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【思考感悟】植物细胞等有细胞壁，在细胞最外层，为什么说细胞膜是边界呢？由细胞膜的屏障功能所决定，细胞膜不仅有保护作用还具有选择透过性，而细胞壁是全透性的。6、生物多样性保护的措施： （1）就地保护：自然保护区和国家森林公园是生物多样性就地保护的场合。 （2）迁地保护：动物园、植物园、濒危物种保护中心。 （3）建立精子库、种子库，运用生物技术对濒危物种的基因进行保护等。（4）加强宣传和执法力度。 实验汇总：一、检测生物组织中的还原糖、脂肪和蛋白质1糖的鉴定：原理：(1)淀粉：遇碘液变蓝色，这是淀粉特有的颜色反映。(2)还原性糖(单糖、麦芽糖和乳糖)：与斐林试剂反映，可以产生砖红色沉淀。材料用品：（1）实验材料：苹果或梨匀浆，马铃薯匀浆（2）配制：甲液：0.1g/mL的NaOH溶液+ 乙液：0.05g/mL CuSO4溶液 使用：混合后使用，且现配现用。 条件：水浴加热实验环节：实验结果分析：（1）淀粉：假如出现蓝色，则待测样品中具有淀粉；反之，则没有。(2）还原性糖：假如出现砖红色沉淀，则待测样品中具有还原糖，反之；则没有。2脂肪的鉴定：原理：脂肪可以被苏丹染液染成橘黄色。（在实验中用50%酒精洗去浮色显微镜观测橘黄色脂肪颗粒）材料用品：（1）实验材料：花生种子，花生匀浆（2）试剂：苏丹III染液、苏丹IV染液实验环节实验结果分析：假如观测到橘黄色（红色），则待测样品中具有脂肪；反之，则没有。3蛋白质鉴定：原理：蛋白质与双缩脲试剂产生紫色的颜色反映材料用品：（1）实验材料：豆浆、鲜肝提取液（2）双缩脲试剂：配制：A液：0.1g/mL的NaOH溶液（2mL）和B液：0.01g/mL CuSO4溶液（3-4滴）使用：分开使用，先加NaOH溶液，再加CuSO4溶液。实验环节实验结果分析：假如出现紫色，则待测样品中具有蛋白质；反之，则没有。4、 注意事项：（1）还原性糖植物组织取材条件？ 答：浅色：不能用绿色叶片、西瓜、血液等材料，防止颜色的干扰。还原糖含量高：不能用马铃薯(含淀粉)、甘蔗、甜菜(含蔗糖)。含糖量较高、颜色为白色或近于白色，如：苹果、梨、白色甘蓝叶、白萝卜等。 （2）花生种子切片为什么要薄？ 答：只有很薄的切片，才干透光，而用于显微镜的观测。 （3）唯一需要加热 还原糖鉴定，且必需水浴加热，不能用酒精灯直接加热。若不加热则无砖红色沉淀出现。 唯一需要显微镜 脂肪鉴定。（4）若用大豆做材料，必须提前浸泡；若用蛋清作材料，必须稀释，防止其粘在试管壁上不易涮洗；且该实验应预留部分组织样液做对比。二、实验：观测植物细胞的质壁分离和复原一、实验原理：原生质层（细胞膜、液泡膜、两层膜之间细胞质）相称于半透膜，l 当外界溶液的浓度大于细胞液浓度时，细胞将失水，原生质层和细胞壁都会收缩，但原生质层伸缩性比细胞壁大，所以原生质层就会与细胞壁分开，发生“质壁分离”。l 反之，当外界溶液的浓度小于细胞液浓度时，细胞将吸水，原生质层会慢慢恢复本来状态，使细胞发生“质壁分离复原”。l二、材料用品：紫色洋葱表皮，0.3g/ml蔗糖溶液，清水，载玻片，镊子，滴管，显微镜等三、方法环节：（1）制作洋葱表皮临时装片。（2）低倍镜下观测原生质层位置。（3）在盖玻片一侧滴一滴蔗糖溶液，另一侧用吸水纸吸，反复几次，让洋葱表皮浸润在蔗糖溶液中。（4）低倍镜下观测原生质层位置、细胞大小变化（变小），观测细胞是否发生质壁分离。（5）在盖玻片一侧滴一滴清水，另一侧用吸水纸吸，反复几次，让洋葱表皮浸润在清水中。（6）低倍镜下观测原生质层位置、细胞大小变化（变大），观测是否质壁分离复原。四、实验结果分析：细胞液浓度外界溶液浓度 细胞失水（质壁分离）细胞液浓度外界溶液浓度 细胞吸水（质壁分离复原） 五、特别提醒（1）实验成功的关键是实验材料的选择，选择有大液泡并有颜色的植物细胞，便于在显微镜下观测。（2）质壁分离和质壁分离复原中水分子移动是双向的，结果是双向水分子运动的差别所导致的现象。（3）质壁分离后在细胞壁和细胞膜之间充满的是浓度减少的外界溶液，因细胞壁是全透性且有水分子通过原生质层渗出来。