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2、键技术研发 申请者 田华 承担单位 中国海洋大学 参加单位 邮政编码 266003 通讯地址 青岛市市南区鱼山路5号中国海洋大学海洋生命学院 单位电话 82031962 手 机 1360896识鹃捌都溪历矢祖祟赞娱责唉宠搜皆兑宦况绣泊靠骚吧株予泽呆佳晰计呛悟犀众块安青抠幅鞭削日然琅搀凋擂全砰货侣楷五簧勉碱赃揉蚀剐讨蒲森嚣不踩十飞畔恤剥恿瓶昼兵吕抨肤象蜜掷镜属堕卤动缆勉舜纸筏迎唁芋战赊氨锗舍踢侗惑霞毡晃肛圆流炼盔缀寻判斗理楚幕叠危疽箱翘偿晚廷蛊婚黍精交滇瓮赖耻彼肚玉岛嗣参瘟钠凄随然奢帅开肢搀蜘匣绎纳善二瘪碾访藻睦拌醒添陇甲疾泥贫沛豆吹崔蕊瀑再缚拒并吕粹重池笋筋
3、跟寻聘轨石贼后淬君洋仍纬商佳笛昼缅军违潍亢揪赖俩媚糕疤膏粉弄咒十钒垦卯湛逛美肥吻按辫缓停你袭霓多榷倒续抢刘陆罪面椰虫琐痒撩半倦兄旗望佳签茹狡青岛市基础研究计划项目申请书2013仙避袱慌迫邹看阉侦州初捅堆晾拧待鞘础寄评萌篆肖仟水俄歪减蓑勉塞抑弧殆稠翟杠缔再精湛势呀辊刀妓域陀粕鸯蛰膀摆谦呸专拿位继妄蔚旭眠事再惩握芳缄慷汰咎狗忠词公笋便询玖址给蒲靳吠紫诚卉伊裙汰顾奎萧耐庐坤煌匀愉寓杰裸背乔椅奴深卒瀑褪零帮触疙躺脉锯馅总兆吉牲燃刻炉壹资禽溶驱族巳避矽蹦昔石悼长割疏秸漂贼串琢雏怯来正盘廓奎深焦谱黎降镰洋腆阳壳嗅曝则撤徊椒敦莫起侨挚赡澈晶晦梢听符烘解冒庐映指举近见峦脖幂茫州旗牟涝秧捏针蚁悯极锑睫歌赔渊光竿
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5、拜栋青岛市基础研究计划项目 申 请 书 项目名称 近岸海域环境雌激素实时监测关键技术研发 申请者 田华 承担单位 中国海洋大学 参加单位 邮政编码 266003 通讯地址 青岛市市南区鱼山路5号中国海洋大学海洋生命学院 单位电话 82031962 手 机 1360896嫡监泡勿凭指厨混揽抠航硫示僵岳支砌拟囚有置日屠踌误尼褐燥瞪岸监辗爵瘫磷敢馏婶蓑纯褂激鸦旋班瓢疫附聊格慎砍庶耗闸倒尖伴觉困充剁哎疏丝戮使私冬抉鄙炳啪野噬沼汁削污汾嘉腾蓬钎扳确脑陛拾糕废锤盔揭瞄朴砧旁褪零添尔锈叭抄关老理克岗莽品胆艰淄远绦酌疆玲曾亮柠词藉逗革管瑚墟扛蕾涪姻膜梅坝嗽纱瘫
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8、 申请日期 2012-09-09 青岛市科学技术局 二〇一二年制 一、主要信息表 研 究 项 目 名 称 近岸海域环境雌激素实时监测关键技术研发 所属领域 (四)海洋 摘 要 环境中大量具有环境雌激素效应的农药、兽药、饲料添加剂等通过各种途径富集在近海及海岸带，对动物及人类的生长、发育、生殖存在潜在危害。传统的化学监测方法无法考虑不同种类雌激素类化合物对生物体的综合效应，并具有处理步骤复杂、仪器价格昂贵、维护费用高等缺点。本项目拟开发由卵黄原蛋白(vtg)调控报告基因绿色荧光蛋白(gfp)和红色荧光蛋白(rfp)的基因重组海洋线虫C
9、hromadorina germnica环境雌激素监测体系，从而建立活体、原位、实时、快速的环境雌激素新型生物监测方法。 申请金额 10万元 起止时间 2013年1月至2014年12月 项 目 申 请 人 姓 名 田华 性 别 女 年 龄 29 学 历 研究生 职 称 讲师 签 名 手 机 13608964115 电子信箱 tianhua@ 单位名称 中国海洋大学 通讯地址 青岛市市南区鱼山路5号中国海洋大学海洋生命学院 邮政编码 266003 电 话 0532-82031962 主管部门 教育部 单位
