,X174)第49页（2 2）DNADNA碱基组成特点碱基组成特点ChargaffChargaff定律定律 碱基当量定律碱基当量定律 A+G=T+C A+G=T+C 不对称比率不对称比率 A+T/G+C A+T/G+C（3 3）二级结构经典结构）二级结构经典结构 B-DNA(Watson&Crick B-DNA(Watson&Crick模型模型,1953,1953年）年）DNA二级结构第50页DNA二级结构第51页DNA二级结构第52页DNA二级结构第53页DNA双螺旋结构双螺旋结构DNA二级结构第54页B-DNA结构关键点结构关键点1.右手螺旋，有大沟和小沟右手螺旋，有大沟和小沟2.2.直径直径20，10个碱基组成一个螺旋，个碱基组成一个螺旋，沿中心轴上升沿中心轴上升3.43.3.磷酸和戊糖组成链位于外侧，碱基磷酸和戊糖组成链位于外侧，碱基位于内侧位于内侧4.4.A和和T配对，配对，G和和C配对配对5.5.维持双螺旋结构主要力：氢键和碱基维持双螺旋结构主要力：氢键和碱基堆积力堆积力DNA二级结构第55页（4）DNA双螺旋结构多态性双螺旋结构多态性类型类型旋转旋转方向方向螺旋螺旋直径直径nm螺距螺距nm每转碱每转碱基对数基对数目目碱基对垂碱基对垂直距离直距离nm碱基对碱基对与水平与水平面倾角面倾角A-DNA右右2.32.8110.25520B-DNA右右2.03.4100.3400C-DNA右右3.19.30.3106Z-DNA左左1.84.5120.370-9DNA二级结构第56页A-DNAB-DNA&H-DNADNA二级结构第57页 B-DNA&Z-DNADNA二级结构第58页(5)DNA其它螺旋结构其它螺旋结构回文结构镜像重复三股螺旋（H-DNA）DNA其它结构第59页回文结构DNADNA序序列中以某一中心区域列中以某一中心区域为对称轴，其两侧碱为对称轴，其两侧碱基对次序正读和反读基对次序正读和反读都相同都相同双螺旋结构双螺旋结构。即对称轴一侧即对称轴一侧片段旋转片段旋转180180后，后，与另一侧片段对称重与另一侧片段对称重复。复。回文结构能形成回文结构能形成十字结构和发夹结构十字结构和发夹结构十字结构和发夹结构十字结构和发夹结构DNA其它结构第60页AATTCAAGGGAGAAGTATAGAAGAGGGAAGGATCTTAAGTTCCCTCT TCATATCT TCTCCCTTCCTAG 存在于同一股上一些DNA区段反向重复序列。此序列各单股中没有互补序列，不能形成十字型或发夹结构。镜像重复镜像重复DNA其它结构第61页DNADNA三股螺旋（三股螺旋（H-DNA,ts-DNAH-DNA,ts-DNA）多聚嘧啶和多聚嘌呤组成DNA螺旋区段，其序列中有较长镜像重复时，形成局部三股配对，并相互盘绕三股螺旋，其中两股碱基按Watson-Crick方式配对，第三股多聚嘧啶（镜像重复）经过TAT和CGC+配对，而处于双螺旋大沟中。DNA其它结构第62页DNADNA三股螺旋三股螺旋第63页DNA三股螺旋三股螺旋第64页DNA三螺旋碱基配对三螺旋碱基配对第65页二、二、DNADNA三级结构三级结构双螺旋深入扭曲形成超螺旋。是一个双螺旋深入扭曲形成超螺旋。是一个比双螺旋更高层次空间构象。包含：比双螺旋更高层次空间构象。包含：线状线状DNADNA形成纽结、超螺旋和多重螺形成纽结、超螺旋和多重螺旋、环状旋、环状DNADNA形成结、超螺旋和连环形成结、超螺旋和连环等等第66页线状线状DNA形成超螺旋形成超螺旋DNA三级结构第67页环状环状DNADNA形成超螺旋形成超螺旋DNA三级结构第68页三、三、RNA结构结构RNA一级结构是由数量极其庞大四种核糖一级结构是由数量极其庞大四种核糖核酸（核酸（AMP、GMP、CMP、UMP）按一定）按一定次序，经过次序，经过3，5磷酸二酯键连成线形分子。磷酸二酯键连成线形分子。RNA二级结构是短，不完全螺旋多核苷酸二级结构是短，不完全螺旋多核苷酸链。链。RNA三级结构是在茎环结构基础上深入扭三级结构是在茎环结构基础上深入扭波折叠而成复杂结构。波折叠而成复杂结构。第69页（一）（一）tRNA结构结构1.tRNA一级结构一级结构由由7493个（多为个（多为76个）核苷酸组成单链个）核苷酸组成单链；含有不变（恒定）核苷酸含有不变（恒定）核苷酸:U8、G18、G19；含较多修饰核苷酸；含较多修饰核苷酸；5端多为端多为PG,3端多为端多为CCAOH。