（4）若用50%蔗糖溶液做实验，能发生质壁分离但不能复原，由于细胞过度失水而死亡。（5）若用尿素、乙二醇、KNO3、NaCl做实验会出现自动复原现象，因外界物质会转移到细胞内而引起细胞液浓度升高。（5）实验拓展：可运用本实验原理测定细胞液浓度、判断细胞的死活、说明原生质层的伸缩性大于细胞壁的伸缩性等。三、探究影响酶活性的因素一、酶的高效性比较过氧化氢在不同条件下的分解（1）实验过程分析（2）实验注意事项实验时必须用新鲜的、刚从活的动物体中取出的肝脏作实验材料。肝脏假如不新鲜，肝细胞内的过氧化氢酶等有机物就会在腐生细菌的作用下分解，使组织中酶分子的数量减少且活性减少。二、酶的专一性三、探究温度对酶活性的影响（1）实验过程分析 （2）实验注意事项由于过氧化氢酶的反映底物过氧化氢受热会分解，所以用其做温度探究的实验，会对实验结果带来干扰。 由于斐林试剂在使用时需要加热，这对温度探究带来干扰，而使用碘液无需加热，对实验无干扰。四、探究pH对酶活性的影响 思考：为什么不能用淀粉酶做探究pH的实验？答：由于淀粉在酸性条件下会分解，这对于判断淀粉酶能否使得淀粉水解出现干扰。故不能使用。四、叶绿体中的色素的提取和分离1、原理：叶绿体中的色素能溶解于有机溶剂（如丙酮、酒精等）。 叶绿体中的色素在层析液中的溶解度不同，溶解度高的随层析液在滤纸上扩散得快；反之则慢。2、材料用品：新鲜的绿叶（菠菜的绿叶等）。干燥的定性滤纸，试管，棉塞，试管架，研钵，玻璃滤斗，尼龙布，毛细吸管，剪刀，药勺，量筒（10Ml），天平。无水乙醇，层析液（20份在6090下分馏出来的石油醚、2份丙酮和1份苯混合而成。93号汽油也可代用），SiO2和CaCO3。3、方法环节：（1）提取绿叶中色素：称取绿叶5g剪碎置于研钵放入少许SiO2和CaCO3加入10mL丙酮充足研磨过滤收集滤液（试管口用棉塞塞严）；（2）制备滤纸条：将干燥的滤纸剪成6cm长，1cm宽的纸条，剪去一端两角（使层析液同时到达滤液细线），在距剪角一端1cm处用铅笔画线；（3）画滤液细线：用毛细管吸少量的滤液沿铅笔线处小心均匀地划一条滤液细线，干燥后反复划2-3次；（4）分离色素：向烧杯中倒入3ml层析液（以层析液不没及滤液细线为准），将滤纸条尖端朝下略微斜靠烧杯内壁，轻轻插入层析液中，用培养皿盖盖上烧杯。4、结果分析：色素在滤纸条上的分布如下图： （橙黄色） 最快（溶解度最大） （黄 色） （蓝绿色） 最宽（含量最多） （黄绿色） 最慢（溶解度最小）5、注意：丙酮的用途是提取（溶解）叶绿体中的色素，石英砂的作用是为了研磨充足，碳酸钙的作用是防止研磨时叶绿体中的色素受到破坏；层析液的的用途是分离叶绿体中的色素；分离色素时，层析液不能没及滤液细线的因素是滤液细线上的色素会溶解到层析液中。五、探究酵母菌的呼吸方式1、实验原理：酵母菌是一种单细胞真菌，在有氧和无氧的条件下都能生存。在无氧或缺氧的条件下能进行无氧呼吸，在氧气富余的条件下能进行有氧呼吸，因此便于用来研究细胞的呼吸方式。在探究活动中，需要设计和进行对比实验，分析有氧条件下和无氧条件酵母菌细胞的呼吸情况。CO2可以使澄清的石灰水变浑浊，也可使溴麝香草酚蓝水溶液由蓝变绿再变黄。橙色的重铬酸钾溶液在酸性条件下与乙醇发生化学反映，变成绿色。2、实验设计：3、实验结果的分析：（1）检测CO2的产生：观测石灰水浑浊限度或者溴麝香草酚蓝水溶液变成黄色的时间长短，可以检测酵母菌培养液中产生CO2情况。根据相关实验现象分析得出酵母既能进行有氧呼吸，也能进行无氧呼吸。（2）检测酒精的产生：将两组实验中的酵母菌培养液各取2mL，置于2只干净的试管中，分别加入0.5mL溶有0.1g重铬酸钾的浓硫酸溶液,轻轻振荡混允,观测试管中溶液的颜色变化,分析得出酒精是酵母菌无氧呼吸的产物。六、观测植物细胞的有丝分裂实验原理： 高等植物的分生组织有丝分裂较旺盛。可以用高倍镜观测植物细胞有丝分裂的过程，根据各个时期细胞内染色体（或染色质）的变化情况，辨认该细胞处在有丝分裂的哪个时期。细胞核内的染色体容易被碱性燃料（龙胆紫、醋酸洋红）着色。材料用品：洋葱（蒜、葱）。显微镜，栽玻片，盖玻片，玻璃皿，剪刀，镊子，滴管。