高通量测序在生物学的应用省公共课一等奖全国赛课获奖课件.pptx

高通量测序技术在生物学中应用第1页主要汇报内容高通量测序介绍高通量测序介绍从头测序及其应用重测序及其应用转录组测序及其应用Small RNA测序及其应用第2页HGP项目：20世纪90年代美国能源部资助开启人类基因组计划，六个国家科学家耗资4.37亿，于完成人类基因组工作草图。方法和结果：应用分层shotgun+Sanger测序法，结果预测了31,000个基因，证明基因组95%是非编码序列。意义：人类基因组测序完成标志着分子医学时代到来；此项目也催生了高通量测序技术。Nature()409:860-921人类基因组从头测序分析人类基因组从头测序分析分层shotgun测序法第3页Sanger测序技术测序技术PCR末端终止技术+电泳检测技术单个片段序列测定最高通量：小于4MB/天基于平板胶测序技术96通道毛细管阵列第4页高通量测序技术高通量测序技术 Shot Gun Shot Gun文库构建文库构建DNADNA片段固定片段固定簇序列读取反应簇序列读取反应图像取得和处理图像取得和处理序列组装和比较序列组装和比较单条模板扩增单条模板扩增1234T T T T T G C T 第5页123789456T T T T T T T G T T G C T A C G A T 高通量测序技术高通量测序技术第6页主要测序技术平台主要测序技术平台Metzker,Nature Reviews Genetics()11:31第7页主要汇报内容高通量测序介绍从头测序及其应用从头测序及其应用重测序及其应用转录组测序及其应用Small RNA测序及其应用第8页454技术完成5倍测序深度；GAII技术完成20倍测序深度；Sanger技术完成6倍覆盖度（Dalloul et al.PLoS Biol()8:e1000475）各种技术平台联合应用完成火鸡基因组从头测序各种技术平台联合应用完成火鸡基因组从头测序测序数据统计第9页火鸡基因组从头测序火鸡基因组从头测序结果：覆盖火鸡基因组 90%（0.92/1.1Gb），发觉6M SNP，预测 16K个基因。火鸡和家鸡测序拼接结果第10页火鸡基因组从头测序火鸡基因组从头测序发觉了数千个禽类特有基因，尤其是性染色体基因研究令人兴奋。禽类中特有基因第11页火鸡基因组从头测序火鸡基因组从头测序为研究者提供火鸡质量和数量生产性状和抗病候选基因，加速了火鸡育种进展。与家鸡基因组比较火鸡基因组中20种基因家族分布情况三种鸟类基因比对结果四种禽类不一样氨基酸含量情况第12页意意义义：第一个完全利用高通量测序技术模式完成动物基因组从头测序；方方法法和和结结果果：不一样插入片段测序文库双末端测序技术尝试：包含150bp、500 bp、2 kb、5 kb 和10 kb不一样插入片段，测序深度达73倍，覆盖94%基因组区域；取得2.7M SNP位点，证实大熊猫依然具备很高杂合率和较高遗传多态性；Li et al.,Nature()463：311-317 大熊猫基因组从头测序和组装大熊猫基因组从头测序和组装第13页大熊猫基因组从头测序和组装大熊猫基因组从头测序和组装利用9个Sanger测序BAC序列评价测序质量，表明98%BAC序列能够比对到scaffold上预测大熊猫约有21001个基因大熊猫与人、狗和鼠基因进化分析测序数据与BAC序列比较第14页构建不一样长度插入片段文库高通量测序基因组杂合度分析覆盖基因区预计得到框架图或更高覆盖度500bp fragment文库Paired-end测序，测序深度到达40以上3KB Mate pair文库Paired-end测序，测序深度到达60以上10KB Mate pair文库Paired-end测序，测序深度到达80以上基因杂合度5%，同时开启BAC-to-BAC测序基因组从头测序经典策略第15页从头测序数据分析和产出指指标标框架框架图图 覆盖基因组常染色体区域90%，覆盖基因区域95%，contig N50抵达5Kb，scaffold N50抵达20Kb，单碱基错误率在万分之一以下精精细图细图 