2.tRNA二级结构二级结构三叶草结构三叶草结构含有四臂四环，含有四臂四环，3端为端为CCAOH序列序列，5端为端为PG3.tRNA三级结构三级结构倒倒L形结构形结构RNA结构第70页tRNA三叶草结构RNA结构第71页tRNA三级和二级结构三级和二级结构RNA结构第72页（二）mRNA结构 RNA结构第73页(三）rRNA结构 rRNA是核糖体组成成份,其种类和大小用S表示。30S 16S原核生物 70S 23S 50S 5S 40S 18S真核生物 80S 28S 60S 5.8S 5SRNA结构第74页rRNA二级结构二级结构RNA结构第75页第二章第二章 核酸性质和研究方法核酸性质和研究方法PropertiesandresearchmethodofNucleicAcid第76页第一节第一节 核酸理化性质核酸理化性质一一.普通理化性质普通理化性质1.晶形晶形DNA为白色纤维状固体；为白色纤维状固体；RNA为白色粉末状固体为白色粉末状固体2.溶解性溶解性均溶于水；不溶于普通有机溶剂，在均溶于水；不溶于普通有机溶剂，在70%乙醇中乙醇中形成沉淀；形成沉淀；在在0.14MNaCl和和12MNaCl中中DNA-蛋白蛋白溶解度低溶解度低溶解度高溶解度高RNA-蛋白蛋白溶解度高溶解度高溶解度低溶解度低3.粘度粘度DNA粘度很大粘度很大RNA粘度小得多粘度小得多4.旋光性旋光性均很强均很强5密度及沉降性密度及沉降性密度：密度：RNA双链双链DNA；环状；环状DNA开环、线状开环、线状DNA第77页二.核酸紫外吸收纯纯DNAOD260/OD280=1.8纯纯RNAOD260/OD280=2.0嘌呤碱和嘧啶碱含有共嘌呤碱和嘧啶碱含有共轭双键，使轭双键，使DNA和和RNA在在240290nm处有强烈处有强烈紫外吸收，最大吸收紫外吸收，最大吸收260nm核酸性质第78页 三三三三.密度及沉降特征密度及沉降特征密度及沉降特征密度及沉降特征 密度：密度：RNA双链双链DNA；环状环状DNA开环、线状开环、线状DNA单链单链DNA双链双链DNA沉降速度：沉降速度：RNA环状环状DNA开环、线状开环、线状DNA核酸性质第79页四.核酸变性、复性变性：指双螺旋区氢键断裂变成单链，不包括一级结构破坏过程。复性：变性DNA在适当条件下，又可使两条分开链重新缔合成双螺旋过程。核酸性质第80页DNA DNA 变性和复性变性和复性变性和复性变性和复性核酸性质第81页第二节第二节 核酸研究方法核酸研究方法一、核酸电泳一、核酸电泳最惯用：凝胶电泳最惯用：凝胶电泳优点：简单，快速，灵敏，成本低。优点：简单，快速，灵敏，成本低。惯用有：琼脂糖凝胶电泳；聚丙烯酰胺凝胶电泳惯用有：琼脂糖凝胶电泳；聚丙烯酰胺凝胶电泳第82页（一）琼脂糖凝胶电泳（一）琼脂糖凝胶电泳惯用于分析惯用于分析DNA，用于分析，用于分析RNA时，因时，因为其常含有为其常含有RNA酶，必须先加蛋白质变性剂酶，必须先加蛋白质变性剂（如甲醛等）处理后才能用于分析（如甲醛等）处理后才能用于分析核酸研究方法第83页与电泳迁移相关原因与电泳迁移相关原因1核酸分子大小：与分子量大小对数成反比。核酸分子大小：与分子量大小对数成反比。2胶浓度：迁移率与胶浓度成反比，惯用胶浓度：迁移率与胶浓度成反比，惯用1凝胶。凝胶。3DNA构象：超螺旋最快，线形构象：超螺旋最快，线形DNA其次，开环形最其次，开环形最慢。慢。4电流：普通小于电流：普通小于5v/cm。5碱基组成：有影响，但不大。碱基组成：有影响，但不大。6温度：温度：430，常在室温下进行，常在室温下进行核酸研究方法第84页电泳完成，将凝胶在溴乙锭溶液中染色电泳完成，将凝胶在溴乙锭溶液中染色（0.5ug/ml)。溴乙锭为一扁平分子，很轻易插入溴乙锭为一扁平分子，很轻易插入DNA碱基对碱基对之间。之间。DNA与溴乙锭结合后，经紫外光照射，可发射与溴乙锭结合后，经紫外光照射，可发射出红橙色可见荧光。出红橙色可见荧光。0.1ugDNA即可检出。即可检出。核酸研究方法第85页（二）聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳加入交连剂加入交连剂其孔径比琼脂糖小，所以用于分子小于其孔径比琼脂糖小，所以用于分子小于1000bpDNA片断。另外，普通不含片断。另外，普通不含RNA酶，所酶，所以能够用于以能够用于RNA分析。分析。