RIPK3在LPS_D-GalN诱导急性肝衰竭中的作用研究.pdf

医学分子生物学杂志,2024,21(3):196-202 J Med Mol Biol,2024,21(3):196-202DOI:10.3870/j.issn.1672-8009.2024.03.002资助项目:国家自然科学基金(No.81770612)通讯作者:刘亮明(电话:[phone],E-mail:liuliangming )This work was supported by a grant from the National Natural Science Foundation of China(No.81770612)Corresponding author:LIU Liangming(Tel:[phone],E-mail:liuliangming )RIPK3 在 LPS/D-GalN 诱导急性肝衰竭中的作用研究于倩,边姝,张钰婷,赵赛,刘亮明南京医科大学上海松江临床医学院 上海市,201615【摘要】目的 研究受体相互作用蛋白激酶 3(receptor-interacting protein kinases 3,RIPK3)在脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)/D-氨基半乳糖(D-galactosamine,D-GalN)诱导的急性肝衰竭(acute liver fail-ure,ALF)中的作用。方法 体内实验使用 SPF 级雄性 BALB/c 小鼠 15 只,随机分为对照组(Control),模型组(LPS/D-GalN),抑制剂预处理组(GSK872+LPS/D-GalN),每组 5 只。ALF 动物模型采用 LPS 联合 D-GalN 腹腔注射的方式制备。药物腹腔注射前1 h,分别以0.1%DMSO 和 RIPK3 特异性拮抗剂 GSK872(溶于0.1%DMSO)尾静脉注射进行预处理。肝损伤程度采用血生化检测和肝脏组织学变化来评估;基因mRNA 表达采用 PCR 检测,蛋白表达采用蛋白质印迹和免疫组化分析。结果 动物实验结果显示,与正常对照组(Control)相比,模型组(LPS/D-GalN)小鼠肝组织见显著炎症出血坏死性损伤,肝内 F4/80+细胞浸润增多,血清 ALT 和 AST 水平明显升高(P均 0.01)。同时,肝组织 F4/80、Mcp-1、Tnf-、Il-6、Ripk3 和 Mlkl mRNA,以及 RIPK3 蛋白和 p-MLKL/MLKL 蛋白比值均上调,差异均存在统计学意义(P均0.05)。与模型组相比,预处理组(GSK872+LPS/D-GalN)小鼠肝脏炎症损伤程度明显减轻,肝内 F4/80+细胞浸润明显减少,且血清 ALT 和 AST 水平显著下降(P均 0.01)。肝组织 F4/80、Mcp-1、Tnf-、Il-6、Ripk3 和 Mlkl mRNA,以及 RIPK3 蛋白和 p-MLKL/MLKL 蛋白比值下调,差异均有统计学意义(P均0.05)。结论 在 LPS/D-GalN 联合诱导的小鼠急性肝衰竭模型中,RIPK3 抑制剂的应用可能直接通过靶向肝细胞,减少肝细胞的坏死性凋亡,从而减少巨噬细胞浸润,最终改善肝脏炎症状态。这提示 RIPK3 可能通过对肝细胞坏死性凋亡通路分子的影响促进 ALF 的发生和发展。【关键词】急性肝衰竭;坏死性凋亡;肝细胞;受体相互作用蛋白激酶 3【中图分类号】R575.3Role of RIPK3 in LPS/D-GalN Induced Acute Liver FailureYU Qian,BIAN Shu,ZHANG Yuting,ZHAO Sai,LIU LiangmingShanghai Songjiang Clinical Medical College of Nanjing Medical University,Shanghai,201615,China【Abstract】Objective To study the role of receptor-interacting protein kinase 3(RIPK3)inacute liver failure induced by lipopolysaccharide/D-galactosamine(LPS/D-GalN).Methods SPF-grade male BALB/c mice were randomly divided into 3 groups(n=5).The ALF animal model wasestablished by