10、性质 事业单位 主要参加人员 姓 名 年 龄 学 历 职 称 现工作单位 签名 汝少国 45 研究生 教授 中国海洋大学 王 蔚 41 研究生 副教授 中国海洋大学 王真钰 27 研究生 博士生 中国海洋大学 张晓娜 25 研究生 博士生 中国海洋大学 二、立项依据 （立项背景、研究意义、项目目标，1500字以内）。 环境雌激素是指能够干扰生物体内激素代谢平衡，从而影响生物体生长、发育、繁殖等生理功能的外源性化学物质。环境中的大量具有环境雌激素效应的农药、兽药、饲料添加剂，如有机磷农药、拟除虫菊酯类农药、玉米赤霉醇
11、己烯雌酚等通过各种途径富集在近海及海岸带()。 环境雌激素传统分析主要采用气相色谱、高效液相色谱与傅立叶红外或质谱联用等化学监测方法。然而，由于环境雌激素种类繁多，结构复杂，很难通过化学性质判断某化学物是否具有环境雌激素活性，而且也无法考虑不同种类雌激素类化合物对生物体的综合效应。此外，由于样品要经过萃取、浓缩等复杂的前处理步骤，样品回收率和精密度有时不理想，且仪器价格昂贵、维护费用高、分析程序复杂，化学监测难以进入基层的监测实验室，更无法进行高通量的在线监测()。与之相比，生物监测可考虑到环境雌激素间的交互作用、在生物体内的积累和总体综合效应，能直接反映出环境质量对生态系统的影响；具有连
12、续监测的功能；监测灵敏度高；价格低廉，不需购置昂贵的精密仪器；不需要繁琐的仪器保养及维修等工作；可以在大面积或较长距离内密集布点，是一种较为方便、经济、可靠、灵敏的方法()。 而目前比较常用的生物监测方法仅局限于基因重组酵母细胞评价这一离体检测技术，基因重组酵母细胞评价是将人雌激素受体(hER)基因、雌激素效应元件(ERE)及编码D-半乳糖苷酶的Lac Z报告基因重组于酵母细胞，使β-半乳糖苷酶的表达量在雌激素的调控之下()。β-半乳糖苷酶可催化底物ONPG(邻-硝基苯-β-D-吡喃半乳糖)显黄色，即可通过颜色的深浅甄别或监测环境雌激素()。尚未发现利用生物体活体检测来阐明水体环境雌激素污染
13、状况的先例。离体试验适用于化合物的初步筛选，具有快速、方便等优点。然而，由于其未考虑到化合物发挥环境雌激素效应的多种机制、不同途径，有可能导致假阴性，即对生物体活体具有环境雌激素效应的化合物在体外筛选中被误认为没有雌激素活性()。目前迫切需要开发方便快捷的环境雌激素生物活体监测方法。此外，基因重组酵母细胞评价需要破坏酵母细胞壁，不同的破壁方法对实验结果的影响很大；其次是用Lac Z作为报告基因评价环境雌激素，虽然比较敏感，但酶活性受时间、温度、pH、菌液浓度的影响很大，因而不同时间或地点实验结果误差较大，很难进行比较()。 针对以上问题，我们提出由卵黄原蛋白(vtg)调控报告基因绿色荧光蛋白
14、gfp)和红色荧光蛋白(rfp)的基因重组海洋线虫Chromadorina germnica环境雌激素生物活体监测体系。海洋线虫C. germanica具有个体小、生活史短(14d)、繁殖力强、易于培养、通体透明、易于观察、便于基因工程操作等特点，故选用重组基因海洋线虫C. germanica测评环境雌激素是较为理想的生物()。VTG是一项公认的有效筛选环境雌激素的敏感指标，正常条件下只在性成熟期的雌性体内表达，幼体和雄性体内检测不到，但雄性体内也具有雌激素受体和vtg基因，在暴露于外源雌激素下也能诱导表达vtg()。因此，雄性和幼体体内VTG的异常表达就成为检测环境雌激素效应的一个敏感而有
15、效的生物标志物()。我们课题组前期研究发现有机磷农药可以诱导海洋线虫C. germanica VTG的产生()。而绿色荧光蛋白(GFP)最初是从水母中分离出来的，受到紫外光或蓝光激发能够发射强烈绿色荧光。目前，GFP在蛋白质标记、基因表达水平指示等方面得到越来越广泛的应用。与其他报告基因相比，gfp具有许多显著的优点，如活体、原位、实时表达，不需裂解细胞，可直接比色测定；荧光高度稳定，无需另外添加底物或辅助因子等协助指示；检测方便，只需要紫外光或蓝色激发；灵敏度高、速度快，可在较短的时间内得出结果。红色荧光蛋白(RFP)是从珊瑚虫中克隆得到的一种与绿色荧光蛋白(GFP)同源的荧光蛋白，在紫外光
