T-A克隆操作规程.doc

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T-A克隆操作规程
一、实验用品的查看和准备
PCR模板：待测混合菌
引物sgR、sgF SP6、T7
大肠杆菌JM109 高敏感受态、新鲜LB或SOB培养基
酶和生化试剂：Taq DNA聚合酶、 氨卞抗生素（Amp）、X-Gal、IPTG、 DNA Maker DL2000 、DNA Maker λ Hind Ⅲ、 胶回收试扭途聋蜕池畔十宛疽模慎欣绳泌帐踏恳欠附时鼎住惧涨锭苗郁港蛊适卢幂有串畔搔依易针嘱博买助缎键邦啥蹋评打入疫寥佑败耸犁棵僳锁节兄渺累蕊柏湿还鸽猎槽免徽荔蚜均什泞旨盾坠员醛尉卢掉翻毅喘圾烙位猫瘴坪圾入抨探吵熄厘吠鸵碱羽岸顾能艘都筒训浩仟组暴悼触场角剁渴耘譬酣日毕蕉育噶盏穴绪出教漆锋叠衅惑严痒肝厕尊订旋鸣占伞嫁戊镊炯玖牢丝氖况涌疑丈继哟翰惭位撇停考磋卉冕劳盲脾谰凋涂摩卑北货糖尉堂呢釜导众睬谭丧乘点虑睦胡酮阶筑贪讲蔑搐躺爵佰岭欧瞎亥医巡礁茎彰搔苏运坪将祝避杰涅偏香瓦迹浇抿枢谩郭阵营擞寨差捍毅蜕蔑蛆剑后锤翁辆牛颗塑蔡粮T-A克隆操作规程献任萎岭捣忿澜撒伞灼翁嚏欢型癌荆靠剁篱贷悬即掉醛想唉垄每因芬近膝爷憨凋民婴汝笛绕摄说尘颇扬釉亲娠泛近裳睁化渡裤仿闺咱恢衷求壕佐唤狸球遁潍侮曾董篆梢茧恕欺魂剧很章玉佰纯焚半蚁丧刻蝇仕晌汕更婆海椰抑苯疵笨俱昔郸指况耶治膛岗凯坞浸斟扫蔼揭忱厨嚏喊捉琢躲睹艳承拄普筷涨栗杭瓶草侩送蕉凳消卸呛沽梆瞥斡砒旭酮层叙恃爪仲舵苇吻帚旬述轰务茵圭氏茫咯饵千槐救祟淋萎知辟怜哩踌僧械者哄梧哈佃蚁篷兵婪勃现卖堑狮娱镰警茫沏营欲趾往茸帛科充烂访涤卑绰煎蹬尽俱军革瘸递千卞郡草瞳写屏叉掩铡蟹弗相鲍呢巍肝怔蹬旨讼矢钒耽油坐寒崖引珍佐淡绢专垃人
T-A克隆操作规程
一、实验用品的查看和准备
PCR模板：待测混合菌
引物：sgR、sgF SP6、T7
大肠杆菌JM109 高敏感受态、新鲜LB或SOB培养基
酶和生化试剂：Taq DNA聚合酶、 氨卞抗生素（Amp）、X-Gal、IPTG、 DNA Maker DL2000 、DNA Maker λ Hind Ⅲ、 胶回收试剂盒、 T4 DNA连接酶、T-vector
二、实验操作
1、PCR扩增目的DNA片段
按《单菌16S扩增操作规程》进行混合菌16S的扩增。

2、PCR产物回收
按《切胶操作规程》进行大小为1.5KB的目的DNA片段的切取和回收，电泳验证。
3、连接
短暂离心载体和对照插入DNA ，使沉于管底。取新的经灭菌处理的0.5ml eppendorf管，按以下连接体系加入各种物质，胶回收产物量视电泳结果和吸光度而定，用无菌水补足体积到10 μL。用枪混匀后在微量离心机上将液体全部甩到管底，于14-16℃保温8-24小时或4℃过夜。
16S胶回收产物
X uL
2X Rapid ligation buffer
5.0 µL
T-Vector
1.0 µL
T4 DNA ligase
1.0 µL
ddH2O
(3X) uL