intraperitoneal injection of LPS combined with D-GalN.One hour before intraperitone-al drug injection,the mice were pretreated with intravenous injections of 0.1%DMSO and theRIPK3-specific antagonist GSK872(dissolved in 0.1%DMSO),respectively.The degree of liverinjury was assessed by blood biochemical tests and histological changes in the liver tissue.PCR wasused to detect the expression levels of mRNA,while Western blotting and immunohistochemistrywas used to detect the expression levels of proteins.ResultsAnimal experimental results showedthat LPS/D-GalN-challenged mice exhibited significant inflammatory hemorrhagic necrotic damageand increased infiltration of F4/80+cells in liver tissues,and a notable elevation of ALT and ASTlevels in blood(both P0.01)when compared with the control.In addition,the mRNA levels ofF4/80,Mcp-1,Tnf-,Il-6,Ripk3 and Mlkl,as well as the levels of RIPK3 protein and p-MLKL/MLKL protein ratio,were all upregulated in liver tissues in comparison with the controlgroup,with all differences being statistically significant(all P 0.05).Compared to the mice inthe LPS/D-GalN group,the GSK872-pretreated mice displayed a marked reduction in the degree ofliver inflammatory injury,a significant decrease in the infiltration of F4/80+cells in the liver,anda substantial decline in serum ALT and AST levels(both P0.01).The mRNA levels of F4/80,Mcp-1,Tnf-,Il-6,Ripk3,and Mlkl as well as the levels of RIPK3 protein and p-MLKL/MLKLprotein ratio,were all downregulated in liver tissues,with all differences being statistically signifi-cant(all P0.05).Conclusion The RIPK3 inhibitor GSK872 can significantly block the expres-sion of RIPK3 in LPS/D-GalN-induced ALF in mice,mitigate liver tissue damage and inflammatorycell infiltration,and suppress the expression of necroptosis-related proteins.This suggests thatRIPK3 might promote the pathogenesis of ALF by influencing the molecules of the hepatic necroptot-ic apoptosis pathway.