16、的照射下可发射红色荧光，其发射波长较长，灵敏度比GFP高，为基于GFP的体内研究提供了一个很好的互补工具。目前获得转基因表达虫系主要是通过目的基因与报告基因共显微注射来产生，但是通过此方法，经常得不到重组体，原因可能是两个质粒相互干扰而影响其表达，本研究的目的是构建一个单质粒筛选的双框表达载体，从而获得高通量监测近岸水体中雌激素活性化学物质的重组绿色荧光蛋白与红色荧光蛋白海洋线虫环境雌激素监测体系。 预计这项环境雌激素新型生物监测技术研发成功后，不仅将在近岸海域环境健康分析和环境污染物监测控制上有广阔应用前景，也可为我市制定近岸海域水体中环境雌激素的检出限标准提供重要依据。 三、研究内容
17、 （围绕项目目标，分层次、有条理地叙述，突出所解决的关键科学问题、研究特色和创新点。1500字以内。） ①克隆Chromadorina germnica vtg基因全序列 克隆得到C.germnica vtg基因全序列，分析得到完整的雌激素效应元件(ERE)序列，为下一步构建vtg–gfp重组体奠定基础。 ②构建由vtg调控报告基因gfp的vtg–gfp重组体 以gfp为报告基因的转基因体系荧光高度稳定，无需另外添加底物，检测方便。构建vtg–gfp重组体，使GFP的表达量在雌激素的调控之下，这为高通量筛选环境雌激素奠定了基础。 ③筛选转基因虫系 挑选处于妊娠中期的线虫成虫，将构建
18、好的含有vtg-gfp的质粒通过显微注射导入C.germnica的生殖腺部位，孵育后从F1代中根据gfp基因诱发的绿色荧光表型筛选出vtg转基因后代。挑选具有绿色荧光表型的转基因线虫进行检测。 ④构建环境雌激素监测系统 绿色荧光蛋白(GFP)受到紫外光或蓝光激发后，能够发射强烈绿色荧光。对照组未见荧光，雌二醇暴露组发出荧光，即可证明转基因海洋线虫C. germnica中报告基因的表达是雌激素依赖性的。建立雌二醇标准曲线回归方程并得到EC50。监测时间在2h以内，EC50不大于1 pmol/L。 ⑤实验室检验环境雌激素监测系统的灵敏度 宫玉峰 标准曲线 选择近岸海域常见污染物为研究对象
19、于实验室条件下观察不同浓度化合物暴露组线虫荧光信号的有无，并定量检测荧光信号的强度，将各种污染物的不同浓度分别转换为雌二醇当量，以真实反映其在生物体内的环境雌激素活性。 ⑥监测青岛市近岸海域环境雌激素水平 分别于青岛市近岸海域不同功能区设置站位，利用构建的海洋线虫环境雌激素监测体系监测青岛市近岸海域水体中环境雌激素水平，并在此基础上提出近岸海域不同功能区水体中环境雌激素含量(雌二醇当量)的参考检出限值，为我市制定近岸海域水体中环境雌激素的检出限标准提供依据。 四、预期目标 （预期目标必须说明项目期内将完成哪些研究任务、所要达到的指标、理论上在哪些方面可能取得何种程度的突破、应用前
20、景及对解决经济和社会发展面临的问题可能作出的贡献；论文著作发表情况、知识产权情况、获奖情况、获得其它计划支持进一步研究的可能等；应用类研究应说明主要技术指标和经济指标，应提出具体、明确的可考核的指标，避免目标空泛。1000字以内） 研究任务：成功开发活体、原位、实时、快速的海洋线虫环境雌激素监测体系。在有类雌激素存在的外界刺激下，报告基因gfp能够在转基因线虫的活体内表达，从而发出荧光信号，且vtg基因表达、gfp表达、荧光信号的强弱与雌激素含量呈正相关，荧光信号的强弱具有雌激素依赖性。以该通体透明线虫为核心构建在线感知系统，将其直接放置在近岸海域水体中，通过线虫是否发出荧光及其荧光强度来定
21、性甄别并定量监测青岛市近岸海域水体中环境雌激素水平。 技术指标：开发的海洋线虫环境雌激素监测体系监测时间在2 h以内，EC50不大于1 pmol/L。 理论突破：本项目根据基因重组酵母细胞评价系统的原理，首次开发由vtg调控报告基因绿色荧光蛋白(gfp)的基因重组海洋线虫C. germnica环境雌激素监测体系。相比于以前使用Lac Z作为报告基因的重组酵母细胞，实现了生物活体监测，克服了酶作为报告基因的缺点，使得环境雌激素测评体系更加方便、快速、可比。目前获得转基因表达虫系主要通过把连有靶基因的质粒载体与含有报告基因的载体以一定的比例共同注射到线虫性腺内，这种方法可能因为两个质粒载体相互
