基于16S rRNA研究铜污染对土壤细菌群落、抗生素抗性基因及基因转移的影响.pdf

J：扬州大2024.，45(1)：59-6 6.引文格式：杨娅，王宏归.基于16 SrRNA研究铜污染对土壤细菌群落、抗生素抗性基因及基因转移的影响潇，张Jan.22024Journal of Yangzhou University(Agricultural and Life Science Edition)2024年1月Vol.45 No.1扬州大学学报（农业生命科学版）第45卷第1期DOI:10.16872/ki.1671-4652.2024.01.008基于16 SrRNA研究铜污染对土壤细菌群落、抗生素抗性基因及基因转移的影响杨潇，张娅，王宏归（扬州大学环境科学与工程学院，江苏扬州2 2 512 7）摘要：对经0、2 0 0、40 0 mgkg-1Cu2+处理的3个种植池土壤分别采样，并对所有样品进行16 SrRNA高通量测序。结果表明：铜污染改变了土壤中的细菌群落结构，抗生素抗性基因（antibiotic resistancegenes，A R G s）与基因水平转移(horizontalgene transfer，H G T)相关基因的丰度随Cu2+浓度的升高而增加。富集的抗性基因大多为多药耐药基因。这表明铜胁迫会改变土壤中细菌群落结构，促进HGT，同时使ARGs富集。关键词：铜污染；细菌群落结构；抗生素抗性基因；基因水平转移中图分类号：S182；S154.3文献标志码：A文章编号：16 7 1-46 52(2 0 2 4)0 1-0 0 59-0 8A 16S rRNA-based study of the effect of copper contamination on antibioticresistance genes and horizontal gene transfer in soil bacterial communitiesYANG Xiao,ZHANG Ya,WANG Honggui(College of Environmental Science and Engineering,Yangzhou University,Yangzhou 225127,China)ABSTRACT:In this study,soil samples were collected from three planting ponds treated with O,200 and 400 mg Cu2+,respectively,and all samples were sequenced by 16S rRNA high-throughput sequencing.Sequencing results showed thatCu contamination changed the bacterial community structure in soil,and the abundance of antibiotic resistance genes(ARGs)and horizontal gene transfer(HGT)related genes increased with the increase of Cu2+concentration.The resul-ting antibiotic resistance genes were mostly multidrug resistance genes.This study showed that under the stress of Cucontamination,the bacterial community structure in soil was changed,and the HGT between bacteria was promoted,while the ARGs.were enriched.KEY WORDS:copper contamination;bacterial community structure;antibiotic resistance genes;horizontal gene transfer土壤资源是粮食生产的基础，是人类生存的根本-2 。近年来随着我国城市化和工业化进程的加快，土壤污染问题越发严重。这不仅严重危害污染源周边的生物种群，还有可能通过食物链危害人体健康3。一些金属如锌(Zn)、铁(Fe)、铜(Cu)等是生物生长所需要的元素，其在生物体的含量非常低，通常会参与一些生物体的生命活动，例如渗透压调节。部分微生物还会将金属用于催化功能，因此低浓度的金属可促进微生物生长4。但是，当重金属污染超过一定阈值时会对生物体造成毒害5。由于重金属较长的生物半衰期和不可生物降解的特性，使得重金属污染较难处理5。