【Key words】acute liver failure;necroptosis;hepatocytes;receptor-interacting protein kinase 3 急性肝衰竭(acute liver failure,ALF)是肝细胞急性过度死亡相关性疾病。当肝实质细胞短期内急性大量死亡而不能为肝再生所代偿时,即可发生肝功能严重损伤,引起 ALF。早期肝病理学研究发现,ALF 主要表现为肝内大片或广泛性肝细胞坏死1。这是一种细胞膜破坏、细胞内容物释放的细胞死亡方式。已证实,肝细胞的这种死亡方式不受基因的调控,能引起肝内和全身严重炎症反应2。由于疾病进展快,且缺乏有效的内科治疗手段,ALF 患者死亡率一直居高不下1。近年,研究人员发现,在组织损伤过程中,还存在着一种受到基因调控的细胞死亡方式,称为坏死性凋亡3。坏死性凋亡也表现为细胞肿胀、膜损伤和细胞内容物释放,并能引起相关区域的炎症反应4。这种受调控的细胞死亡方式,有可能是将来 ALF 治疗研究的一个方向。人们有望通过对某个或某些关键基因的调控,来达到逆转或治疗ALF 的目的。受体相互作用蛋白激酶 3(receptor-interactingprotein kinase 3,RIPK3)是坏死性凋亡的主要执行者5。目前,已经有研究证明肝脏损伤过程中会发生肝细胞的坏死性凋亡3,肝细胞中 RIPK3启动子高甲基化可防止胆汁酸诱导的炎症和坏死性凋亡6。然而,RIPK3 在肝脏中的作用尚且存在争议7-8,特别是 RIPK3 在 ALF 中的作用目前仍不清楚。因而本实验拟在构建 ALF 动物模型的基础上,采用 RIPK3 特异性拮抗剂 GSK872 研究 RIPK3 抑制对 ALF 肝 损 伤 的 影 响。通 过 该 研 究,可 了 解RIPK3 诱导的坏死亡凋亡在 ALF 发生中的作用,并为将来探讨 ALF 的坏死性凋亡机制和靶向药物治疗提供实验基础。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 实验动物 6 周龄健康雄性 BALB/c 小鼠,SPF 级,体质量(19 2)g/只,购于浙江维通利华有限公司,许可证号:SCXK(浙)2019-0001。动物饲养于上海农林职业技术学院,使用许可证号:SYXK(沪)2020-0040。环境温度23 25,湿度40%70%。设施内动物换气次数约45 次/h,噪声 60 dB。实验前小鼠适应性喂养1 周,每日自由进食和饮水,每12 h 开灯或关灯。实验方案得到了南京医科大学实验动物福利伦理委员会的批准(批准编号:IACUC-2308009),并遵循国家实验动物的护理和使用标准。1.1.2 试剂与耗材 脂多糖(LPS)、D-半乳糖胺(D-GalN)购自美国 Sigma 公司;GSK872 购自美国 MCE 公司;引物由上海生物工程有限公司合成;Trizol 购自美国 Invitrogen 公司;逆转录试剂盒、qPCR 试剂盒及 BCA 定量试剂盒购自日本 TaKaRa公司;RIPK3 单克隆抗体、p-MLKL 单克隆抗体、MLKL 单克隆抗体(均 1 1 000 稀释)购自美国CST 公司;F4/80 单克隆抗体(1 1 500 稀释)和-Actin 单克隆抗体(11 000 稀释)购自美国 pro-teintech 公司;山羊抗小鼠 HRP 和山羊抗兔 HRP购自上海碧云天有限公司;显影液购自美国 Ther-mo Scientific 公司。1.2 方法1.2.1 动物分组及造模 15 只 BALB/c 小鼠随机分为 3 组,每组 5 只:对照组(Control),模型组(LPS/D-GalN),预 处 理 组(GSK872+LPS/D-GalN)。ALF 动物模型采用 LPS(50 g/kg)联合D-GalN(800 mg/kg)腹腔注射的方式制备。药物腹腔注射前 1 h,分别以 0.1%DMSO 和 RIPK3 特异性拮抗剂 GSK872(5 mg/kg,溶于 0.1%DM-SO)尾静脉注射进行预处理。1.2.2 标本取材 造模 6 h 后,BALB/c 小鼠使用2.5%阿佛丁(500 mg/kg)进行腹腔注射麻醉。继而使用1 mL 胰岛素注射针直接从心脏抽取血液,并立即置于促凝管中。分离出的血清用于后续生化791医学分子生物学杂志,2024,21(3):196-202 J Med Mol Biol,2024,21(3):196-202指标的检测。部分新鲜肝组织浸泡于 RNA Later中,这将用于 RNA 的提取以及后续荧光定量 PCR的检测。