聚丙烯酰胺凝胶电泳样品，经溴乙锭染色后，聚丙烯酰胺凝胶电泳样品，经溴乙锭染色后，在紫外光下，发出荧光很弱，所以，浓度很低样在紫外光下，发出荧光很弱，所以，浓度很低样品不能用此法检测。品不能用此法检测。核酸研究方法第86页核酸研究方法第87页核酸研究方法第88页核酸研究方法第89页核酸研究方法第90页DNA样品回收方法样品回收方法紫外照射下切下所需紫外照射下切下所需DNA,切下胶条放于透析袋切下胶条放于透析袋中，装上电泳缓冲液，在水平槽中进行电泳，中，装上电泳缓冲液，在水平槽中进行电泳，34小时后，小时后，DNA将电泳出来并粘在透析袋内壁上，将将电泳出来并粘在透析袋内壁上，将电极倒转，通电电极倒转，通电3060秒，粘在内壁上秒，粘在内壁上DNA会释放会释放到缓冲溶液中，去胶条，用苯酚抽提到缓冲溶液中，去胶条，用苯酚抽提12次，水相次，水相用乙醇沉淀用乙醇沉淀DNA。这么回收。这么回收DNA纯度很高纯度很高。核酸研究方法第91页第92页聚合酶链反应聚合酶链反应(PolymeraseChainReaction,PCR)是是80年代中期发展起来体外核酸扩增技术。年代中期发展起来体外核酸扩增技术。它能在一个试管内将所要研究目标基因或某一它能在一个试管内将所要研究目标基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍,使肉使肉眼能直接观察和判断。过去几天几星期才能做到事眼能直接观察和判断。过去几天几星期才能做到事情，用情，用PCR几小时便可完成。几小时便可完成。PCR技术是生物医技术是生物医学领域中一项革命性创举和里程碑。学领域中一项革命性创举和里程碑。PCR技术第93页第94页PCRPCR技术简史技术简史llPCR最早构想：最早构想：本世纪本世纪60年代末、年代末、70年代初人们致力于研究基因体外分离技术，年代初人们致力于研究基因体外分离技术，Korana于于1971年最早提出核酸体外扩增构年最早提出核酸体外扩增构想：想：“经过经过DNA变性，与适当引物杂交，变性，与适当引物杂交，用用DNA聚合酶延伸引物，并不停重复该过聚合酶延伸引物，并不停重复该过程便可克隆程便可克隆tRNA基因基因”。PCR技术第95页PCRPCR技术简史技术简史lDNA复制l核酸体外扩增构想l聚合酶链反应创造ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35解旋酶解链酶DNA解旋解链合成引物子链延长PCR技术第96页PCRPCR技术简史技术简史lDNA复制l核酸体外扩增构想l聚合酶链反应创造ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35DNA解旋解链合成引物子链延长GGAUCG5AUCGCG5引物酶引物酶RNA引物RNA引物PCR技术第97页PCRPCR技术简史技术简史lDNA复制l核酸体外扩增构想l聚合酶链反应创造ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35DNA解旋解链合成引物子链延长GGAUCG5AUCGCG5TAGCGCTATCGCATCGACGCT3ATAGCGTAGCTGCGACCTAGC3DNA聚合酶DNA聚合酶PCR技术第98页PCRPCR技术简史技术简史lDNA复制l核酸体外扩增构想l聚合酶链反应创造ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35DNA变性与复性变性复性加热退火ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35PCR技术第99页PCR实实现现：19851985年年，美美国国PE-CetusPE-Cetus企企业业MullisMullis等人创造了聚合酶链反应（等人创造了聚合酶链反应（PCRPCR）基本原理是在试管中模拟细胞内基本原理是在试管中模拟细胞内DNADNA复制复制最最初初采采取取E-coli E-coli DNADNA聚聚合合酶酶进进行行PCRPCR，因因为为该该酶酶不不耐耐热热，使使这这一一过过程程耗耗时时，费费劲劲，且且易犯错易犯错耐耐热热DNADNA聚聚合合酶酶应应用用使使得得PCRPCR能能高高效效率率进进行行，随随即即PE-CetusPE-Cetus企企业业推推出出了了第第一一台台PCRPCR自自动动化化热循环仪热循环仪19931993年年，MullisMullis等等所所以以项项技技术术获获诺诺贝贝尔尔化化学奖学奖PCRPCR技术简史技术简史PCR技术第100页PCRPCR技术简史技术简史lPCR改进与完善：改进与完善：Mullis最初使用最初使用DNA聚合酶是聚合酶是大肠杆菌大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶I一个片段，其缺点是：一个片段，其缺点是：此酶不耐高温，此酶不耐高温，90会变性失活，每次循环都要会变性失活，每次循环都要重新加。