质量分数15%的盐酸与体积分数95%的酒精1：1配制成解离液，质量分数为0.01g/mL的或0.02g/mL的龙胆紫溶液（或醋酸洋红）。方法环节：（1）洋葱根尖培养：实验课前34天，取洋葱一个，放在广口瓶上。瓶内装满清水，洋葱底部接触瓶内水面，置于温暖处，常换水。待根长5cm时，取健壮的根尖制片观测。（2）装片的制作：过程方 法时间目 的解离上午10时至下午2时，剪去洋葱根尖2-3mm，立即放入盛入有盐酸和酒精混合液（1：1）的玻璃皿中，在温室下解离。3-5min用药液使组织中的细胞互相分离开来漂洗待根尖酥软后，用镊子取出，放入盛入清水的玻璃皿中漂洗。约10min洗去药液，防止解离过度染色把根尖放进盛有龙胆紫溶液（或醋酸洋红液）的玻璃皿中染色。3-5min染料能使染色体着色。制片用镊子将这段根尖取出来，放在载玻片上，加一滴清水，并用镊子尖把根尖能碎，盖上盖玻片，在盖玻片上再加一片载玻片。然后，用拇指轻轻的按压载玻片。使细胞分散开来，有助于观测（3）洋葱根尖细胞有丝分裂的观测：先低倍镜观测：找到分生区细胞（细胞呈正方形，排列紧密，有的细胞正在分裂）再高倍镜观测：找到分生区细胞后，移走低倍镜，换上高倍镜，用细准焦螺旋和反光镜把视野调整清楚。观测：找出处在细胞分裂期中期的细胞，再找出前期、后期、末期的细胞。（根据染色体的变化特点判断各个时期）实验结果分析：中期细胞中的染色体的形态数目最清楚，染色体均排列在赤道板上。后期细胞中的染色体分布在细胞两极。末期细胞赤道板处出现细胞板，形成细胞壁，两消、两现。前期细胞中染色体散乱分布在细胞中央，两消、两现。考点提醒： （1）培养根尖时，应选用老洋葱，由于新洋葱尚在休眠，不易生根。 （2）根尖分生区的细胞能进行有丝分裂；上午10时到下午2时细胞分裂活跃。 （3）解离是为了使细胞互相分离开来，压片是为了使细胞互相分散开来；再加一块载玻片是为了受力均匀，防止盖玻片被压破。 （4）分生区细胞中，什么时期的细胞最多？为什么？ 答：间期；由于在细胞周期中，间期时间最长。 （5）所观测的细胞能从中期变化到后期吗？为什么？ 答：不能，由于所观测的细胞都是停留在某一时期的死细胞。 （6）观测洋葱表皮细胞能否看到染色体？为什么？ 答：不能，由于洋葱表皮细胞一般不分裂。 （7）若观测时不能看到染色体，其因素是什么？ 答：没有找到分生区细胞；没有找到处在分裂期的细胞；染液过稀；染色时间过短。七、调查人群中的遗传病方法和过程：1、可以以小组为单位进行研究，小组成员也可以分工进行调查。2、每个小组可调查周边熟悉的410个家庭（或家系）中遗传病的情况。3、调查时，最佳选取群体中发病率较高的单基因遗传病，如红绿色盲、白化病、高度近视（600度以上）等。4、调查时要具体询问，如实记录。5、小组调查数据应在班级和年级中进行汇总（以保证调查的群体足够大）4、对某个家庭进行调查时，被调查成员之间的血缘关系必须写清楚，并注明性别。5、必须记录被调查的某种遗传病在人群中的发病率。，结果分析：被调查人数为2 747人，其中色盲患者为38人(男性37人，女性1人)，红绿色盲的发病率为1.38%。男性红绿色盲的发病率为1.35%，女性红绿色盲的发病率为0.03%。两者均低于我国社会人群男女红绿色盲的发病率。结论：我国社会人群中，红绿色盲患者男性明显多于女性。注意：调查发病率时，随机取样，样本足够大； 调查遗传方式时，选取患者家系调查，并画出系谱图。九、 培养液中酵母菌种群数量的动态变化一、实验原理：1、酵母菌可以用液体培养基来培养，培养液中的酵母菌种群的增长情况与培养液中的成分、空间、PH、温度等因素有关，我们可以根据培养液中的酵母菌数量和时间为坐标轴做曲线，从而掌握酵母菌种群数量的变化情况。2、运用血球计数板在显微镜下直接计数是一种常用的细胞计数法，这种方法可以直接测定样品中所有的细胞数目，所以一般用于单细胞微生物数量的测定，由于血球计数板上的计数室盖上盖玻片后的容积是一定的，所以可根据在显微镜下观测到的细胞数目来计算单位体积的细胞的总数目。二、实验材料：酵母菌菌种，无菌马铃薯培养液或肉汤培养液。三、实验用品：无菌水，试管，棉塞，恒温培养箱，显微镜，无菌滴管，无菌移液管，小烧杯或小试管，血球计数板(2mm2mm)、纱布、滤纸、镊子、盖玻片。