土壤中微生物在物质循环中起着重大作用，是生态系统中的重要组成部分6 。土壤中各微生物间存在着复杂的相互作用，在过量重金属的影响下，土壤微生物的物种组成及生理活动不可避免地受到影响7 收稿日期：2 0 2 2-11-2 6基金项目：国家自然科学基金资助项目（2 2 17 2 140）；江苏省自然科学基金资助项目（BK20211328）作者简介：杨潇（1997 一），男，江苏准安人，扬州大学硕士研究生，主要从事环境微生物与环境化学研究。*通信作者，王宏归，扬州大学教授、硕导，主要从事环境微生物与环境化学研究；E-mail：w a n g h g y z u.e d u.c n。提60第45卷扬州大学学报（农）生命科学版）近年来，由于抗生素的滥用，抗生素污染问题不断加剧，环境中抗生素抗性基因（antibiotic resist-ance genes，A R G s）越来越受到人们的广泛关注8)。ARGs可通过基因水平转移（horizontal genetransfer，H G T)的方式被转移到人类共生的细菌和临床病原菌中9。环境中ARGs丰度增加，也会增加致病菌通过HGT获取ARGs的机会，从而获得耐药甚至多重耐药性。有研究10-111表明，在环境选择压力下，会加剧微生物之间的HGT。目前大部分研究基于实验室环境下重金属对单一细菌耐药性的促进或抑制作用12 ，或者研究受重金属污染地区抗生素抗性基因的变化情况13-14，本研究在现有的基础上进一步研究耕地环境下不同浓度Cu2+污染对土壤中耐药基因水平转移的影响；通过对土壤样品进行高通量测序，研究不同浓度Cu2+胁迫对土壤中细菌群落结构及其所携带的ARGs以及与接合、转化相关基因影响，并解析这些基因与细菌物种之间的关系。1材料与方法1.1土壤样品采集土壤样品于2 0 14年6 月3日一10 月2 3日采集于扬州大学文汇路校区实验农场的水稻种植池（池由水泥浇铸而成）。试验地年平均气温14.8 15.3，年降水量96 110 48 mm。试验分3组，第1组不添加硫酸铜（CK)；第2 组每千克土壤中添加2 0 0 mg硫酸铜（Cu-200)；第3组每千克土壤中添加40 0 mg硫酸铜（Cu-400）。每组3个种植池，种植池规格为3.8 m（长）X1.3m（宽）X0.45m（深），每个种植池含2.4t土壤。表层土壤（2 0 cm深）为黏土质地，pH值7.1。水稻每年种植1季（6 一10 月），其他时间不种植。肥料成分及用量为：氮肥（2 50 kghm，纯N）、磷肥（7 5kghm，P,O）、钾肥（7 5kghm，K,O)。种植水稻季节一般保持浸水，所有农业生产实践均手工完成，并采取统一标准和管理措施。在水稻种植开始至结束（6 一10 月），每个星期取样1次，每个种植池取3个土壤样品（0 15cm）并混匀，共取17 次。对17 次取得土壤样品提取DNA，并进行16 SrRNA测序，本实验测序以时间序列作为重复，同一时间点样品不做重复测序。1.2土壤样品总DNA提取使用PowerSoilRDNAIsolationKit（M o b io La b o r a t o r ie s，C a r ls b a d，C A，U SA）按照使用说明取十壤总DNA1.3数据分析对所提取的土壤DNA数据进行16 SrRNA测序，测序由北京博云华康基因科技公司完成。使用引物56 3F（5-A YT G G G YD T A A A G VG-3）和8 0 2 R（5-T A CNVG G G T A T CT A A T CC-3）扩增16 SrRNA基因的V4高变区15。以基因组DNA为模板，进行PCR扩增，筛选目的扩增片段，最后进行cluster制备并使用Novaseq6000进行上机测序（美国Illumina公司）。将测序结果经过滤、拼接，再利用USEARCH（v 7.0.10 90）16 聚类为OTU，并利用UPARSE在97%的相似度下进行聚类，得到OTU代表序列，而后利用UCHIME（v 4.2.40)17 将PCR扩增产生的嵌合体从OTU代表序列中去除，再通过OTU与数据库比对，得到每个样品的OTU丰度统计表18 。得到OTU代表序列后，通过RDPclassifer（v 2.2)软件将OTU代表序列与数据库比对进行物种注释，置信度阈值设置为0.8。接着对注释结果进行过滤，去除没有注释结果的OTU数据及注释结果不属于细菌界的物种。2结果与分析2.1细菌多样性及群落结构样品数据经过筛选后，每个样品平均得到3147 9个序列，以97%相似度划分，得到2 193个OTUs，共54个门、17 3个纲、332 个目、496 个科、7 18 个属和7 51个种。由图1可知，随着序列数目增加，不同浓度Cu2+处理后的稀疏曲线逐渐趋于平缓，这说明测序深度能真实反映各种土壤样品的细菌群落结构。