重新加。PCR技术第101页l其其PCR产物特异性较差，合成产物特异性较差，合成DNA片段不均一。片段不均一。引物链延伸反应在引物链延伸反应在37下进行，轻易发生模板下进行，轻易发生模板和引物之间碱基错配，此种酶催化和引物之间碱基错配，此种酶催化PCR技术虽较传技术虽较传统基因扩增具备许多突出优点，但因为酶不耐热，统基因扩增具备许多突出优点，但因为酶不耐热，在在DNA模板进行热变性时，会造成此酶钝化，每模板进行热变性时，会造成此酶钝化，每加入一次酶只能完成一个扩增反应周期，给加入一次酶只能完成一个扩增反应周期，给PCR技技术操作程序添了不少困难。这使得术操作程序添了不少困难。这使得PCR技术在一段技术在一段时间内没能引生物医学界足够重视。时间内没能引生物医学界足够重视。PCR技术PCRPCR技术简史技术简史第102页PCRPCR技术简史技术简史l1988年初，年初，Keohanog改用改用T4DNA聚合酶进行聚合酶进行PCR，其扩增，其扩增DNA片段很均一，真实性也较高，只有所片段很均一，真实性也较高，只有所期望一个期望一个DNA片段。但每循环一次，仍需加入新酶。片段。但每循环一次，仍需加入新酶。PCR技术第103页l1988年年Saiki等从温泉中分离一株水生嗜热杆菌等从温泉中分离一株水生嗜热杆菌(thermusaquaticus)中提取到一个耐热中提取到一个耐热DNA聚合酶。为与大肠杆菌聚合酶。为与大肠杆菌多聚酶多聚酶IKlenow片段区分，将此酶命名为片段区分，将此酶命名为TaqDNA多聚酶多聚酶(TaqDNAPolymerase)。此酶发觉使。此酶发觉使PCR广泛被应用。广泛被应用。PCR技术PCRPCR技术简史技术简史第104页TaqDNA聚合酶特点：聚合酶特点：l耐高温，在耐高温，在70下反应下反应2h后其残留活性大于原来后其残留活性大于原来90%，在，在93下反应下反应2h后其残留活性是原来后其残留活性是原来60%，在，在95下反下反应应2h后其残留活性是原来后其残留活性是原来40%。l在热变性时不会被钝化，无须在每次扩增反应后再加新在热变性时不会被钝化，无须在每次扩增反应后再加新酶。酶。l大大提升了扩增片段特异性和扩增效率，增加了扩增加大大提升了扩增片段特异性和扩增效率，增加了扩增加度度(2.0Kb)。因为提升了扩增特异性和效率，因而其灵敏性。因为提升了扩增特异性和效率，因而其灵敏性也大大提升。也大大提升。PCR技术PCRPCR技术简史技术简史第105页PCRPCR基本原理基本原理lPCR反应条件lPCR过程lPCR特点标准标准PCRPCR反应体系反应体系4种dNTP混合物 各200umol/L引物 各10100pmol模板DNA 0.12ugTaq DNA聚合酶 2.5uMg2+1.5mmol/LPCR技术第106页PCRPCR基本原理基本原理lPCR反应条件lPCR过程lPCR特点第107页PCRPCR基本原理基本原理lPCR反应条件lPCR过程lPCR特点第108页第109页PCRPCR基本原理基本原理lPCR反应条件lPCR过程lPCR特点1234522557294时间（min）温度（）适温延伸3高温变性1低温退火2重复13步2530轮目DNA片段扩增100万倍以上DNADNA双螺旋双螺旋DNADNA单链单链与引物复性与引物复性DNADNA变性变性形成形成2 2条单链条单链子链延伸子链延伸DNADNA加倍加倍PCR技术第110页PCR基本原理lPCR反应条件lPCR过程lPCR特点1234522557294时间（min）温度（）适温延伸3高温变性1低温退火2重复13步2530轮目DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性子链延伸DNA加倍DNA变性形成2条单链模板DNA95PCR技术第111页PCR基本原理lPCR反应条件lPCR过程lPCR特点95 50引