四、方法环节：1、取相同试管若干支，分别加入5ml肉汤培养液，塞上棉塞。2、用高压锅进行高压蒸汽灭菌后冷却至室温，标记甲、乙、丙等。3、将酵母菌母液分别加入试管各5ml，摇匀后用血球计数板计数起始酵母液个数，做好记录。4、将各试管送进恒温箱，25下培养7天。5、天天同一时间，各组取出本组的试管，用血球计数板计数酵母菌个数，并作记录，连续观测7天。结果分析：在空间、食物等环境条件有限的情况下，刚接种到培养基上，种群数量增长缓慢；第二个阶段种群数量呈指数增长；第三个阶段种群数量达成最大并处在稳定状态，即达成K值；第四个阶段种群数量显著下降。生物选修3 专题1 基因工程基因工程的概念基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA重组和转基因技术，赋予生物以新的遗传特性，发明出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，又叫做DNA重组技术。（一）基因工程的基本工具1.“分子手术刀”限制性核酸内切酶（限制酶）（1）来源：重要是从原核生物中分离纯化出来的。（2）功能：可以辨认双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，因此具有专一性。（3）结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式：黏性末端和平末端。2.“分子缝合针”DNA连接酶(1)两种DNA连接酶（EcoliDNA连接酶和T4-DNA连接酶）的比较：相同点：都缝合磷酸二酯键。区别：EcoliDNA连接酶来源于大肠杆菌，只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来；而T4DNA连接酶能缝合两种末端，但连接平末端的之间的效率较低。(2)与DNA聚合酶作用的异同:DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端，形成磷酸二酯键。DNA连接酶是连接两个DNA片段的末端，形成磷酸二酯键。DNA连接酶DNA聚合酶不同点连接的DNA双链单链模板不要模板要模板连接的对象2个DNA片段单个脱氧核苷酸加到已存在的单链DNA片段上相同点作用实质形成磷酸二酯键化学本质蛋白质3.“分子运送车”载体（1）载体具有的条件：能在受体细胞中复制并稳定保存。具有一至多个限制酶切点，供外源DNA片段插入。具有标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。（2）最常用的载体是质粒,它是一种裸露的、结构简朴的、独立于细菌染色体之外，并具有自我复制能力的双链环状DNA分子。（3）其它载体：噬菌体的衍生物、动植物病毒 (二)基因工程的基本操作程序第一步：目的基因的获取1.目的基因是指： 编码蛋白质的结构基因 。2.原核基因采用直接分离获得，真核基因是人工合成。人工合成目的基因的常用方法有反转录法_和化学合成法_。3.PCR技术扩增目的基因（1）PCR的含义：是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。（2）目的：获取大量的目的基因（3）原理：DNA双链复制（4）过程：第一步：加热至9095DNA解链为单链；第二步：冷却到5560，引物与两条单链DNA结合；第三步：加热至7075，TaqDNA聚合酶从引物起始进行互补链的合成。（5）特点：指数(2n)形式扩增第二步：基因表达载体的构建1.目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传至下一代，使目的基因可以表达和发挥作用。2.组成：目的基因启动子终止子标记基因（1）启动子：是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，是RNA聚合酶辨认和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需的蛋白质。（2）终止子：也是一段有特殊结构的DNA片段 ，位于基因的尾端。