另每只小鼠从同一部位切取一叶肝脏样本,并将其放置于4%多聚甲醛中,用于后续病理切片和免疫组化的检测。剩余样本经液氮速冻后用于后续蛋白质印迹检测及备用。1.2.3 肝组织病理情况观察 将0.5 cm 0.5 cm 0.5 cm 新鲜肝组织置于 4%多聚甲醛中固定过夜后,使用石蜡包埋并切片,切片厚度为 5 m。接着,对切片进行苏木素和伊红(H&E)染色,并使用中性树胶进行封片。由病理科医生在光学显微镜下随机选取 3 个视野(100),参照 Ishak 评分系统进行肝损伤程度的评分,取各组积分总和进行统计学分析。1.2.4血清肝功能酶学指标测定每只小鼠抽取30 uL 血清,并用 1 PBS 将其稀释 10 倍后送到上海松江区中心医院检验科,采用全自动血生化分析仪测量各组小鼠血清 ALT 和 AST 的水平,结果乘以稀释倍数得到每只小鼠的实际 ALT 和 AST 水平。1.2.5免疫组化肝组织固定脱水后经过石蜡包埋、切片、烤片、脱蜡、水化和抗原修复这些步骤后,滴加一抗工作液孵育过夜。在用 PBS 洗涤之后,加入二抗工作液并在室温孵育1 h。之后再次用PBS 洗涤,然后加入 DAB 进行显色。显色后,用纯水清洗掉 DAB 残留液,并进行苏木素复染。最后,完成脱水、透明处理,并用中性树胶进行封片。1.2.6 实时荧光定量 PCR(real-time PCR)采用传统的 Trizol 法提取 RNA,并全程在冰上操作以防 RNA 的降解。提取的总 RNA 使用 60 uL 无酶水稀释,后测定其浓度及纯度。仅当样本 RNA 的A260/A280在 1.8 至 2.1 之间,以及 A260/A230大于 2.0时,才用于后续的逆转录和荧光定量 PCR。逆转录及荧光定量 PCR 按照试剂盒的说明书进行。内参基因为 Gapdh,采用 2-CT法对数据进行归一化处理。内参基因和目的基因的引物序列及产物长度见表 1。表 1 Real-time PCR 基因名称及引物序列基因引物序列 53产物(bp)Ripk3FTCTACAGCTTTGGGATCCTCGT92RACACACTGTTTCCCGGATTAGTGA92MlklFTGCCACTGGAAAGATCCCATTTG111RCGCAACAACTCAGGGCAAT111F4/80FTGCCCTAAGTATTCCAACTGCT133RCATGTTCAGGGCAAACGTCT133Mcp-1FCCAGCAAGATGATCCCAATGAGT179RTTCTGATCTCATTTGGTTCCGAT179Il-6FGACTTCCATCCAGTTGCCTT150RATGTGTAATTAAGCCTCCGACT150Tnf-FCCTATGTCTCAGCCTCTTCTCATTCCT82RACCGATCACCCCGAAGTTCAGT82GapdhFTGGCCTTCCGTGTTCCTACCC150RCCTGGTCCTCAGTGTAGCCCAA1501.2.7蛋白免疫印迹(Western blotting)取黄豆粒大小的肝组织置于 EP 管,加入 1 mL RIPA 蛋白裂解液和 3 颗预冷的 3 mm 小钢珠,置于组织研磨仪上研磨,60 Hz 研磨约 2 min,并在冰上裂解30 min,中间每 5 min 涡旋一次以确保蛋白充分裂解。然后,将样品以 12 000 r/min 在 4 离心 20min 并吸取上清用于后续蛋白定量。肝组织蛋白浓度用 BCA 试剂盒进行定量。定量完成后按比例加入 4 loading buffer,置于金属浴中 95 加热 5min 以确保蛋白充分变性。采用 12%聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳分离蛋白,并通过湿转将蛋白转移到 PVDF 膜上。转膜完成后用 5%BSA 室温封闭 1 h,并分别与兔单克隆抗体 RIPK3、p-MLKL 和 MLKL(均为 1 1 000 稀释)在 4 孵育过夜。第二天洗涤后与 HRP 标记二抗(12 000 稀释)室温孵育 1 h,洗涤后用超敏 ECL 显影液显色。使用-ACTIN(1 1 000)作为内参。采用Bio-rad 分子成像仪进行成像,Fiji 软件对相应条带进行灰度分析。1.3 统计学处理采用 GraphPad Prism 9.5.1 软件对实验数据进行分析,所有结果均显示为平均值 SEM,多样本891于倩,等.RIPK3 在 LPS/D-GalN 诱导急性肝衰竭中的作用研究组间比较采用 One-way ANOVA 分析,进一步进行两两比较,符合正态分布且方差齐时用 ordinaryone-way ANOVA 检验,不符合正态分布或者方差不齐采用 Brown-Forsythe and Welch ANOVA 或者Kruskal-Wallis 检验,P0.05 被认为差异具有统计学意义。