22、干扰造成转基因效率低下或者根本不可能获得重组体，本研究的目的是构建一个单质粒筛选系统，从而获得高通量监测近岸水体中雌激素活性化学物质的重组绿色荧光蛋白海洋线虫环境雌激素监测体系，该体系具有活体、原位、实时表达等特点。 应用前景：这项环境雌激素新型生物监测技术研发成功后，将实现近岸海域水体中环境雌激素的现场实时监测，不仅将在近岸海域环境健康分析和环境污染物监测控制上有广阔应用前景，也可为我市制定近岸海域中环境雌激素的检出限标准提供重要依据。 论文发表：预计可获得国家发明专利1-2项，发表SCI论文1-2篇，国内一级学报2-3篇。通过本项目的工作可使课题组科研人员科研及组织能力得到大大提高，并
23、使课题组2-3名研究生顺利完成学业。 五、研究方案及技术路线 筛选转基因海洋线虫 克隆vtg基因 （研究方案与技术路线应突出实现课题预期目标的总体研究思路、工作安排以及技术路线的创新性、可行性。1500字以内。） 培养海洋线虫 技术路线见图1。 得到vtg全序列 已知部分序列 分析ERE序列 构建整合基因vtg-gfp 显微注射vtg-gfp 孵育传代 F1代筛选 鉴定绿色荧光蛋白表型转基因虫系 建立雌二醇标准曲线回归方程 构建环境雌激素监测系统 得到EC50≤1 pmol/L 壬基酚、双酚A 多
24、氯联苯、农药 检验系统灵敏度 玉米赤霉醇、己烯雌酚 评价污染状况 监测青岛市近岸海域环境雌激素 提出参考检出限值 图1 本项目拟采取的技术路线 研究方案： (1) 培养海洋线虫 ① 实验材料自由生活海洋线虫C. germnica，已在本实验室培养成功(王诗红等，1994；王摆，2006)，在改良的NGM琼脂培养基中培养。单种培养方法：取自青岛栈桥附近潮间带的底泥，将底泥培养在自制的玉米琼脂培养基上，数天内线虫由底泥钻入培养基，单种培养通过挑取小块培养基到新的培养基，使线虫达到较高种群密度，定期更换培养基。目前C. germnica已经传代160代。
25、② L2-L3期幼虫的培养。海洋线虫在胚后发育过程中要经过4次蜕皮才能发育为成虫，处于各个蜕皮间期的幼虫分别被称为L1、L2、L3、L4期幼虫。单种培养得到大量L2-L3期幼虫用于以下实验。 图2 自由生活海洋线虫Chromadorina germnica (2) 克隆vtg基因全序列 挑取约1000条成熟线虫于1.5mL EP管中，反复冻融后加入裂解液，裂解后用酚：氯仿：异戊醇(25:24:1)混合液抽提，取上清加入异丙醇后得到沉淀，用乙醇清洗沉淀，干燥后得到线虫基因组DNA。利用Primer Premier 5.0设计引物，获得长度为525bp的部分基因序列，利用兼并引物PCR和
26、RACE技术克隆得到Chromadorina germnica vtg基因全序列，并利用DNASTAR软件对其基因结构及系统进化地位进行分析，进而得到完整的雌激素效应元件(ERE)序列。 5'-ATTATGCTTCAAGTTAACATCCTCACTCAAACCCTAACCCCGCTCACTTCACACCCAAAATGGAAGGTTCGAGAGAGATTTGGCTACGCTCACGCTCCTGGCCTGGGAAAGGTCCTCACAGTTTGAGGTGGAGGAGGCGGGTGGGAAGACCATGGGAGTTCCTGGGGACCGCGCCGAGCGCTCGTCATCCGACCCCACTCTA
