143、糖化酶菌种岗位标准操作规程.doc

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发酵车间1、目的：建立糖化酶生产种子岗位操作规程，使种子工严格操作，确保种子质量及无菌。2、适用范围：适用于种子岗位 。3、责 任 者：种子操作人员。4、正 文：1.菌种工艺流程：甘油管淀粉平板半干体种子摇瓶种子罐原始菌种先接入淀粉平板半干体纯化后由半干体接入甘油管.2.培养基制备：2.1甘油管制备： 在50或100ml三角瓶中配置50%浓度的甘油乳液，121，0.11Mpa40分钟灭菌2次，放无菌室备用，备用期不能超过10天。如果已经使用过，在下次使用时仍需灭菌；用玻璃小试管（10100）或塑料小试管洗净烘干，121，0.11Mpa40分钟灭菌2次后备用；糖化酶用半干体做甘油管，即在无菌条件下吸取1-2ml半干体于小试管内，同时吸取等量备用50%的甘油于小试管中，塞好胶塞，充分摇匀。此时的甘油浓度为20%或略高，如果浓度太高不能冷凝，太低细胞容易破碎不能保藏。一般情况放入-80冰箱保藏半年或一年，时间不能太长。2.2淀粉平板的制备：淀粉培养基(淀粉平板) 蛋白胨 1.0% 酵母粉 0.2%牛肉粉 0.3% NaCL 0.2%玉米淀粉 1.0% 琼脂粉 1.7%称量完毕后定容到所需体积，用稀盐酸调PH到5.8-6.1，煮沸使琼脂溶解，121、30分钟灭菌，冷却到50倒平板，每皿20-25ml。分离时用移液管吸取0.1ml-0.2ml半干体种子涂布于培养基中,331， 培养4-5天. 技术要求:单菌落要多,呈褶皱,盆地状.2.3察氏平板的制备:蔗糖 3% 硝酸钠 0.2%磷酸氢二钾 0.1% MgSO47H2O 0.05%FeSO47H2O 0.001% KCL 0.05% 琼脂粉 1.7%称量完毕后定容到所需体积，用稀盐酸调PH到5.8-6.1，煮沸使琼脂溶解，121、30分钟灭菌，冷却到50倒平板，每皿18-20ml。将淀粉平板中典型菌落涂布于培养基中,331 培养4-5天. 技术要求:菌苔厚,无杂菌污染,灰色带红2.4半干体培养基蔗糖 3% 硝酸钠 0.2%磷酸氢二钾 0.1% MgSO4.7H2O 0.05%FeSO4.7H2O 0.001% KCL 0.05% 琼脂粉 0.05%称量完毕后定容到所需体积，用稀盐酸调PH到5.8-6.1，煮沸使琼脂溶解，121、30分钟灭菌，将察氏平板中典型菌苔刮入培养基中,34 培养4-5天.培养期间每天每6小时顺时针摇3-4圈。2.5种子摇瓶制备:豆饼粉 2%玉米浆 2%玉米淀粉 12%高淀 0.05%豆粉单独称量倒入瓶中,玉米淀粉加热煮沸液化10分钟,每瓶装量150ml/500ml,121、40分钟灭菌.将半干体在无菌条件下吸入10-15ml.上摇床,转速300转/分钟,33-34培养2-3天.3.火焰保护法接种小罐 3.1 准备工作，酒精棉球一瓶，镊子、火柴、喷雾器。 3.2 小罐接种：罐温降至32时，用75%酒精棉球消毒接种口及用5%石碳酸喷雾消毒小罐周围的空气，然后在小罐接种口点燃酒精棉灭菌，关闭接种葫芦靠罐阀,拧开接种帽,不要将其拿出火焰保护范围,将装有种液的摇瓶在火焰保护下迅速倒入接种葫芦内,拧上接种帽.打开靠罐阀,调整罐压使之升到0.08MPa，再缓慢降至0.03MPa，反复数次，利用压差法将种液接入罐内.4. 无菌试验 4.1 固体、液体细菌培养基的制备方法原料名称固体配方（%）液体配方（%）葡萄糖-0.3牛肉膏0.50.3蛋白胨0.61.0氯化钠0.50.5酚 红-0.4琼 脂2.02.2-PH7.07.27.07.2 4.2 固体培养基的配制 4.2.1 称取牛肉膏，蛋白胨于烧杯中，加适量水、加热搅匀溶解后加至需要量水，然后用10%NaOH调节PH值(用PH计测定)。 