覆盖基因组常染色体区域95%，覆盖基因区域98%，contig N50抵达20Kb，scaffold N50抵达300Kb，单碱基错误率在万分之一以下完成完成图图 完整基因组序列，单碱基错误率在十万分之一以下从头测序覆盖度指标从头测序覆盖度指标从头测序主要数据分析从头测序主要数据分析原始数据比对组装结果统计覆盖度、深度评价基因注释比较基因组及进化分析第16页蓝藻 1 Mb线虫 100 Mb果蝇100 Mb人 3,000 Mb基因和基因组进化小鼠 3,000 Mb第17页生物进化谱系树生物进化谱系树大鼠、小鼠、狗、大熊猫、牛家鸡、火鸡斑马鱼拟南芥、水稻、杨树、酿酒葡萄、短柄草、黄瓜、高粱、玉米1535个细菌基因组、49个真菌基因组和78个古细菌 利什曼原虫、椎体虫四类蓝藻隐藻蜜蜂第18页单分子测序技术及其对从头测序影响单分子测序技术及其对从头测序影响单分子实时测序，无需PCR扩增运行时间15min或者更短，读长到达5-50K，数据产出100-1000G；使人类基因组测序成本低于1000美元第19页主要汇报内容高通量测序介绍从头测序及其应用重测序及其应用转录组测序及其应用Small RNA测序及其应用第20页瑞士和美国科学家对8个家鸡品系和1个野生品系进行测序该研究能够用于动物育种及提升家鸡在生物医药研究模式动物中应用Rubin et al.,Nature()464:doi:10.1038经过全基因组重测序分析鸡驯养过程中位点选择第21页经过全基因组重测序分析鸡驯养过程中位点选择测序完成44.5倍测序深度，测序覆盖度达92%发觉7,000,000 SNP位点，约1,300插入/缺失位点研究发觉基因功效缺失突变在鸡驯养过程中没有显著性作用缺失影响编码区基因测序数据统计第22页筛选到两个基因GHR（以前验证）和SH3RF2在育种中含有功效在400个F8群体中分析SH3RF2缺失对鸡体重影响表明SH3RF2是筛选不一样鸡品系一个主要指标经过全基因组重测序分析鸡驯养过程中位点选择分析SH3RF2基因第23页中科院上海生命科学院、北京基因组所 等六家科研机构对150个水稻RIL系进行测序利用Illumina GA，每16个样一个道，以3个碱基为标签，测序读长为36碱基，每个样测序深度约0.02倍第一次利用全基因组重测序筛选SNP位点，对群体进行表型分析利用全基因组重测序分析表型差异第24页利用全基因组重测序分析表型差异分析两个亲本基因组差异发觉1,226,791 SNP位点，即3.2 SNPs/kb分析150个RILs发觉了1,493,461 SNP位点，即1 SNP/40kb试验设计第25页与以前该RILs重组图谱比较分析，在150个RILs中判定出2334个重组框，平均每个框大小约164 kb利用sliding window方法分析SNP位点与表型间关系与重组位点利用全基因组重测序分析表型差异Sliding window方法第26页分析株高，共判定出4个QTL，其中贡献率最强1个QTL位点含有一个sd1基因，该基因在已被报道。表明利用全基因组重测序能够进行准确QTL定位及基因定位利用全基因组重测序分析表型差异第27页重测序生物信息学分析内容重测序生物信息学分析内容第28页Genetech企业（已被罗氏制药收购）生物信息学与计算机生物学部，与Complete Genomics企业合作对一名烟龄超出，平均天天吸烟25根原发性肺部肿瘤患者进行分析，将这名患者癌细胞和相邻正常组织基因组进行测序对癌细胞完成了60倍测序深度，相邻正常组织完成了46倍测序深度。(Lee et al.Nature()465:473)肺癌组织比较基因组学研究肺癌组织比较基因组学研究测序数据统计第29页肺癌组织比较基因组研究发觉了超出5万个基因点突变，其中530个得到确认，它们当中392个在编码区域，包含以前已知变异，如KRAS“原致癌基因”突变和放大体细胞单核苷酸突变趋势和模式统计第30页MAPK信号通路中多个基因突变作用模式信号通路中多个基因突变作用模式肺癌组织比较基因组研究表明遗传上复杂肿瘤可能包含很多部分冗余突变，而且要识别复发性致癌“驱动突变”（driver mutation），将需要对很多还未测序样本进行测序。