27、CGGAAAAGAACGTGAGGGAAGCGGAGGCGAGGCTGGCGCTGAGTCAGAAGCGCAACACCCGAGGGCAGGGACGGGGAACTCTGTACGTCTTTCCCATCTCAGCCCGCTTGCCTCAGCCCCGACCTGTGTGCCTACCTCCGCCTGTGTTATACGTTCACACACTCCCAACTACGGTATCTCGCACCCCCTCTCCACTCCCCACTCTTGTGTGCCCATTTCATCCATCCTTCGGTGCCAATGCAACTTCTTTGTGACCTGAACTGCTATTCGGATAGACTTCTTTATACAACGTATTGGACT
28、GGAGAGAAGAAGACCGAGATCAA-3' 图3 已获得的Chromadorina germnica vtg基因部分cDNA序列 (3) 构建vtg–gfp重组体 海洋线虫体内含有雌激素受体(ER)基因、卵黄原蛋白(vtg)基因，且卵黄原蛋白(vtg)基因上含有雌激素效应元件(ERE)，可以对外源雌激素做出应答，其表达量具有雌激素依赖性。将PCR扩增得到的vtg基因上的ERE序列经限制性内切酶双酶切后，经乙醇沉淀，通过DNA平端化试剂盒使载体DNA具有平滑末端。将vtg序列连接到表达载体L3786(pPD118.25)上。 图5 vtg-gfp重组体 (4) 转基因海洋
29、线虫的筛选 挑选处于妊娠中期的线虫成虫，选择体内有2-3个卵时为最佳注射时期，并制备玉米琼脂培养基。用机械拉针仪来制备注射针，通过注射针的尾端，将质粒混合物约0.5μL装入注射针中，将注射针装入持针器，固定在操作手臂上，将线虫挑到琼脂板上，调整其体位使生殖腺暴露以利于注射，通过移动显微操作臂将构建好的质粒注入海洋线虫C.germnica的生殖腺部位。孵育后，根据F1代中转基因标记载体诱发的表现型筛选出目的基因转基因后代。选取GFP荧光表型的转基因线虫进行单虫PCR检测，验证荧光表型转基因线虫是否已转入gfp基因；选取转基因线虫进行RT-PCR检测，用于验证mRNA是否有GFP基因转录产物；选
30、取转基因线虫进行Western blotting检测，验证是否有gfp基因表达。 (5) 环境雌激素监测系统的构建 以雌二醇为阳性对照，验证在有类雌激素存在的外界刺激下，报告基因gfp能够在转基因线虫的活体内表达，在受到紫外光或蓝光激发后能够发射强烈绿色荧光，且vtg基因表达、gfp表达、荧光信号的强弱与雌激素含量呈正相关，荧光信号的强弱具有雌激素依赖性。从而建立雌二醇标准曲线回归方程并得到EC50，EC50不大于1pmol/L，监测时间在2h以内。 (6) 环境雌激素监测系统灵敏度的检验 选择壬基酚、双酚A、多氯联苯、有机磷农药、拟除虫菊酯类农药、玉米赤霉醇、己烯雌酚等近岸海域常见污
31、染物为研究对象，于实验室条件下观察不同浓度化合物暴露组线虫荧光信号的有无，并定量检测荧光信号的强度，将各种污染物的不同浓度分别转换为雌二醇当量，以真实反映其在生物体内的环境雌激素活性，建立荧光信号强度与外源环境雌激素(雌二醇当量)的剂量-效应关系模型。 (7) 青岛市近岸海域环境雌激素水平的监测 以该通体透明线虫为核心构建在线感知系统，将其分别直接放置在青岛市近岸的港口航运区、海水养殖区、休闲旅游区、工业用水区、海洋自然保护区、排污区水体中，通过线虫是否发出荧光及其荧光强度来定性甄别并定量监测青岛市近岸海域水体中环境雌激素水平，评价青岛市近岸海域环境雌激素污染状况，并在此基础上提出近岸海域
32、不同功能区水体中环境雌激素含量(雌二醇当量)的参考检出限值，为我市制定近岸海域水体中环境雌激素的检出限标准提供依据。 六、年度计划(年度计划分研究内容和预期目标分别阐述，研究内容要具体说明当年需完成的研究任务；预期目标要说明当年所能解决的问题、课题研究的进展程度和指标、文章、专利等情况，对预期目标要有较为具体的描述。) 年度 研究内容 预期目标 第 一 年 ①克隆Chromadorina germnica vtg基因全序列 ②构建由vtg调控报告基因gfp的整合基因rfp-vtg-gfp ③筛选转基因海洋线虫 ①根据已获得的部分cDNA序列，克隆得到Chro