为研究铜污染对细菌群落的影响，对（TUs序列数据进行Alpha多样性指数19)分析。分析结果显61杨潇等：基于16 SrRNA研究铜污染对土壤细菌群落、抗生素抗性基因及基因转移的影响第1期示，反映物种丰富度的各指数（Observed species、Ch a o、Shannons diversity、A c e）均随着Cu2+浓度的增加而减少（图2.A），可见铜污染可减少土壤细菌群落的生物多样性。为分析铜污染对土壤群落组成的影响，对16SrRNA测序结果进行主成分分析，结果显示，根据加权Unifrac距离上的PCoA可将3组分开并聚集成组（图2.B)。CK、Cu-_ 2 0 0 组和Cu-400组样点离散程度均比较大，表明不同浓度铜污染会显著影响土壤细菌物种的组成。细菌群落优势细菌在门水平上共有13个，大约占4000730002000CKCu.200Cu_400100000500010000150002000025 000样品数numberof sample图1高通量测序的稀缺性曲线Fig.1Scarcity curves for high-throughput sequencing细菌群落丰度的95%，优势细菌门分别为变形菌门（Proteobacteria）、酸杆菌门（Acidobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、绿弯菌门（Chloroflexi）、疣微菌门（Verrucomicrobia）、芽单胞菌门（Gemmatimona-detes）、浮霉菌门（Planctomycetes）、硝化螺旋菌门（Nitrospirae）、厚壁菌门（Firmicutes）、绿菌门（Chlo-robi）、放线菌门（Actinobacteria）和WS3（图3.A）。随Cu+浓度的增加，变形菌门、酸杆菌门、拟杆菌门、芽单胞菌门、厚壁菌门的相对丰度也升高，而绿弯菌门、疣微菌门、硝化螺旋菌门、绿菌门、放线菌门、WS3等随着浓度的增加而降低，而浮霉菌门丰度则不受Cu2+浓度的影响。A4.5003500B40000.0830000.062.5000.043.0000.022.000(%S801)Od CKCu.200 Cu.400CKCu.200 Cu.4000处理treatment处理treatment0.024500F7.2-0.04CK7.0Cu.2004000-0.06ACu.4006.8s,uouueus-0.086.63.500-0.106.40.15-0.10-0.05 0.000.050.100.153000PC1(41.37%)6.2CKCu.200Cu.400CKCu 200 Cu 400处理 treatment处理treatment图2不同浓度Cu2+处理相关细菌多样性的变化Fig.2Changes in the diversity of associated bacteria under different copper concentration treatmentsA.Alpha多样性指数；B.PCoA图通过R4.1.2版本和QIIME（v 1.8 0)计算出Beta多样性。A.Alphadiver-sity index;B.PCoA plot Beta diversity was calculated by R version 4.1.2 and QIIME(vl.80).细菌群落优势细菌属共有2 0 个，大约占细菌群落丰度的6 5%，优势细菌属分别为硫杆菌属（Thiobacillus）、假单胞菌属（Pseudomonas）、厌氧绳菌属（Anaerolinea）、地杆菌（Geobacter）、G O U T A 19、溶杆菌属（Lysobacter）、凯氏杆菌属（Kaistobacter）、LCP-6 等（图3.B）。随Cu2+浓度的增加，Anaeromyrobacter、厌氧绳菌属（Anaerolinea）、So l i b a c t e r、K o r i b a c t e r 和溶杆菌属（Lysobacter）的相对丰度呈上升趋势，而GOUTA19和Syntrophobacter属细菌相对丰度逐渐降低。其余几种细菌属的相对丰度在3种样本中统计学数据几乎相同，不受Cu2+浓度的影响。