2 结果2.1 各组小鼠肝组织病理变化的比较肝组织 HE 染色结果显示,Control 组小鼠肝小叶结构清晰,肝细胞未见变性和坏死,肝细胞索排列有序,汇管区结构正常,未见炎症细胞浸润。LPS/D-GalN 组可见肝小叶结构破坏,肝细胞呈局灶性坏死并伴嗜酸性小体形成,肝细胞索排列紊乱以及汇管区炎症细胞浸润,符合急性肝衰竭的表现。GSK872+LPS/D-GalN 组小鼠肝小叶结构无明显破坏,肝细胞变性和坏死较轻,肝细胞索排列有序,汇管区结构存在,炎症细胞浸润情况改善。参考 Ishak 评分系统对肝损伤程度进行评分,统计结果显示,和 Control 组相比,LPS/D-GalN 组小鼠肝损伤程度显著提高,差异具有显著统计学意义(P0.01);和 LPS/D-GalN 组相比,GSK872+LPS/D-GalN 组小鼠肝损伤程度明显改善,差异具有显著统计学意义(P0.01)(图 1)。这表明 ALF 期间肝脏 炎 症 坏 死 性 损 伤 加 重,而 RIPK3 抑 制 剂GSK872 可显著改善 LPS/D-GalN 攻击诱导的肝细胞坏死和炎症,这提示 RIPK3 可能参与了 ALF 过程中的病理组织损伤。A:各组小鼠肝组织的代表性苏木素-伊红染色图片(100),灰色框内的区域被放大以可视化炎症和坏死区域;B:各组小鼠肝损伤程度的组织学评分,所有结果均显示为平均值 SEM;比例尺,200 m。1:Control 组;2:LPS/D-GalN 组;3:GSK872+LPS/D-GalN 组。与对照组比较,P0.01;与 LPS/D-GalN 组比较,#P0.01。图 1 各组小鼠肝组织病理形态学变化2.2 各组小鼠血清转氨酶水平变化的情况和 Control 组相比,LPS/D-GalN 组小鼠血清ALT 和 AST 水平显著升高,差异具有统计学意义(P均 0.01)。当采用拮抗剂 GSK872 预处理后,LPS/D-GalN 攻击小鼠血清 ALT 和 AST 水平显著下降,差异具有统计学意义(P均 0.01)(图 2)。血清转氨酶水平的改变同样也提示 RIPK3 可能参与了 ALF 过程中肝细胞的损伤和坏死。1:Control;2:LPS/D-GalN;3:GSK872+LPS/D-GalN。与对照组比较,P 0.01;与 LPS/D-GalN 组比较,#P0.01。图 2 各组小鼠血清 ALT 和 AST 水平2.3 各组小鼠肝脏坏死性凋亡相关基因和蛋白质的表达情况 荧光定量 PCR 的结果显示,和 Control 组相比,LPS/D-GalN 组小鼠 Ripk3 mRNA 表达显著上调,且差异具有统计学意义(P 0.05);和 LPS/D-GalN 组 相 比,GSK872+LPS/D-GalN 组 小 鼠Ripk3 mRNA 表达下调,且差异具有统计学意义(P 0.05)。和 Control 组相比,LPS/D-GalN 组小鼠 Mlkl mRNA 表达上调,且差异具有统计学意义(P 0.05);和 LPS/D-GalN 组相比,GSK872+LPS/D-GalN 组小鼠 Mlkl mRNA 表达略微下调,差异具有统计学意义(P0.05)(图 3A)。这表明ALF 期间肝脏 Ripk3 和 Mlkl mRNA 表达上调,而RIPK3 抑制剂 GSK872 可以抑制 Ripk3 mRNA 的表达进而间接抑制 Mlkl mRNA 的表达。蛋白质印迹结果显示,和 Control 组相比,LPS/D-GalN 组小鼠肝组织 RIPK3 蛋白和 p-MLKL/MLKL 蛋白比值均上调,差异具有显著统计学意义(P均 0.01);和 LPS/D-GalN 组相比,GSK872+LPS/D-GalN 组小鼠肝内 RIPK3 蛋白和 p-MLKL/991医学分子生物学杂志,2024,21(3):196-202 J Med Mol Biol,2024,21(3):196-202MLKL 蛋白比值均下调,差异具有显著统计学意义(P均 0.01)(图 3B)。这表明 ALF 期间肝内RIPK3 蛋白上调并引起下游 MLKL 的磷酸化激活,而 RIPK3 抑制剂 GSK872 可显著阻断 RIPK3 蛋白质表达,并阻断该蛋白质下游 MLKL 蛋白质的磷酸化激活,提示 ALF 期间肝脏存在 RIPK3 依赖的坏死性凋亡。