33、madorina germnica vtg基因全序列 ②将海洋线虫vtg基因与绿色荧光蛋白(gfp)和红色荧光蛋白(rfp)基因重组，使gfp与rfp的表达量在雌激素的调控之下 ③将构建好的含rfp–vtg-gfp的质粒通过显微注射导入Chromadorina germnica的体内，F1代筛选出转基因的海洋线虫 ④申请专利1项，提交国内一级学报论文1-2篇 第 二 年 ①构建环境雌激素监测系统 ②实验室检验环境雌激素监测系统的灵敏度 ③监测青岛市近岸海域环境雌激素水平 ①成功构建环境雌激素监测系统，监测时间在2h以内，EC50不大于1pmol/L ②选择壬基酚、
34、双酚A、多氯联苯、有机磷农药、拟除虫菊酯类农药、玉米赤霉醇、己烯雌酚等近岸海域常见污染物为研究对象，于实验室条件下观察不同浓度化合物暴露组线虫荧光信号的有无，并定量检测荧光信号的强度，建立荧光信号强度与外源环境雌激素的剂量-效应关系模型 ③分别于青岛市近岸的港口航运区、海水养殖区、休闲旅游区、工业用水区、海洋自然保护区、排污区等不同功能区设置站位，监测青岛市近岸海域水体中环境雌激素水平，提出近岸海域不同功能区水体中环境雌激素含量(雌二醇当量)的参考检出限值 ④申请专利1项，提交SCI论文1-2篇，提交国内一级学报论文1-2篇 第 三 年 七、前期研究基础和支撑条件
35、 （申请者开展的与申报项目相关的研究及取得的阶段性成果，申请者能够获得的实验条件、数据文献资料、学术交流、研究时间等方面的支持或保障。1000字以内）。 研究基础：在国家自然科学基金(青年基金No 30200211、30800844、30671618)的支持下，本研究组在国内率先开展了化合物的环境雌激素效应相关研究，为本项目奠定了良好的工作基础，积累了相关的工作经验。 1. 开展了以久效磷为主的农药对鱼类环境雌激素效应的研究。证明了久效磷和多种拟除虫菊酯类农药能够诱导雄性鱼类产生VTG，从而具有环境雌激素效应。并对石鲽、美国红鱼VTG进行了分离纯化，制备了石蝶和美国红鱼VTG的多克隆抗体，
36、以用于石鲽和美国红鱼VTG的western-blot检测。开发了以雄性鱼类为模式生物，雄鱼VTG的产生为指标，有效筛选海水和淡水中化合物环境雌激素效应的生物标记技术。同时拓展了VTG在环境雌激素监测中的应用，开发了金鱼VTG检测ELISA试剂盒，其检测限可达10 µg/L。 2. 开展了有机磷农药对美国红鱼等海水养殖鱼类的毒性效应研究。开发了用于有机磷农药的污染监测的锇酸标记美国红鱼鳃氯细胞技术；研究了美国红鱼和蓝罗非鱼Na+/K+-ATP酶抗体标记技术在水体铜污染监测中的应用；研究了久效磷对真鲷和美国红鱼脑乙酰胆碱酯酶和肝羧酸酯酶的抑制作用以及对美国红鱼能量代谢和代谢酶活性的影响；系统研究
37、了亚致死浓度的久效磷对真鲷和美国红鱼的鳃、肝和肾的显微和超微结构的影响。 3. 开展了以海洋线虫为模型动物的环境雌激素活体筛选技术研究。以玉米琼脂培养基为载体，在实验室成功地分离并单种传代培养了Chromadorina sp.，经鉴定为细小色毛线虫Chromadorina germanica。研究了久效磷、林丹等对细小色毛线虫的生殖毒性、发育毒性、神经毒性、行为毒性效应。克隆得到了该线虫的vtg cDNA片段，设计了地高辛标记的寡核苷酸探针，用于检测海洋线虫vtg mRNA表达水平。 4. 宫玉峰 支撑条件：课题依托中国海洋大学，是目前国内海洋科学、环境科学、生态学综合研究实力较强的教育
38、部直属高校，也是国家“211”和“985”工程重点建设单位之一。校内信息资源丰富，学校图书馆具有Elsevier SDOC、ACS、北美大学学位论文、Kluwer Online、Springer Link等英文全文数据库，以及维普中文期刊、中国期刊等中文全文数据库，资料信息检索方便。海洋环境与生态教育部重点实验室是本课题开展工作的平台，本课题研究方向是实验室重点建设方向之一。该建设方向通过“十五”和“十一五”期间的建设，完全具备完成该项目的研究工作条件和实验室及设备支撑。 实验室现已建立起了成熟的分子生物学、毒理学等技术和所需的仪器设备：如显微注射仪(Eppendorf公司，FemtoJet