（3）标记基因的作用：是为了鉴定受体细胞中是否具有目的基因，从而将具有目的基因的细胞筛选出来。常用的标记基因是抗生素基因。第三步：将目的基因导入受体细胞_1.转化的概念：是目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。2.常用的转化方法：将目的基因导入植物细胞：采用最多的方法是 农杆菌转化法，另一方面尚有 基因枪法和 花粉管通道法等。将目的基因导入动物细胞：最常用的方法是 显微注射技术。方法的受体细胞多是 受精卵。将目的基因导入微生物细胞：原核生物作为受体细胞的因素是 繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少 ，最常用的原核细胞是 大肠杆菌 ，其转化方法是：先用 Ca2+ 解决细胞，使其成为 感受态细胞 ，再将 重组表达载体DNA分子 溶于缓冲液中与感受态细胞混合，在一定的温度下促进感受态细胞吸取DNA分子，完毕转化过程。3.重组细胞导入受体细胞后，筛选具有基因表达载体受体细胞的依据是标记基因是否表达。第四步：目的基因的检测和表达1.一方面要检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因，方法是采用DNA分子杂交(DNA-DNA)技术。2.另一方面还要检测目的基因是否转录出mRNA，方法是采用DNA分子杂交(DNA-RNA)技术。3.最后检测目的基因是否翻译成蛋白质，方法是采用抗原抗体杂交技术。4.有时还需进行个体生物学水平的鉴定。如生物抗虫或抗病的鉴定等。（三）基因工程的应用1.植物基因工程：抗虫、抗病、抗逆转基因植物，运用转基因改良植物的品质。2.动物基因工程：提高动物生长速度、改善畜产品品质、用转基因动物生产药物。3.基因治疗：把正常的外源基因导入病人体内，使该基因表达产物发挥作用。4.基因诊断：又称为DNA诊断，是采用基因检测的方法来判断患者是否出现了基因异常或携带病原体。（四）蛋白质工程的概念蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求。（基因工程在原则上只能生产自然界已存在的蛋白质）转录 翻译蛋白质工程与基因工程区别蛋白质工程基因工程实质通过改造基因，以定向改造天然蛋白质，甚至发明自然界不存在的蛋白质将目的基因从供体转移到受体细胞，并在受体细胞中表达结果合成自然界不存在的蛋白质只能生产自然界已存在的蛋白质联系蛋白质工程是在基因工程基础上，延伸出的第二代基因工程专题2 细胞工程2.1 植物细胞工程一、植物细胞工程 1、原理：细胞全能性:细胞具有该生物的所有遗传信息 并具有发育成完毕个体的能力。全能性表达的难易限度：受精卵生殖细胞干细胞体细胞；植物细胞动物细胞2、 植物组织培养技术 概念：是指依据细胞全能性的原理，在无菌条件下，分离植物的器官、组织、细胞或原生质体（称为外植体），并在培养基上培养，在适宜的条件下使其长成部分或完整植株的技术。（1）过程：离体的植物器官、组织或细胞 脱分化愈伤组织 再分化试管苗 植物体（2）用途：微型繁殖、作物脱毒、制造人工种子、单倍体育种、细胞产物的工厂化生产。（3）地位：是哺育转基因植物、植物体细胞杂交哺育植物新品种的最后一道工序。l 愈伤组织：是一团没有特定结构和功能并处在旺盛分裂状态的薄壁细胞。l 脱分化：由已分化的植物细胞形成愈伤组织的过程。l 再分化：愈伤组织生长一段时间后再移植到新的培养基（人教版：分化培养基）上继续培 养，重新诱导分化形成根、芽等器官的过程。（4）条件：一方面用消毒剂除去外植体表面的微生物，在无菌条件下将其放到适宜的培养基上。培养基一般有五类成分：（1）水（2）无机营养：涉及大量元素和微量元素。（3）有机营养：重要有糖、维生素、氨基酸。（4）生长物质：指植物激素，常用的有生长素和细胞分裂素，离体培养物的根芽分化取决于激素间的比例。此外，赤霉素对刺激细胞的伸长也有一定的作用。（5）天然附加物：如椰子乳、酵母提取物等。3.植物体细胞杂交技术（1）过程：（2）诱导融合的方法：物理法涉及离心、振动、电刺激等。