荧光定量PCR的原理及使用.doc

荧光定量PCR的原理及使用荧光定量PCR(FQ-PCR)是新近出现的一种定量PCR检测方法。其基本特点是：1、用产生荧光信号的指示剂显示扩增产物的量。2、荧光信号通过荧光染料嵌入双链DNA，或双重标记的序列特异性荧光探针或能量信号转移探针等方法获得，大大提高了检测的灵敏度、特异性和精确性。3、动态实时连续荧光检测，免除了标本和产物的污染，且无复杂的产物后续处理过程，高效、快速。下面介绍常用的几种检测方法：1、 双链DNA内插染料某些染料如SYBR Green 能选择性地与双链DNA结合，同时产生强烈荧光。在PCR过程中SYBR Green 可与新合成的双链DNA结合，产生的荧光信号与双链DNA成正比。SYBR Green I荧光染料技术原理SYBR Green I是一种只与DNA双链结合的荧光染料。当它与DNA双链结合时，发出荧光；从DNA双链上释放出来时，荧光信号急剧减弱。因此，在一个体系内，其信号强度代表了双链DNA分子的数量。SYBR Green荧光染料法定量PCR的基本过程是：1、开始反应，当SYBR Green染料与DNA双链结合时发出荧光。2、DNA变性时，SYBR Green染料释放出来，荧光急剧减少。3、在聚合延伸过程中，引物退火并形成PCR产物。4、聚合完成后，SYBR Green染料与双链产物结合，定量PCR系统检测到荧光的净增量加大。SYBR Green I荧光染料与DNA双链的结合SYBR Green I荧光染料能与所有的DNA双链相结合，对DNA模板没有选择性，所以特异性不如TaqMan探针。要想用荧光染料法得到比较好的定量结果，对PCR引物设计的特异性和PCR反应的质量要求就比较高。在此前提下，本法是一种成本低廉的选择。2、 TaqMan探针技术原理TaqMan探针法是高度特异的定量PCR技术，其核心是利用Taq酶的35外切核酸酶活性，切断探针，产生荧光信号。由于探针与模板是特异性结合，所以荧光信号的强弱就代表了模板的数量。在TaqMan探针法的定量PCR反应体系中，包括一对PCR引物和一条探针。探针只与模板特异性地结合，其结合位点在两条引物之间。探针的5端标记有报告基团(Reporter, R)，如FAM、VIC等，3端标记有荧光淬灭基团(Quencher, Q)，如TAMRA等。当探针完整的时候，报告基团所发射的荧光能量被淬灭基团吸收，仪器检测不到信号。随着PCR的进行，Taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其53外切核酸酶活性就会将探针切断，报告基团远离淬灭基团，其能量不能被吸收，即产生荧光信号。所以，每经过一个PCR循环，荧光信号也和目的片段一样，有一个同步指数增长的过程。信号的强度就代表了模板DNA的拷贝数。5，TaqMan探针的荧光信号产生机制根据其3端标记的荧光淬灭基团的不同分为两种：普通的TaqMan探针和TaqMan MGB探针。MGB探针的淬灭基团采用非荧光淬灭基团(Non-Fluorescent Quencher)，本身不产生荧光，可以大大降低本底信号的强度。同时探针上还连接有MGB (Minor Groove Binder)修饰基团，可以将探针的Tm值提高10C左右。因此为了获得同样的Tm值，MGB探针可以比普通TaqMan探针设计得更短，既降低了合成成本，也使得探针设计的成功率大为提高。因为在模板的DNA碱基组成不理想的情况下，短的探针比长的更容易设计。实验证明，TaqMan MGB探针对于富含A/T的模板可以区分得更为理想。 TaqMan MGB探针探针设计一般应符合以下条件：1、探针长度应在2040个碱基左右，以保证结合的特异性。2、G、C碱基含量在40-60，避免单核苷酸序列的重复。3、避免与引物发生杂交或重叠。4、探针与模板结合的稳定程度要大于引物与模板结合的稳定程度，因此探针的Tm值要比引物的Tm值至少高出5。3、 分子信标技术分子信标技术（molecular beacon）也是在同一探针的两末端分别标记荧光分子和淬灭分子，与TaqMan探针不同的是该探针5和3末端自身可形成一个8个碱基左右的发卡结构，此时荧光分子和淬灭分子邻近，因此不会产生荧光。当溶液中有特异模板时，该探针与模板杂交，从而破坏了探针的发卡结构即FRET消失，于是溶液便产生荧光，荧光的强度与溶液中模板的量成正比，因此可用于PCR定量分析。 Ct 值的含义是:每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数。研究表明 ,每个模板的 Ct 值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系 ,起始拷贝数越多 ,Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线 ,因此只要获得未知样品的 Ct 值 ,即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。1、双链DNA内插染料 常用的是SYBR Green I荧光染料，其技术原理：SYBR Green I是一种只与DNA双链结合的荧光染料。当它与DNA双链结合时，发出荧光；从DNA双链上释放出来时，荧光信号急剧减弱。因此，在一个体系内，其信号强度代表了双链DNA分子的数量。SYBR Green荧光染料法定量PCR的基本过程是：1、开始反应，当SYBR Green染料与DNA双链结合时发出荧光。2、DNA变性时，SYBR Green染料释放出来，荧光急剧减少。3、在聚合延伸过程中，引物退火并形成PCR产物。4、聚合完成后，SYBR Green染料与双链产物结合，定量PCR系统检测到荧光的净增量加大。荧光染料检测法一般主要是利用荧光染料(如SYBR Green I)与双链DNA分子结合发光的特性来指示扩增产物的增加，优点是：无需另外设计荧光探针，无需特别优化条件，简便易行，成本较低，能适用于任何一款定量PCR仪。荧光染料法实质上是常规的PCR反应中添加了荧光染料，借助染料和双链DNA的结合所发出的荧光实时监控反应的进程。由于不需要设计序列特异性探针和优化反应条件，价格低廉，通用性强，而且荧光染料法可用于任何一种型号的定量PCR仪，因而同样得到广泛采用。在PCR反应体系中，加入过量SYBR Green I荧光染料，SYBR荧光染料掺入DNA双链后荧光信号显著增强；当DNA变性时SYBR Green I染料释放出来，荧光急剧减少；随后在聚合延伸过程中引物退火并形成PCR产物，SYBR Green染料与双链产物结合，经检测获得荧光的净增量。荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。荧光染料可以在反应末尾对扩增产物进行溶解，称为溶解曲线分析。在溶解曲线分析过程中，随着温度从低于产物溶解点缓慢升到高于产物溶解点，定量PCR仪连续监测每个样品的荧光值。基于产物长度和G/C含量的不同，扩增产物会在不同的温度点解链。随着产物的解链就可以看到荧光值的降低并被仪器所测量。对溶解曲线进行微分可以计算出溶解峰。溶解峰可以反映反应中扩增到的产物，因此用溶解曲线数据就可以进行定量检测了。将强毒株H2的RNA模板做10倍倍比稀释后，用紫外分光光度计测定其浓度，然后按下面的公式转换成模板的拷贝数：拷贝数=NDV模板浓度阿氏常数(一个碱基的平均分子量NDV模板的总长度)其中，阿氏常数为6.021023，一个碱基的平均分子量为324.5，NDV模板的总长度为15 186 bp，标准品的RNA模板分别进行101 、102 、103 、104、105、106、107稀释后，用紫外分光光度计测定病毒RNA模板的OD值，分别计算其浓度，用于制作标准曲线，同时做一个阴性对照。