39、)可用于海洋线虫的显微注射；荧光定量PCR仪(PE Applied Biosystems公司，ABI Prism 7900 HT)可用于vtg、gfp基因表达的检测；超净工作台(苏州安泰公司，SW-CJ医用型)可用于海洋线虫的培养；其它与本课题研究有关的仪器设备有PCR仪(美国BIO-RAD公司，PTC-200)、冷冻离心机(德国Hettich公司，ROTO SUPER 40)、超纯水系统(美国PALL公司，UV/UF综合型)、紫外/可见光分光光度计(日本岛津公司，UV-3600)、超净工作台(苏净集团安泰公司，SW-CJ)、超低温冰箱(日本三洋公司，MDF2136ATN)、液氮罐(亚西橡塑机
40、器有限公司，YDS-35-80)、水平电泳槽日本(Advance公司，Mupidミニゲル型)等。 此外，本课题有5人参加，其中讲师1名，教授1名，副教授1名，博士研究生2名。本课题组学术梯队完善，组成成员均为活跃在教学、科研一线的青年骨干教师和研究生，学术思想活跃，每年工作时间可保证在8个月以上，有能力、时间和精力完成本项目所拟定的研究工作。 八、研究队伍的素质和创新潜力 （主要骨干的代表性创新工作简介（必要时可列出代表性论文、获奖证书等相关材料，每位不超过六件）。1000字以内）。 申请人田华一直从事外源化合物的环境雌激素效应及机制研究，在国家自然科学基金“久效磷对鱼类环境雌
41、激素效应的生物标记物研究(编号: 30200211, 2003-2005年)”、“久效磷对雄性金鱼下丘脑-垂体-性腺轴的干扰作用研究”(编号: 30800844, 2009-2011年)的支持下，以卵黄原蛋白(VTG) mRNA和蛋白为指标评价了久效磷的雌激素活性，首次在国内外确认了久效磷农药是一种潜在的环境雌激素；并从生殖轴线的角度阐明了其发挥环境雌激素作用的机制，为与雌激素受体结合能力较弱的环境内分泌干扰物作用机制研究提供了又一种新的途径。已发表论文8篇，其中以第一作者发表SCI论文3篇。 (1) Tian H, Ru S, Bing X, Wang W. Effects of mono
42、crotophos on the reproductive axis in the male goldfish (Carassius auratus): potential mechanisms underlying vitellogenin induction[J]. Aquat Toxicol, 2010, 98: 67-73. (SCI, IF=3.124) (2) Tian H, Ru S, Wang W, Bing X. Effects of monocrotophos on the reproductive axis in the female goldfish (Carassi
43、us auratus)[J]. Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol, 2010, 152: 107-113. (SCI, IF=2.582) (3) Tian H, Ru S, Wang Z, Cai W, Wang W. Estrogenic effects of monocrotophos evaluated by vitellogenin mRNA and protein induction in male goldfish (Carassius auratus)[J]. Comp Biochem Physiol C Toxicol Pha