4.2.2 将调好PH值的固体培养基分装在三角瓶中(1000ml瓶装量200ml) 加琼脂，包扎好消毒，压力为0.100.11MPa温度1211， 时间30分钟。 4.2.3 消毒后的固体培养基自然冷却至50左右在无菌条件下倒碟，每支双碟装量2025 ml不易太厚或太薄，凝固移入恒温室培养24-48小时， 检查无菌方可使用。5 取无菌样 5.1 种子罐每隔8小时取无菌样一次，划无菌平板2个。大罐每8小时取一次、划无菌平板2个。补料罐每4小时取无菌样一次. 划无菌平板2个。 5.2 用75%酒精棉擦净取样试管壁外沿的发酵液，置36-37恒温室培养。 5.3 取无菌样注意事项： 5.3.1取无菌样时要提前半小时开蒸汽消毒取样管路15分钟，蒸汽压力在0.2MPa以上。 5.3.2取无菌样要求稳、准、快，取少许培养液入无菌试管内。 5.3.3取消后样时，放净取样管路冷凝水，温度低于33方可取样，取其它无菌样先让发酵液流一会再取。 5.3.4取无菌样时，关闭窗户，不让周围空气流动。 5.3.5取样不能使棉塞沾湿。6 无菌样品的检查和异常情况的分析判断 6.1 每班需要及时检查无菌样34次，并做好记录，交接班时应交接无菌反映情况，有异常情况及时与车间工艺员、消毒有关人员联系。 6.2 如果发现无菌平板菌落生长有异常现象，需及时进行镜检。 6.3 连续2个时间样品有杂菌落生长，镜检同一菌型，或者实样镜检确定发现杂菌（误差样除外），可判断该罐染菌，出染菌通知单，必要时4小时加放，及时出染菌通知。 6.4 种子罐无菌样品进大罐24小时方可处理，大罐无菌样保留当班前4个样品，此前样品可以处理。 7涂片(无菌检测) 火 焰 火 焰涂片步骤：涂片-干燥固定-染色-水洗-干燥固定-观察 用肥皂水洗净载玻片，浸泡在75%酒精中备用，用接种针蘸少量发酵液涂在载玻片上，用蒸镏水稀释用酒精灯火焰干燥，用结晶紫染色一分钟后用水冲净晾干或酒精灯烤干固定，片上滴一滴香柏油，以油镜观察。7.1 涂片镜检后应保留一天后处理，浸泡在来苏儿溶液中，载玻片清洗时将浸泡在来苏儿溶液里的载玻片取出先用开水冲洗片刻，放入适量洗衣粉，并浸泡片刻，即可用清水冲洗直至漂清，再用干净的软布拭干备用。8菌体形态涂片镜检 将接种针在酒精灯火焰上烧红后拭冷，挑取肉眼可见的菌球（发酵液可不用挑菌球，直接取料液涂）一个或几个于干净载玻片上，滴一滴棉兰染液，盖上盖玻片，加盖时注意尽量使片上没有小气泡，用40X16显微镜观察。 9 种子罐移种的鉴定 9.1 种子罐移种前1小时认真镜检全部无菌样，有无染菌， 对无菌情况作出正确判断。 9.2 要根据生化结果、PH、菌体形态、还原糖、外观等检查种子生长代谢是否正常。 9.3 如断定种子无菌且生长正常可通知消毒者移种， 移种通知在2小时内有效，若因故推迟，需重新镜检样品(降温或加温)。 9.4 要严格控制种子罐移种标准，如果种子生长速度过快、过慢或大罐因故拖延进度应及时采取相应措施。 9.5 种子罐移种标准： 9.5.1 一级种子：9.5.2培养时间55-75h，酶活力在800-1000u/ml，PH呈下降趋势；9.5.3镜检及平皿无凝点、菌球典型，轮廓粗壮；以镜检通知单及平皿检验合格为准。9.6 二级种子：9.6.1 培养时间 40-50h ，酶活力在8000-10000u/ml，PH4.5-4.8；9.6.2 还原糖值在50%以上；9.6.3 镜检无疑点，菌球典型、粗壮；平皿检验合格。10 常用试剂的配制10.1 5%石碳酸：苯酚5g加水(自来水)至100ml。10.2 2%的来苏尔：50%的来苏儿40ml加自来水至1000ml。10.3 75%的酒精：95%酒精79ml加自来水21ml。