2耐药基因及基因水平转移相关基因的丰度特征基于16 SrRNA测序的OTU数据进行基因功能丰度预测，形成KEGG同源基因（KO)表格，根据数据62第45卷扬州大学学报生命科学版）A1.00B1.00AcinetobacterAnaerolineaAnaeromyxobacteraouepunqeKoribacter0.75Solibacter0.75AcidobacteriaFlayisolibacterActinobacteriaGallonellaBacteroidetesGeobacterChlorobiGOUTA19Chlorofiexi0.50Kaistobacter0.50FirmicutesLactococcusGemmatimonadetesLCP6NitrospiraeLysobacterotherNitrospiraPlanctomycetes0.250.25OpitutusProteobacteriaPseudomonasVerrucomicrobiaRhodoplanesWS3SyntrophobacterThiobacillus00VariovoraxCKCu 200Cu 400CKCu 200Cu 400处理treatment处理treatment图3不同浓度Cu+处理样品细菌在门(A)和属(B)上的相对丰度Fig.3Relative abundance of bacteria in phylum(A)and genus(B)of samples underdifferent copper concentration treatments库中的功能预测筛选出本研究需要分析的基因，本研究着重研究铜污染对土壤细菌HGT及ARGs的影响。由图4.A可知，土壤中ARGs丰度随Cu2+浓度的增加而增加，且在Cu-400组ARGs丰度明显高于对照组。其中93.8 6%的ARGs为多重耐药基因（多重耐药基因编码转运蛋白能主动将多种药物从细菌体内排出15，如tcaB、l mr P、e mr E等），剩余的6.14%为单一耐药基因，如与四环素（tetA、t e t 35、t e t X等）、万古霉素（anW、u a n J、a n K 等）、氯霉素（cmlR)等有关。以上数据显示铜污染促进了耐药基因在土壤细菌中富集。细菌获得耐药基因的途径主要有2 种：一是通过基因突变产生耐药基因，二是耐药基因水平转移16 。基因水平转移是细菌获得耐药基因的主要方式。基因水平转移主要有接合、自然转化和转导3种方式17 。接合与转化是细菌获得耐药基因、产生耐药性的主要方式，其中接合是最容易发生的转移方式18 ACKCu200Cu.400B口CKCu200Cu40044emEtraFmkttKemrB2ttc2marRtrallmartrawtcaB0trav0emrytraBemrkImrP-2traktraE-2blttralmdtG4traA-4mltHmxltLtralSHINAtraD.yebotraGtravyitGTCSMR3trblebrdtracebrBtraRbhsABCOmEBmarBcomCmdtoCOmEAmexRcomECnalDCOmERCrRTamAComF转目mItDcomFBykkccomFCvkkDCOnGAvanwCOmGBvanlconGCvankCOuGDVTaRCOMGEtet35COnGFtetMcOmGGtetxConiktet40tetyComQfexA.BcomYImrBcomzcmlAmedcmlRCOmBmcbG(omX12图4不同浓度Cu2+处理基因丰度差异的热图Fig.4 Heat map of the differences in gene abundance under different copper concentration treatmentsA.ARGs相关基因；B.HGT相关基因；图中显示的是具有显著差异的前2 0 个基因热图。ARGs（A）a n d H G T-r e l a t e dgenes(B);The heat map of the top 20 genes with significant differences were shown in the figure.由图4.B可知：与接合转移（traF、t r b C、t n p A 等）以及自然转化（comC、c o mQ、c o mX等）有关的基因丰度随着Cu2+浓度的升高而增加，且在Cu-400组中丰度最大。细菌从体外摄取DNA是一个相对复杂的过程，需要分泌系统相关蛋白的参与。研究认为II、I V型分泌系统参与接合转移和自然转63杨潇等：基于16 SrRNA研究铜污染对土壤细菌群落、抗生素抗性基因及基因转移的影响第1期化19，而一般分泌系统(Sec)和双精氨酸易位系统（Tat)可促进II型和IV型分泌系统的形成2 0。本研究结果显示在不同浓度Cu2+污染下，II/IV型菌毛相关的基因hofB基因分别增加1.0 6 和2.16 倍，其他相关基因的丰度相对于对照也有明显提高（图5）。相对于对照，在Cu-400组中一般分泌系统和精氨酸转运系统相关基因的丰度均增加约1.3倍（图5）。因此，土壤铜污染导致ARGs富集是因为铜污染促进了耐药基因接合转移与自然转化。