化学法一般是用聚乙二醇（PEG）作为诱导剂。（3）意义：克服了远缘杂交不亲和的障碍。考点细化： 用纤维素酶、果胶酶去除细胞壁获得原生质体 物理方法：电刺激、振荡、离心；化学方法：聚乙二醇 植物体细胞杂交完毕的标志是新细胞壁的形成 融合后的杂种细胞通过植物组织培养才干发育成完整的植物体二、植物细胞工程的应用1、植物繁殖的新途径（1）微型繁殖：用于快速繁殖优良品种的植物组织培养技术。特点：保持优良品种的遗传特性；高效快速的实现种苗的大量繁殖。（2）作物脱毒：植物分生区附近，如茎尖、根尖，很少被病毒感染，甚至无病毒，因而被用来哺育无病毒植株。（3）人工种子：以植物组织培养得到的胚状体、不定芽、顶芽、腋芽等为材料，通过人工薄膜包装得到的种子。2、作物新品种的哺育：单倍体育种和突变体的运用。3、细胞产物的工厂化生产：细胞产物有蛋白质、脂肪、糖类、药物、香料、生物碱等。【要点名师精解】植物组织培养和植物体细胞杂交的比较名称植物组织培养植物体细胞杂交原理细胞的全能性细胞膜具有一定的流动性和细胞的全能性过程注意事项选材：选取根尖、茎尖、形成层部位、最容易诱导脱分化光照：脱分化过程不需光照，再分化过程一定要有光去细胞壁的方法：酶解法，所用的酶是纤维素酶和果胶酶人工诱导融合的方法：物理法：离心、振动 电激化学法：用聚乙二醇诱导2.2 动物细胞工程一、 动物细胞培养 概念：就是从动物机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞，然后，放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖。这项技术是动物细胞工程的基础。用于培养的动物细胞和组织大多取自动物胚胎或出生不久的幼龄动物的器官或组织1、原理：细胞增殖2、过程：相关概念l 细胞贴壁：培养时悬液中分散的细胞不久就会贴附在瓶壁上，称为细胞贴壁。l 接触克制：当贴壁细胞分裂生长到表面互相互相接触时，细胞就会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的接触克制。l 原代培养：是指从供体获取组织或细胞后的初次培养。l 传代培养：将原代培养的细胞分离稀释后转入新的培养瓶中继续培养。（一般情况下，传代培养10-50次后，细胞增殖会明显放缓，甚至完全停止，但有少部分细胞克服细胞寿命的自然极限，获得不死性，这些细胞已经发生了突变，正在朝着等同于癌细胞的方向发展。）3、结果：获得细胞群4、传代培养的因素：培养到一定期期细胞密度过大和代谢消耗引起营养枯竭。5、条件：（1）无菌、无毒的环境 培养液和培养用品进行无菌解决 培养液中添加一定量的抗生素 定期更换培养液（2）营养 葡萄糖、氨基酸、维生素、无机盐、微量元素、促生长因子等。 合成培养基中还需加入动物血清、血浆等（3）温度和PH 温度：细胞体外培养的温度一般与动物的体温相近，哺乳动物多以36.50.5为宜。 PH：多数细胞最适PH为7.2-7.4。（4）气体环境 细胞培养所需气体重要是O2和CO2，O2 是细胞代谢所必需的，CO2的重要作用是维持培养液的PH。 进行细胞培养时，通常采用培养皿或松盖培养瓶，将其置于95%空气加5% CO2的混合气体的培养箱 中进行培养。附：培养基的的种类（按来源分）天然培养基：重要取自动物血清、动物组织提取液和鸡胚汁等，具有营养价值高、成分复杂的特点。合成培养基：是人工配制的，具有成分明确、便于控制实验条件的特点。4、应用：（1）许多有重要价值的生物制品，如病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体等，都可以借助动物细胞的大规模培养来生产。（2）作为基因工程的受体细胞。（3）用于检测有毒物质，判断某种物质的毒性。（4）用于医学研究考点细化： 动物细胞培养液的成分有糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素等 动物细胞培养基液体，植物细胞培养基固体，培养的动物细胞通常取自胚胎、幼龄动物的组织器官 动物细胞培养时的气体环境是95%的空气+5%二氧化碳的混合气体，CO2 起到调节 PH值作用 使用胰蛋白酶解决使动物组织分散成单个细胞 动物组织解决使细胞分散后的初次培养称为原代培养 贴满瓶壁的细胞需要重新用胰蛋白酶等解决，然后分瓶继续培养，让细胞继续增殖。