这些癌基因发觉对于未来研究肺癌靶向治疗，以及基因突变含有主要意义第31页犹他大学（University of utah），Complete Genomics企业，华盛顿大学等对一对夫妻和他们两个孩子进行了全基因组测序。这家两个孩子都患有米勒综合征和原发性纤毛运动障碍，这两种疾病都是常染色体隐性遗传病测序深度分别为父亲 88倍，母亲51 倍，儿子52 倍，女儿54 倍Coach et al.,Science()328(597):636 639 应用全基因组测序技术在家系中分析遗传力应用全基因组测序技术在家系中分析遗传力第32页父母和儿女测序覆盖度分别到达91%、85%、92%和91%与参考序列相比，96%序列最少在一个家系组员中被检测到，81%序列在家系四个组员中都检测到应用全基因组测序技术在家系中分析遗传力应用全基因组测序技术在家系中分析遗传力测序数据与NCBI参考基因组序列比较分析测序数据统计第33页经过比较两代之间基因组序列，科学家们对儿童基因组描绘出准确重组图谱。这让他们校正了70%测序错误，使测序准确率达99.999%。使研究人员准确确定了重组位点和稀有单核苷酸多态性。在他们最终分析中，只保留了四个候选基因突变，包含已知在纤毛运动障碍中突变基因以及造成米勒综合征变异体 应用全基因组测序技术在家系中分析遗传力重组图谱SNP分析第34页这些结果暗示对任何简单单基因遗传病，一个或两个家庭全基因组测序就有可能判定出致病突变 研究人员还第一次估算出两代人之间遗传突变率，即基因组从一代人到下一代人遗传过程中会发生多大程度改变，约为1.110-8。结果发觉，从父母到孩子基因变异率仅为之前医学界预期二分之一。应用全基因组测序技术在家系中分析遗传力第35页哈佛医学院计算遗传中心主任George Church提出PGP目标是创建一个包含100,000人、公众能够公开访问在线基因库，帮助科学家了解基因之间联络和遗传特征现已公布了1000人基因组序列个人基因组测序是个性化医疗保健基础 个人基因组计划（PGP）http:/www.personalgenomes.org/George Church 和他研究团体第36页重测序意义重测序意义在个体或群体水平进行差异性分析辅助分子育种，能够快速进行种质资源普查筛选遗传进化分析及主要性状候选基因预测遗传疾病分析第37页主要汇报内容高通量测序介绍从头测序及其应用重测序及其应用转录组测序及其应用Small RNA测序及其应用第38页RNA是遗传信息载体是遗传信息载体第39页应用RNA-seq分析葡萄浆果发育过程中转录组意大利维罗纳大学Vitis vinifera（葡萄）浆果发育三个阶段中（开花后5周、10周和15周，即着果期、转色期和成熟期三种发育阶段中）转录组研究数据量超出59M36至44bp读长，82%测序序列能够比对到基因组上 第一次使用RNA-seq分析葡萄浆果发育过程中基因转录差异 有参考序列第40页分析92,051剪切点，大约0.8%剪切点参加385个基因可变剪切与葡萄参考基因组（Pinot Noir 40024）比较，检测到85870个eSNP应用RNA-seq分析葡萄浆果发育转录组分析基因可变剪切第41页判定了浆果发育过程中17324个基因，其中6695基因是以时期特异性方式表示分析浆果发育过程中marker基因，表明RNA-seq分析准确性应用RNA-seq分析葡萄浆果发育转录组第42页中科院上海生命科学院、北京基因组 所和上海交通大学对一个japonica(Nipp)和两个 indica(Gla4 and 93-11)发芽两周样品进行转录组测序每个样本两个生物学重复，每个样本测三次，240碱基测两次和276碱基测一次第一次利用高通量测序分析转录组以判定外显子剪切位点利用RNA-seq对水稻转录组进行功效注释有参考序列第43页与参考序列比较，约38.8%57.3%能够比对到基因组一个位置上共判定了15708个新TARs（transcriptional active