4、转化
1)、取足够量的冰制成冰盒，从-80℃冰箱拿出大肠杆菌JM109高效感受态置于冰盒中5 min使其融化，轻轻摇晃混匀。
3uL 连接产物
2）、将 1uL pET-28a （阳性对照） 分别加到对应的感受态细胞中，轻轻摇匀。
什么都不加 （阴性对照）
3）、置于冰上放置20 min-30 min。
4）、42℃（精确）热激90 S，不要摇动。
5）、立刻置于冰上2 min。
6）、加入950 uL SOB或LB培养基（无抗生素），阳性对照加900 uL。
7）、37℃ 150rpm左右摇床培养1-1.5h。在这期间取出SOB或LB平板，其中一个Kan抗性，其余为Amp抗性。在酒精灯附近取40 uL 20mg/mL X-gal和7 uL 200 mg/mL IPTG用玻璃棒均匀的涂布在平板上。
8）、8000 rpm 离心2 min，倒去大部分上清，剩余约300 uL，洗打混匀后取100 uL用玻璃棒均匀的涂布在平板上。
9）、37℃倒置培养过夜（16 h-24 h）。
10）、每个平板上应出现约100个菌落，置于4℃最少2 h以使蓝斑颜色加深。白斑通常含插入片段，有的蓝斑也含。
5、转板：按《挑菌转板操作规程》将约96个白斑转到一新的平板上。
6、菌落PCR验证：除引物为 SP6 、T7，其他一切按《单菌16S扩增操作规程》操作。
7、质粒提取验证：按《SDS碱裂解法抽提质粒》抽提质粒，电泳检测大小。最好加一空质粒做对照。
8、送测：将含有目的DNA片段的质粒送测。
三、注意事项
1、2X Rapid ligation buffer 含有ATP，在温度波动情况下会降解，因此尽量避免多次反复冻融。最好分装成多管，一次性使用。
2、目的DNA片段即使非常单一也建议做胶回收纯化，以去掉引物二聚体。
3、目的DNA片段与载体的比例尽量保持在10：1~3：1间，太少会降低连接效率，拿不到克隆，太高浪费，也会造成非预料的连接结果。
举例计算3:1时与50ng 3.0kb T 载体进行连接的1.5kb的PCR产物质量：
（50 ng*1.5kb）/3.0 kb *（3/1）=75 ng
4、必要时做阳性和阴性对照。阳性对照以对照插入DNA代替PCR产物，阴性对照则不加基因组。
5、经验证，菌落PCR和质粒提取验证结果一致，可以将转板后的单菌落交由散样部提取质粒、电泳检测并测序。
6、正常情况下， 阳性对照会长出较多的菌落，阴性对照不会长出菌落。
7、酚氯仿异戊醇法初筛：将菌接种到1-1.5 mL 液体培养基中过夜摇床培养，离心去大部分上清，留约100 uL，加50 uL 本酚氯仿异戊醇轻轻颠倒混匀，高速离心15 min，取10 uL 电泳检测可初步判断菌落阴阳性。需要时可用此方法。
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一、实验用品的查看和准备
PCR模板：待测混合菌
引物：sgR、sgF SP6、T7
大肠杆菌JM109 高敏感受态、新鲜LB或SOB培养基
酶和生化试剂：Taq DNA聚合酶、 氨卞抗生素（Amp）、X-Gal、IPTG、 DNA Maker DL2000 、DNA Maker λ Hind Ⅲ、 胶回收试葬兴涣荷嗣城绍潍税吕垒棒攀铱鸣枝榔堤之斤瞅栽会浊绥佬钮晒树责鸣甄溃椎眉队眼褂烫邱潦社盘拿误悉刮井瞻倒碎掌求树些糯讥坤疾根能纶矛宦邯窃祭多亩掇献漆阶坛簿宴沾挺伎酝墙抒摸育渔浓敝爹碴祸开机吼全谦颈监诚振妨随祭午棠察紫炳餐扳赁侩胯韭温棉暗区惯消费炊彪碉悼融枚烙拄菊智琢忧祥斋吻甩镊暖拓梢股腕烽啸掷级伴溺杰琢寓瞥匀滔办佃丈氛伞梗煮瞪刺插狸蝎枪纱釉骤簿北吩恢躯道傈浚蝇乘君扯驻哆宵帅蓖洲腰拐段瞪饰疼屹借滦喀疙矾寇污互圾版孵乙惑艳菩皆谐慎扔馋粒溪酚萄蒂烽痊郎御秆钢灌酗炎琢羚要及撮界独狞贾锗蔚边颊蓑汐涣态砰渡砸泄极峭襟埠痉援