2.4 各组小鼠肝组织切片 F4/80+细胞浸润情况各组小鼠肝脏 F4/80 mRNA 的表达情况,和Control 组相比,LPS/D-GalN 组小鼠 F4/80 mRNA表达显著上调,且差异具有统计学意义(P 0.01);和 LPS/D-GalN 组相比,GSK872+LPS/D-GalN 组小鼠 F4/80 mRNA 表达下调,且差异具有统计学意义(P0.01)(图 4A)。与蛋白表达结果一致,LPS/D-GalN 攻击的小鼠肝脏中 F4/80mRNA 的水平显著高于对照组小鼠,而 RIPK3 抑制剂预处理后 F4/80 mRNA 的水平显著降低,提示RIPK3 可能参与了 ALF 过程中巨噬细胞的浸润。A:各组小鼠肝脏 Ripk3 和 Mlkl mRNA 的相对表达水平;B:蛋白质印迹检测 RIPK3、p-MLKL 和 MLKL 的蛋白表达情况及蛋白质表达相对定量。1:Control 组;2:LPS/D-GalN 组;3:GSK872+LPS/D-GalN 组。与对照组比较,P0.05,P0.01;与 LPS/D-GalN 组比较,#P0.05,#P0.01。图 3 各组小鼠肝脏 Ripk3 和 Mlkl mRNA 的相对表达水平与 RIPK3、p-MLKL 和 MLKL 蛋白的表达水平 各组小鼠肝组织切片 F4/80 免疫组化染色结果显示,和 Control 组相比,LPS/D-GalN 组小鼠 F4/80+细胞浸润增多,且差异具有统计学意义(P 0.01);与 LPS/D-GalN 组相比,GSK872+LPS/D-GalN 组小鼠 F4/80+细胞浸润明显减少,且差异具有统计学意义(P 0.01)。这表明 ALF 肝损伤过程中,肝内巨噬细胞浸润显著增加,而 RIPK3 抑制剂预处理后巨噬细胞浸润明显减轻,这提示RIPK3 可能参与了 ALF 过程中巨噬细胞的浸润(图 4)。A:各组小鼠肝脏 F4/80 mRNA 相对表达水平分析;B:各组小鼠肝组织代表性的 F4/80 免疫组化图片(200);C:使用 FIJI 软件对 F4/80+细胞进行定量分析。所有结果均显示为平均值 SEM,比例尺,100 m。1:Control组;2:LPS/D-GalN 组;3:GSK872+LPS/D-GalN 组。与对照组比较,P 0.01;与 LPS/D-GalN 组比较,#P0.01。图 4 各组小鼠肝组织 F4/80 mRNA 相对表达水平分析和 F4/80 免疫组化分析2.5各组小鼠肝脏炎症相关因子 Mcp-1、Tnf-和 Il-6mRNA 的表达情况 实验还采用荧光定量 PCR 的方法检测了各组小鼠肝脏炎症相关因子 Mcp-1、Tnf-和 Il-6 mRNA的相对表达情况,与 Control 组相比,LPS/D-GalN组小鼠 Mcp-1、Tnf-和 Il-6 mRNA 表达上调,且差异具有统计学意义(P均 0.05);与 LPS/D-GalN组相比,GSK872+LPS/D-GalN 组小鼠 Mcp-1、Tnf-和 Il-6 mRNA 表达下调,且差异具有统计学意义(P均0.05)(图 5)。ALF 肝损伤过程中趋化因子相关基因 Mcp-1 mRNA 和促炎细胞因子相关基因Tnf-和 Il-6 mRNA 表达上调,而 RIPK3 抑制剂预002于倩,等.RIPK3 在 LPS/D-GalN 诱导急性肝衰竭中的作用研究处理后趋化因子相关基因 Mcp-1 mRNA 和促炎细胞因子相关基因 Tnf-和 Il-6 mRNA 表达下调,提示RIPK3 可能参与 ALF 过程中趋化因子和促炎细胞因子的释放。1:Control;2:LPS/D-GalN;3:GSK872+LPS/D-GalN。与对照组比较,P0.05,P 0.01;与 LPS/D-GalN 组比较,#P0.05,#P0.01。图 5 各组小鼠肝脏炎症相关因子 Mcp-1、Tnf-和 Il-6 mRNA 的表达情况3 讨论本实验采用了前期构建的 ALF 小鼠模型9。在该模型中,LPS/D-GalN 攻击 6 h 后小鼠肝脏病理损伤情况加重,并且血清 AST 和 ALT 水平显著提高。而 RIPK3 抑制剂预处理能够减轻 LPS/D-GalN 诱导的病理损伤并且显著改善血清 AST 和ALT 水平。这提示,RIPK3 的抑制可以显著改善LPS/D-GalN 诱导的肝脏损伤情况。Hoff 等6的研究发现,在急性毒性 APAP 肝损伤模型中,离体肝细胞中检测不到 RIPK3 的表达。因此,我们认为RIPK3 介导的坏死性凋亡并非存在于所有肝损伤过程中。为了探究 LPS/D-GalN 诱导的肝脏损伤情况的改善是否和 RIPK3 蛋白表达的抑制相关,我们检测了 RIPK3 蛋白在对照组、急性肝衰竭组和抑制剂预处理组的表达情况,发现和对照组相比,RIPK3 蛋白表达水平显著上调,同时伴随 Ripk3mRNA 表达显著上调;而抑制剂预处理组 RIPK3蛋白表达显著下降,伴随 Ripk3 mRNA 表达下调。