这样的培养过程通常被称为传代二、动物体细胞核移植概念：将供体体细胞的细胞核与受体去核卵细胞的细胞质进行人工组合，借助于卵细胞的发育能力，通过培养发育成胚胎，进而形成个体的技术。1、不同细胞全能性的表现限度不同，如：受精卵胚胎干细胞多能干细胞单能干细胞体细胞。2、动物细胞核的移植技术项目细胞核的移植概念运用一个细胞的细胞核（供体核）来取代另一个细胞中的细胞核，形成一个重建的“合子”原理动物体细胞核具有全能性过程结果获得与供体遗传物质基本相同的个体意义有助于遗传疾病的治疗，优良品种的哺育对物种的优化、濒危动物的保护和转基因动物的扩群有重要意义减少畜牧业的成本，缩短育种年限，提高生产效率三、 动物细胞融合与单克隆抗体制备概念：指在一定条件下将2个或多个动物细胞融合为一个细胞的过程。（融合成的细胞称为杂交细胞）1、原理：细胞膜的流动性、细胞增殖2、诱导融合的因素：聚乙二醇（PEG）、灭活的病毒、电激等。3、意义：制备单克隆抗体。4、单克隆抗体的制备：（1）过程（2）重要优点：特异性强、灵敏度高，并可大量制备。拓展：生物导弹中，单抗的作用是导向作用，能将药物定向带到癌细胞所在位置，在原位杀死癌细胞。既不损伤正常细胞，又减少了用药量。【要点名师精解】动物细胞融合与植物体细胞杂交的不同比较项目细胞融合的原理细胞融合的方法诱导手段用法植物体细胞杂交细胞膜的流动性去除细胞壁后诱导原生质体融合离心、电刺激、振动，聚乙二醇等试剂诱导克服了远缘杂交的不亲和性，获得杂种植株动物细胞融合细胞膜的流动性使细胞分散后诱导细胞融合除应用植物细胞杂交手段外，再加灭活的病毒诱导制备单克隆抗体的技术之一考点细化 生产杂交瘤细胞要用B 淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合 注射相应抗原后，从小鼠脾脏中提取出B 淋巴细胞 杂交瘤细胞既能大量增殖，又能产生专一抗体。 制备单克隆抗体过程中需要两次筛选 体外条件下做大规模培养杂交瘤细胞或者注射到小鼠腹腔内增殖，从细胞培养液或者小鼠腹水内就可以提取出大量的单克隆抗体。拓展：杂交瘤细胞融合时，对 B 淋巴细胞为免疫过的B 淋巴细胞一种 B 细胞只能产生一种抗体A 和 B 两种细胞融合，只考虑两两融合，融合方式有 AA、BB、AB 融合三种制备单克隆抗体过程中需要通过两次筛选？第一次筛选出杂交瘤细胞(用选择培养基筛选)(培养基中加入特定化学物质)。第二次筛选出能产生特定抗体的杂交瘤细胞(抗体抗原杂交检测)(培养基中加入特定抗原)。专题3 胚胎工程概念：是指对动物初期胚胎或配子所进行的多种显微操作和技术解决，通过解决后获得的胚胎，还需移植到雌性动物体内产生后代，以满足人类的各种需求。技术：体外受精技术、胚胎移植技术、胚胎分割技术、胚胎干细胞移植技术、胚胎冷冻保存技术、性别控制技术等操作对象：生殖细胞、受精卵和初期胚胎细胞 3.1 动物胚胎发育的基本过程（一）精子的发生1、场合：睾丸2、时间：初情期3、过程：第一阶段：位于曲细精管管壁的精原细胞进行数次有丝分裂，产生多个初级精母细胞。第二阶段：初级精母细胞连续进行两次分裂（即减数分裂，涉及M和M），第一次分裂产生2个次级精母细胞，每个次级精母细胞再分裂一次产生2个精子细胞。第三阶段：圆形的精子细胞通过变形成为精子。（二）卵子的发生1、场合：卵巢2、时间及过程：l 胎儿期动物的胚胎在性别分化后以后，卵原细胞通过有丝分裂不断增长数量，并进一步演变为初级卵母细胞，这时，它被卵泡细胞包围，形成卵泡。l 初情期后减数第一次分裂：是在雌性动物排卵前后完毕的，结果产生1个次级卵母细胞和1个第一极体，进入输卵管，准备与精子受精。减数第二次分裂：是在精子和次级卵母细胞（减中期）结合的过程中形成的，次级卵母细胞经分裂产生1个卵子和1个第二极体。（当在卵细胞膜和透明带的间隙观测到2个极体时，说明卵子已经完毕了受精，这是判断卵子是否受精的重要标志）（三）受精准备阶段1精子获能刚刚排出的精子，不能立即与卵子受精，必须在雌性动物的生殖道（子宫和输卵管）发生相应的生理变化后，才干获得受精的能力，这种现象称为“精子获能”。