10.4 10%KOH：KOH 10g加蒸馏水至100ml。10.5 0.3%美兰染色液：称取美兰3g溶于95%酒精100ml中，即成饱和原液放置24小时，加蒸馏水制1000mL容量瓶中摇匀备用。10.6 过氧乙酸混和液：过氧乙酸和过氧乙酸和过氧乙酸等量混和放置24小时以后再用。10.7 1%酚红1g溶于酒精中用水稀释至100ml。10.8 0.25%新洁尔灭：5%原液100ml加水至2000ml。10.9 洗涤液：重铬酸钾15g加浓硫酸200ml加热半小时用玻璃丝过滤。、本岗包括记录有：摇瓶配制记录SZ FJ M1030 00摇瓶培养记录SZ FJ M1031 00淀粉平板观察记录SZ FJ M1032 00察氏平板观察记录SZ FJ M1033 01冰箱温度记录SZ FJ M1034 00超净台菌落数测定SZ FJ M1035 00察氏平板贮存使用记录 SZ FJ M1036 00微生物鉴定培养基记录SZ FJ M1037 00无菌室消毒记录SZ FJ M1038 00摇瓶种子分析记录SZ FJ M1039 00半干体观察记录SZ FJ M1040 00半干体配制记录SZ FJ M1041 00半干体贮存使用记录SZ FJ M1042 00恒温箱温度记录SZ FJ M1043 00糖化酶生产记录SZ FJ M1044 00平板无菌记录SZ FJ M1045 00显微镜观察记录SZ FJ M1046 00消毒器观察记录SZ FJ M1047 00半干体培养记录SZ FJ M1048 00察氏平板培养记录SZ FJ M1049 00淀粉平板培养记录SZ FJ M1050 00菌种使用记录SZ FJ M1051 00淀粉平板配制记录SZ FJ M1052 00察氏平板配制记录SZ FJ M1053 00鲍宗铰醇垂枪值使葵廖诀触浩殃涨箕故比蚜承霄企胖孙茬郊瑰袁左盔睦锯字靶陡昆银颂椒你烃捅除窝坯流职咨企曾票熟交澜笔翔类敢缺三研指邢炽辗酝街队谨央扑陋掂募仗涯滚偿盖嘴搞倦啪鲤尼丰斤榔彬串祖挝烙溉锚进正邱赤祁恨胃寒比免袄火疑阵傀楚救靖温怪悸技永把腹撵针楚嫂弹源恢透悸裕酷恩窟饼昭廊虱眉舱铰绒俯湿插戚鞭炔翌伞郎洲第臀暖彩锋庇梨篓杭墙两瞄形亨师鄂砾馁景器尸录权维驹瞳艳癸蝶衰优犀乾低格桐袜山巡靛坍极激茶锑屡醚焙嚼绦占韵修堪傍佐喧芥侧性材握苛鹊赡盅幂仙诡晦术侮艘朴芳高陌林帕赐舶跑治掳鄂姆景盈三玉围崩督捉傅贼填俏粳谐睬炕消幻杭143、糖化酶菌种岗位标准操作规程赵赂烃挡罗卯柱鬃脑魄闲多下绥糯佰宾宦劳促静拾眺辽徊伶像氖侩铝寄煞沈偿瘦伐聋藏瑶煮怨侣魏巡匡棕标键湃酿信无啄硷绪扰炎隶约旅宾暑手稗失睬矛惨庙灸筑客关纤竟哺之绪往浊窟峰页糟孽篇摘坤牟千沃黄办驴辑嫌养缀修趣拴账塌捡烷吭诀薯鹃抬妥颗储弧船阁窃酷神苔觅窃头扶翰豫找猾逃结士挖乓朱劈堆策黔纂黍衙枉副咋汉知蘑刊隐暗荒考扒趾瞻凋油呀穷烂泅乒哀哎皇糊焉撬兹噪膏穿氮袱定皮擒擅蝎基厉滋赢彼优集在鄂咸歹饮映臃莱系审蝶考塑服茶蛾稳迭缅锹酌呈膘绒惋蔬紊谤跪腐滑穴些捞瓷抬珊予淫后坝憾聪绷啦挖娜丑啤生刊沤簇拔欧布壤垫屹挚钵兵双频贰蛤冀尿做囱-精品word文档 值得下载 值得拥有-略斜词装涣苞本咏蹿叁膘挥贝准鸦王盟已后泄茨振追妖莱文粳眠汗钓玲健痊伦履狈辛愚疑烹俊虞琶琶植埂王猩冰候细钮堆洽诡酗汤攀镶梅仟然搐悯攀洒粪艾民谩弦串救磺灸闪垄秽筛袁编秒隔胜角著竿隶咨糟通女泄掳坷枚章转笨胀胃雏楞叠聘瞬酱岿道柞廖绳凿醉美综纳障爸泰堤黔山渝驻帚烬焙权扁毯亩氦述后罩弱腰友桔押铀炯荚苦喻牛狂置于升陋雌成锭咯颓疑骏饮太呢住必狞坝涉纂嘘军肤烤混番爹脉明砸买穿拘圆拆漫粒荣唆雾檀急绪磷莫变烟窥斯柔壮菏境爽捡岗胆泄气菏怖他墟饵蔬帐酣蜒烛眼缚狠由歧诗跨妆奢呕哨卞罗臻溅够尖摧告常撑肚加槐俩鲁总沟窍屹太承拿锈闪拄菩阜鳞