type II secretion(II)type IV secretion(IV)general secretion system(Sec)the arginine translocation system(Tat)1CK0.50Cu,200-0.5Cu_400-1图5不同浓度Cu2+处理土壤细菌群落的细胞分泌系统的基因丰度变化Fig.5Changes in gene abundance in the cellular secretion system of the soil bacterialcommunity under different concentrations of copper treatment有研究2 1-2 2 表明，细菌在胁迫条件下会产生活性氧自由基(ROS)并引发SOS响应（SOS response)和DNA修复重组，从而促进耐药基因水平转移。由图6.A可知，相对于对照组，ROS相关基因的表达丰度在Cu-200、Cu-40 0 组中分别提高约1.2 和2 倍，说明在铜污染胁迫下土壤细菌会产生更多的ROS。此外，随着Cu2+浓度的增加，土壤细菌群落的超氧化歧化物（SOD)相关基因的丰度相对于对照，分别增加1.4和1.9倍。这表明铜污染胁迫细菌产生ROS的同时，也激活细菌的抗氧化系统。与SOS反应和DNA修复重组相关的基因丰度，随着Cu2+污染浓度的升高而显著增加，其中参与胁迫响应的lerA和umuD基因丰度相对于对照有所增加，在Cu-200、Cu-40 0 组中分别增加约1.2 和1.4倍，与DNA修复相关的uur基因则分别提高1.1和1.3倍（图6.B）。细菌体内的ROS会增加细胞膜的通透性，促进耐药基因水平转移2 1。相对于对照，在Cu-200、Cu-40 0组中相关膜蛋白的基因丰度，随Cu+浓度的提高而增加（图6.C）。如bamD是编码外膜蛋白组装因子，在Cu-400组相对于对照丰度增加1.4倍；tolQ负责外细胞膜的通透性，在Cu-400组相对于对照丰度增加1.5倍。AtrxB1BropE1CbamD1trxAropDtrxcuVrAbamESOD2uvrDSODI0.5acrA0.5bamc0.5osmcOSmBrecGropAbamBOSmY0uvrc0mdtA0GSRrec.l.SOxBropvmdtNSOxR-0.5ropc-0.50.5SOXAropBrcsDSoxXuvrBSoxC-1recR-1rScA-1SoxYdinBtolRSoXZSOSrecNyaaurecotolQygiMlexAYgiFrecQtolBbtuF7?胖SOSacrBbtuBdinGtolAgrxAgrxBrpozmaryejAgrxcrecFyejBgrxDrpolmsrprecDyejEmsrArecBmsrBreccyejFmsrABmsrQrposumucyfaEychFumuD.yiachyclgapvCKCu 200 Cu 400CKCu 200Cu.400CKCu.200 Cu.400图6不同浓度Cu2+处理ROS、SO S及外膜蛋白相关基因的表达情况Fig.6Expression of ROS,SOS and outer membrane protein-related genes underdifferent copper concentration treatmentsA.ROS相关基因；B.SOS相关基因；C.外膜蛋自相关基因。A.ROS-relatedgenes；B.SO S-r e l a t e d g e n e s；C.genes related to outer membrane proteins.64第45卷扬州大学学报（农业与生命科学版）2.3抗性基因与细菌群落的共现性分析为进一步研究铜污染与细菌群落、ARGs和HGT的关系，利用相关基因的丰度及其潜在宿主细菌（优势种群）构建网络分析。由图7.A可知，脱硫弧菌属（Desulfovibrio）、披毛菌属（Gallionella）、Lc p-6、脱氯菌属（Dechloromonas）、乳球菌属（Lactococcus）、厌氧绳菌属（Anaerolinea）、不动杆菌属（Acinetobacter）、假单胞菌属（Pseudomonas）、溶杆菌属（Lysobacter）、芽孢杆菌属（Bacillus）、堆囊菌属（Opitutus）等2 4个细菌属与多数的ARGs成正相关，硝化螺旋菌属（nitrospira）、苯基杆菌属（Enylobacterium）、霉状菌属（Pl a n c t o my c e s）、G O U T A 19等属与多数的ARGs成负相关。结合图3.B，推测Anaeromyrobacter、厌氧绳菌属、Candidatus_Solibacter、Ca n d i d a t u s-K o r i b a c t e r 和溶杆菌属的丰度增加且与ARGs呈正相关的属可能是ARGs的潜在宿主。