（苏教版：卵泡液、输卵管分泌物、血清等液体可使精子获能）准备阶段2卵子的准备 卵子在受精前也要经历类似精子获能的过程。动物排出的卵子成熟限度不同，有的也许是次级卵母细胞，有的也许是初级卵母细胞，它们都要在输卵管内进一步成熟，当达成减数第二次分裂中期时，才具有与精子受精的能力。受精阶段（1）场合：输卵管（2）重要过程（哺乳动物）：精子穿越放射冠和透明带，进入卵细胞膜，原核形成和配子结合。获能后的精子与卵子相遇时，一方面发生顶体反映，使顶体内的顶体酶释放出来，以溶解透明带外面的放射冠（由卵泡细胞构成的放射状结构），形成精子穿越的通道。精子穿越透明带后，在接触卵细胞膜的瞬间，会产生阻止后来的精子进入透明带的生理反映，这个反映称作透明带反映。这是防止多精子入卵受精的第一道屏障。精子外膜与卵细胞膜互相融合，精子入卵。精子入卵后，卵黄膜会立即发生一种生理反映，拒绝其他精子再进入卵内，这种生理反映称作卵细胞膜反映。这是防止多精子入卵受精的第二道屏障。精子入卵后的另一个变化，是尾部脱离，并且原有的核膜破裂；随后，精子形成一个新的核膜，最后形成一个比本来精子核还大的雄原核。与此同时，精子入卵后被激活的卵子完毕减数第二次分裂，排出第二极体后，形成雌原核。 雄、雌原核充足发育后，相向移动，彼此接触，两者体积缩小、合并，形成一个含二倍染色体的合子，即受精卵。受精过程至此结束，受精卵的发育也由此开始。注意：1、 一个卵泡中一般能形成一个成熟的卵子。2、排卵是指卵子从卵泡中排出而不是指卵泡从卵巢中排出。3、刚排出的卵子尚未完全成熟，一般仅完毕减数第一次分裂，需要在输卵管内进一步成熟。4、成熟的精子无受精能力，需要在生殖道内获能后方能受精2、 动物排出的卵子并未成熟，只有达成减数第二次分裂中期时，才具有受精能力。3、 受精卵的遗传物质中，核遗传物质一半来自精子，一半来自卵子，细胞质遗传物质几乎全来自卵子。二、哺乳动物胚胎发育的基本过程1、胚胎发育概念：是指受精卵发育成幼体的过程，涉及卵裂、囊胚、原肠胚、胚层分化等重要阶段。（卵裂期细胞数目为32个左右时的胚胎，叫做桑椹胚）2、胚胎发育过程：苏教版：胚胎发育分为3个阶段胚卵期（受精卵第1周末）胚胎期（第2周第8周）胎儿期（第9周始）注意：1、 发育中的细胞分裂均为有丝分裂，原肠胚阶段是个体发育中分化限度最高的阶段，但要注意细胞分化贯穿整个个体发育过程中。 3.3 胚胎干细胞的移植（一）干细胞1、概念：是动物（涉及人）胚胎及某些器官中具有自我复制和多向分化潜能的原始细胞，是重建、修复病损或衰老组织、器官功能的种子细胞。2、类型：专能干细胞：只能分化为一种或功能密切相关的两种细胞。如上皮组织基底层的干细胞，肌肉中的成肌细胞。多能干细胞：能分化为多种细胞或组织。如造血干细胞。全能干细胞：能分化为各种细胞、组织或器官。如胚胎干细胞。（二）胚胎干细胞1、概念：是在人胚胎发育初期的囊胚（受精后约56d）中未分化的细胞。（人教版：是由初期胚胎或原始性腺分离出来的一类细胞，简称ES或EK细胞。）2、特点（人教版）形态上：体积小，细胞核大、核仁明显。功能上：具有发育的全能性。3、胚胎干细胞的分离途径：见下图4、胚胎干细胞的应用（1）用于治疗人类的某些顽症。 人类的某些顽症是由于细胞坏死、退化或功能异常引起的，如帕金森综合症、少年糖尿病和老年痴呆等。运用ES细胞可以被诱导分化形成新的组织细胞的特性，移植ES细胞可使坏死或退化的部位得以修复并恢复正常功能。目前，在动物实验方面，用ES细胞诱导分化出的某些组织细胞已成功治愈糖尿病、肝衰竭等。也许将来当我们身体某一类细胞功能出现异常或退化时，可以通过诱导ES细胞定向分化来及时修补。（2）通过诱导ES细胞体外诱导分化，可以哺育出人造组织器官，解决目前临床上供体器官局限性和器官移植后免疫排斥的问题。（3）ES细胞是研究体外细胞分化的抱负材料 3.4 胚胎工程的应用一、体外受精1、概念：是指哺乳动物的精子和卵子在体外人工控制的环境中完毕受精过程的技术。重要涉及卵母细胞的采集、精子的获能和受精等几个重要环节。 人工模拟体内环境，涉及营养、温度