regions）利用利用RNA-seq对水稻转录组进行功效注释对水稻转录组进行功效注释测序数据统计新TAR统计第44页约48%水稻基因含有可变剪切，这远远高于以前预测频率检测到参考基因注释中83.1%基因6228个基因5和/或3末端最少比预测延长50bp利用利用RNA-seq对水稻转录组进行功效注释对水稻转录组进行功效注释第45页浙江大学对白粉虱虫卵、幼虫、蛹和成虫进行转录组测序用1个flow cell进行测序，可用数据约43M，读长为75bp无参考序列从头分析白粉虱转录组从头分析白粉虱转录组第46页从头分析白粉虱转录组从头分析白粉虱转录组 拼接完成4,274,766 contigs，170,115 scaffolds利用TGICL软件分析产生168,900个unique序列（平均长度=266bp)因为unique序列较短，83.8%unique序列无法进行基因功效注释与NCBI数据比对成功序列97%序列长度超出bp第47页GO分析能够把7,330 unigene序列归类到52个有功效群中COG分析归类7790 unigene序列到25类中KEGG通路分析能够将11,104个unigene序列归类到214个通路中从头分析白粉虱转录组从头分析白粉虱转录组第48页列入研究白粉虱对杀虫剂含有很高抗性昆虫基因组中约有1011个烟酰胺乙酰胆碱受体亚基基因检测到28个烟酰胺乙酰胆碱受体相关序列，分析共判定9个不一样受体序列从头分析白粉虱转录组从头分析白粉虱转录组第49页转录组测序生物信息学分析内容转录组测序生物信息学分析内容第50页转录组测序应用领域转录组测序应用领域转录本结构研究：UTR判定、Intron边界判定、可变剪切研究、Start codon判定等基因转录水平研究全新转录区域研究Non-coding RNA研究第51页主要汇报内容高通量测序介绍从头测序及其应用重测序及其应用转录组测序及其应用Small RNA测序及其应用第52页miRNA是调控基因表示一个普遍方式第53页俄克拉荷马州立大学，生物化学与分子生物学系对逆境条件干旱、高盐和正常条件下水稻4周幼苗进行miRNA测序三种处理分别得到102,876、54,016 和174,530 测序序列(43003、80990和58781个miRNAs)利用高通量测序判定水稻miRNA第54页当前水稻中公布miRNA家族为53个，判定了23种新miRNA6种新miRNA为单子叶植物特有miRNA预测了40个候选miRNA利用高通量测序技术判定水稻利用高通量测序技术判定水稻miRNA单子叶植物特有miRNA第55页预测了9种新发觉miRNA20个靶点分析miRNA表示模式，发觉特异性表示miRNA，而保守miRNA是最轻易检测到利用高通量测序技术判定水稻利用高通量测序技术判定水稻miRNA第56页山东农科院对正常培养两周花生苗根、茎、叶进行small RNA分析测序共取得6005941条测序序列利用高通量测序技术判定花生利用高通量测序技术判定花生miRNA第57页small RNA长度主要为24bp判定了14个花生特有新miRNA和75个预测miRNA特有miRNA表示量低于保守miRNA，其表示含有组织特异性或者只在特定发育阶段表示。利用高通量测序技术判定花生利用高通量测序技术判定花生miRNASmall RNA长度分布保守miRNA家族第58页Small RNA生物信息学分析和应用领域分类判定：miRNA,siRNA和piRNA和其它Small RNA注释新miRNA预测miRNA表示模式分析共有和特有Small RNA分析miRNA表示模式聚类分析miRNA靶基因预测已知miRNA家族分析Small RNA系统识别和判定Small RNA进化分析Small RNA参加细胞分化和发育功效分析Small RNA药品、biomarker及药品靶点研究Small RNA参加生命调整研究Small RNA与疾病发生关系第59页高通量测序在组学中应用从头测序基因组重测序转录组测序Small RNA测序Lister et al.Current Opinion in Plant Biology()12:107第60页感激您感激您选择与支持与支持第61页