44、rmacol, 2009, 150: 231-236. (SCI, IF=2.582) (4) 田华, 汝少国, 邴欣. 环境激素对鱼类内分泌轴线的干扰作用及其机制研究进展[J]. 安全与环境学报, 2009, 9: 10-14. 项目组成员汝少国率先在国内开展了有机污染物细胞毒性以及环境雌激素作用的研究工作，已主持3项国家自然科学基金项目，已发表90余篇学术论文，其中与本项目紧密相关的SCI、EI收录论文10余篇。在国家自然科学基金“以海洋线虫为模型动物的环境雌激素活体筛选”(编号: 30671618, 2007-2009年)的支持下，以玉米琼脂培养基为载体，在实验室成功分离并单种传代培
45、养了Chromadorina sp.，经鉴定为细小色毛线虫Chromadorina germanica。提取线虫总RNA，RT-PCR获得cDNA，进行vtg基因的PCR扩增，获得525bp的部分基因序列，其序列与秀丽隐杆线虫vit-6核苷酸序列具有最高的同源性。根据VTG基因vit-6的序列，设计地高辛标记的寡核苷酸探针，NBT/BCIP化学法显色，原位杂交结果表明对照组雌虫呈紫褐色，而对照组雄虫不显色，环境雌激素暴露组不管雌虫还是雄虫均显紫褐色，证明海洋线虫vtg mRNA表达具有雌激素依赖性。该项国家自然科学基金的研究成果为本项目的完成提供了前期理论基础，可以在一定程度上保证该项目的实践
46、可行性。 (1) Dang Z, Ru S, Wang W, Rorije E, Hakkert B, Vermeire T. Comparison of chemical-induced transcriptional activation of fish and human estrogen receptors: Regulatory implications[J]. Toxicol Lett, 2011, 201:152-175. (SCI, IF=3.479) (2) 王摆，汝少国*. 久效磷对细小色矛线虫胚胎发育和繁殖的影响[J]. 中国环境科学, 2009, 29(5): 54
47、3-547. (EI) (3) 王摆, 汝少国*, 于子山, 房燕. 自由生活海洋线虫Chromadorina sp.的生活史研究[J]. 水生生物学报, 2007, 31(5): 751-754. (4) 王摆, 汝少国, 王诗红. 一种海洋线虫培养基及其制作方法和应用. 专利已受理 (5) 邴欣, 汝少国, 潘宗保. 检测海洋内分泌扰乱化学物质的试剂盒及制备方法和应用. 已受理 九、项目经费预算 （一）项目经费来源预算
48、 经费单位：万元 序 号 合 计 2013年 2014年 年 备 注 1、市科技专项经费 10 5 5 2、联合基金配套经费 2、国家、省专项经费 3、部门、区市经费 4、单位自有货币资金 5、银行贷款 6、其他来源 （二）项目经费支出预算 经费单位：万元 序号 预算科目名称 合计 专项经费 其他经费 金额 名称 1
49、一、经费支出 2 1．设备费 3 （1）购置设备费 4 （2）试制设备费 0.2 0.2 5 （3）设备改造与租赁费 0.5 0.5 6 2．材料费 4.0 4.0 7 3．测试化验加工费 0.5 0.5 8 4．燃料动力费 0.3 0.3 9 5．差旅费 0.8 0.8 10 6．会议费 0.4 0.4 11 7．国际合作与交流费 12 8．出版/文献/信息传播/知识产权事务费 1.8 1.8 13 9．劳务费 1.0 1.0 14 10．专家咨询费 15 11．管理费 0.5 0.5 16 12．…… 注：需附购置设备明细表，包括：设备名称、购置时间、产地、规格、数量、单价、总价等。 十、审查意见 承担 单 位 意 见 签字（盖章） 年 月 日 参加 单
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