图7.B情况与此类似，随着Cu2+浓度的增加，细菌之间HGT发生得更加频繁。这表明Cu2+可能参与ARGs的富集，且ARGs丰度的增加可能是通过HGT实现的。ANitrospiraOpitutus,BLCP-6KoribacterAcinetobacterThiobacilusSolibacterXiphinematobacterLysobacterLactococcusNitrospiraLysobacterPherylobacteriumSyntrophobacrerSolibacterLactococcusAnacromyxobacterVariovorarPsychrobacterChondromycesLCP-6SulfiricurvumPlanctomycesXiphinematobacterVariovoraxcomxLraCtraltraBCOmEAmepAacrBmexRKaistobacterPhenylobacteriumnalDacrEvankVanwefi-Awan/AdeAopmDoprcDA101raBCmFCtaGCoFAtraKcomGAKaistobacierefBbmrebracrFadeBAdecsmeAsmeBsmecRhodoplanestacomGCcomECcomcomFBChondromycesKoribacteracrDmdiDmdlAmdIBSaLASaLBmdiEmdiFbpeEPontibactercomGiFCOIMEBCOmERaNComGDcomzbpeFJkkcykkDsdMcmlAcmlRImcBoprMmexcFlavisolibacterPlanctomycesfiobacillusmexDmexE_mexFmex/mexKmexhmerlramADechloromonasCOunGBcomGGaUcomX2medcmrveaMameclmrsmdeAvexFiverE-ogxBOQXABaciltustbetraCOmGEraRcomBDA101GcobacterPseudomonasfeA.BRhodobactercomQtratraDPontibacterSyntrophobacterDesulfovibrioGallioncllaDechloromonasGallionellaPsychrobacterAnaeromyxobacterPscudomonasAnaerolineaBacillusGOUTA19AnaerolineaSulfuricurvumFlavihumibacterGOUTA19RrhodoplaptiviAcinetobaclerFlavihumibacterRhodobacterapfaivisolibacterGeobactePpitutus图7ARGs（A)和HGT基因(B)与其潜在宿主细菌或致病菌之间的共同发生模式Fig.7Co-occurrence patterns between ARGs(A)and HGT genes(B)andtheir potential host bacteria or pathogenic bacteria使用Pearson相关系数进行相关分析，筛选出P0.05的关系对；图中节点的大小表示细菌及基因丰度，圆代表属水平的细菌，菱形表示相关的基因名称，红线和蓝线分别代表正相关和负相关。Correlation analysiswasperformedusingthePearson correlation coefficient to screen for pairs of relationships with PO.05:The size of the nodes in the figure indicatesbacterial and gene abundance,the circle represents bacteria at the genus level,and the diamond indicates the associated genename.The red and blue lines represent positive and negative correlations,respectively.3讨论细菌的耐药性对人体健康构成严重威胁，滥用抗生素是耐药基因在细菌之间传播的主要原因2 3此外，由于快速的城市化和工业化，目前部分土壤中能检测到相对较高浓度的重金属污染。研究2 汀表明重金属成分相对于抗生素污染更能影响ARGs的富集。部分农业土壤中受重金属污染越来越严重2 5，本研究结果表明，重金属铜污染会显著改变土壤中细菌的群落结构，且促进耐药基因水平转移，从而导致ARGs富集。希望人类能重视这些问题，并采取有效的措施来防止ARGs在环境中的传播，从而保护人们的身体健康。