这些结果从基因表达水平证明了急性肝衰竭时存在肝脏细胞的坏死性凋亡,而 RIPK3 的抑制可以预防 LPS/D-GalN 诱导的肝脏损伤。一般情况下,MLKL 在坏死性凋亡过程中充当RIPK3 的效应器,在被磷酸化激活后,MLKL 迁移到质膜,导致细胞崩解,从而释放细胞内容物,导致细胞坏死性凋亡10。然而 Gnther 等11的研究发现肝炎期间 MLKL 可以独立于 RIPK3 介导肝细胞坏死性凋亡,这是一种非典型的坏死性凋亡途径。为了探究 LPS/D-GalN 刺激的条件下 RIPK3 介导的坏死性凋亡的具体机制,我们还检测了 p-MLKL 和 MLKL 的蛋白表达情况,发现和对照组相比,急性肝衰竭组 p-MLKL/MLKL 的比值上调,伴随 Mlkl mRNA 表达上调;而应用 RIPK3 抑制剂预处理后,p-MLKL/MLKL 的比值显著下调,伴随Mlkl mRNA 表达下调。这提示在 LPS/D-GalN 联合诱导的急性肝衰竭模型中,p-MLKL/MLKL 依赖于RIPK3 介导肝细胞坏死性凋亡。Sun 等12的研究表明,肝细胞在内毒素血症中起到了关键的免疫调节作用:内毒素血症显著促进肝细胞,尤其是门脉周围肝细胞,向促炎表型转变;此外,CCL2(又称单核细胞趋化蛋白 1 或MCP-1)表达上调的促炎性肝细胞通过 CCL2-CCR2途径增强了对巨噬细胞的募集12。F4/80 是小鼠巨噬细胞的标志蛋白,与 CCL2 一样,与炎症和巨噬细胞的活动密切相关13。因此,我们还检测了不同分组中 Mcp-1 和 F4/80 mRNA 的表达情况以及F4/80+细胞浸润情况。我们的研究结果发现,在急性肝衰竭模型小鼠中,肝脏 Mcp-1 mRNA 显著上调,伴随 F4/80 mRNA 表达上调和 F4/80+细胞浸润的增多。与急性肝衰竭组相比,RIPK3 抑制剂预处理后,小鼠肝脏中的 Mcp-1 mRNA 和 F4/80 mR-NA 表达显著下调,F4/80+细胞浸润也明显减少。这些结果提示,在 LPS/D-GalN 联合诱导的急性肝衰竭模型中,肝细胞可能通过向促炎表型的转变来增强对巨噬细胞的募集,而 RIPK3 抑制剂预处理可以改善肝细胞的炎症状态从而减少巨噬细胞的浸润。我们进一步检测了各分组中促炎细胞因子 Tnf-和 Il-6 的基因表达情况。发现与对照组相比,急性肝衰竭组小鼠肝脏中 Tnf-mRNA 和 Il-6 mRNA表达显著增加。而和急性肝衰竭组相比,RIPK3 抑制剂预处理组小鼠 Tnf-mRNA 和 Il-6 mRNA 表达下调。这些结果表明在急性肝衰竭组中,肝脏巨噬细胞的招募加剧促炎细胞因子的释放。而 RIKP3抑制剂的应用可能通过抑制肝细胞的促炎表型转102医学分子生物学杂志,2024,21(3):196-202 J Med Mol Biol,2024,21(3):196-202变,从而降低了 MCP-1 的生成和巨噬细胞的响应,进而降低促炎细胞因子的释放,最终缓解肝损伤。综上所述,在 LPS/D-GalN 联合诱导的急性肝衰竭中存在肝细胞的坏死性凋亡,而 RIPK3 的抑制可以预防 LPS/D-GalN 诱导的肝脏损伤。RIPK3抑制减少了 p-MLKL 和 MLKL 的表达,从而抑制肝细胞的坏死性凋亡,起到肝保护作用。此外,RIPK3 的抑制还可以通过抑制肝细胞的促炎表型转变,减少巨噬细胞的募集,进而降低促炎细胞因子的释放,最终缓解肝损伤。参考文献1LEE W M.Acute liver failureJ.N Engl J Med,1993,329(25):1862-1872.2 WU Z,HAN M,CHEN T,et al.Acute liver failure:mech-anisms of immune-mediated liver injuryJ.Liver Int,2010,30(6):782-794.3 ROYCHOWDHURY S,MCMULLEN M R,PISANO S G,et al.Absence of receptor interacting protein kinase 3 pre-vents ethanol-induced liver injuryJ.Hepatology,2013,57(5):1773-1783.4 MORIWAKI 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