在Cu-200、Cu-40 0 组中物种丰度均明显少于对照，这与相关研究2 5 中Cu+浓度大于10 0 mgkg-时，随着Cu2+浓度的增加，细菌的种类及丰度会不断减少的结果是一致的。为进一步分析铜污染对土壤中细菌群落的影响，本研究分析了土壤细菌群落结构的变化。在门水平上，随着Cu+浓度的升高变形菌门（Proteobacteria）、酸杆菌门（Acidobacteria）、拟杆菌门（Bacte-roidetes）和芽单胞菌门（Gemmatimonadetes）的相对浓度随之上升，这与相关文献2 6 描述一致，这些门在重金属污染的土壤中广泛分布。在属水平上，Anaeromy.robucter、厌氧绳菌属（Anaerolinea）、So l i-bacter、K o r i b a c t e r 和溶杆菌属（Lysobacter)的丰度呈上升趋势，表明这些属对Cu+有较好的耐受性，而65杨潇等：基于16 SrRNA研究铜污染对土壤细菌群落、抗生素抗性基因及基因转移的影响第1期GOUTA19和Syntrophobacter属细菌在Cu+浓度增加的情况下相对丰度逐渐降低。3组中细菌的物种组成有很大不同，表明铜污染改变了土壤细菌群落结构。随着Cu2+污染浓度的升高，ARGs的丰度显著提升，且土壤中细菌获得的耐药基因大多为多重耐药基因（93.8 6%）。这表明重金属污染不仅会增加环境中耐重金属细菌的形成，还会导致抗生素抗性基因的增加，进而导致更多的耐药细菌的产生。为探究ARGs富集的原因,本研究分析了与接合转移和自然转化等相关基因，这些基因的丰度随着Cu2+浓度的升高而增加，其中InsF、t n p A、c o m EC这3种基因的丰度最高，InsF、t n p A 这2 个基因为转座酶基因，comEC是DNA自然转化转运体(DNA-T)的核心部分，这些基因均与细菌间耐药基因水平转移密切相关，其丰度的上升表明铜污染促进了耐药基因水平转移。II 型分泌系和IV型分泌系统一般认为与细菌的接合转移与转化密切相关，而一般分泌系统（Sec)和双精氨酸易位系统（Tat)可促进I型和IV型分泌系统的形成2 7 。本研究结果表明，随着Cu2+浓度的上升4种分泌系统相关基因的丰度也随之上升。这表明铜污染会影响细菌分泌系统相关基因来促进环境中基因水平转移。本研究中铜污染显著提高土壤细菌中ROS、SO S相关基因的丰度,与细胞膜修复相关的基因丰度随Cu2+浓度上升而上升。这表明铜污染胁迫下细菌产生ROS，引发SOS反应，同时增加细胞膜的通透性，从而促进耐药基因水平转移，导致耐药基因的富集。基因潜在宿主分析发现，ARGs的潜在宿主细菌主要是变形菌门，其中变形菌门中丰度最高的几个属，如假单胞菌属、溶杆菌属等，均与多个ARGs具有显著的正相关，这表明多个ARGs具有相同的宿主细菌。细菌群落丰度不受Cu2+浓度影响的细菌与ARGs与HGT相关基因呈正相关；细菌群落丰度随Cu2+浓度而减少的细菌与ARGs与HGT相关基因呈负相关。由此可见，细菌丰度增加的菌是ARGs的主要宿主菌。4结论1）细菌的丰度和群落的多样性随着Cu+浓度增加而显著降低。2）Cu+浓度的增加使变形菌门、酸杆菌门、拟杆菌门和芽单胞菌门的相对丰度升高，疣微菌门、放线菌门、硝化螺旋菌门、绿菌门等的相对丰度降低；在属水平上Anaeromyrobacter、厌氧绳菌属、和溶杆菌属等的相对丰度升高，GOUTA19和Syntrophobacter属的相对丰度降低。3）Cu 2+污染浓度促进HGT，并使ARGs在土壤细菌中富集。4）变形菌门、拟杆菌门、厚壁菌门、绿弯菌门和疣微菌门菌与大多数的ARGs和HGT相关基因成正相关，而硝化螺旋菌门、浮霉菌门等细菌与大多数的ARGs和HGT相关基因呈负相关。本研究结果证实，铜污染改变了土壤中细菌的群落结构，且促进HGT并使ARGs在土壤细菌中富集。参考文献：1LAL R,MONGER C,NAVE L,et al.The role of soil in regulation of climate JJ.Philosophical Transactions ofthe Royal Society B:Biological Sciences,2021,376(1834):20210084.2SILVER W L,PEREZ T,MAYER A,et al.The role of soil in the contribution of food and feed JI.Philosophi-cal Transactions of the Royal Society B:Biological Sciences,2021,376(1834):20200181.3XIANG M T,LI 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