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诱导多能干细胞研究进展概述

李雪犁
摘 要 诱导多能干细胞（Induced pluripotent stem cell， iPSC）由于其巨大的研究价值和应用潜力迅速成为近年来全球干细胞领域关注的焦点，许多国家的政府、研究机构对其加大投入，并取得了巨大进展。本文将对iPSC技术中体细胞的选择、重编程诱导因子的筛选、介导载体、诱导效率、临床学的应用以及研究中存在的问题几个方面做简要综述。
关键词 诱导多能干细胞 重编程 诱导效率 载体 再生医学
：Q813 ：A DOI：10.16400/ki.kjdkz.2016.09.078
Summary of Research Progress on Induced Pluripotent Stem Cells
LI Xueli
（Patent Examination Cooperation Hubei Center of the Patent Office， SIPO， Wuhan， Hubei 430070）
Abstract Induced pluripotent stem cells due to its great research value and application potential quickly become in recent years the world the focus of attention in the field of cell， the government， research institutes in many countries to increase investment， and have made tremendous progress. This article will make a brief summary on the selection of somatic cells in iPSC technology， the selection of the induced factors of reprogramming， the vector， the induction efficiency， the application of clinical study and the problems in the research.
Key words induced pluripotent stem cells； reprogramming； induced efficiency； carrier； regenerative medicine
0 引言
诱导多能干细胞（Induced pluripotent stem cell， iPSC），是将几种因子的基因引入到成熟体细胞中，并重编程为与胚胎干细胞（embryonic stem cell，ESC）具有相似特征的一种干细胞。①iPSC于2006年由日本京都大学山中伸弥（Yamanaka S）研究团队首次获得。以此为基础，Yamanaka和Thomason（美国威斯康星大学麦迪逊分校）研究团队于2007年成功获得人类iPSC。正是iPSC与ESC在形态、基因表达及多能细胞特异基因的表观遗传学性状上都表现出了极高的相似性，因此研究成果一经报道便迅速引起了干细胞乃至生物医学领域的广泛关注。一向对人类胚胎干细胞领域研究持有争议态度的美国政府，在该研究成果发布后的几年中，也逐渐放开了对干细胞领域研究的相关政策，认为这才是干细胞研究的正道。
iPSC技术被认为是生命科学和再生医学研究领域的一场革命，在其诞生的十年时间里就被广泛研究并获得了快速的发展。世界范围内许多实验室开始探索其相关机制及技术的改良方法，研究主要集中在体细胞和重编程因子的选择、重编程因子介导载体体系的建立、诱导转化率的提升以及疾病特异性的iPSC模型的建立等方面。
1 体细胞的选择
在体细胞选择方面，研究发现，除了成纤维细胞，小鼠的肝细胞、胃细胞、B淋巴细胞、神经干细胞，以及人类的骨髓间充质干细胞、角化细胞、外周血细胞、皮肤成纤维细胞、胚胎成纤维细胞、脂肪干细胞等都可产生iPSC。②而有丝分裂后的神经元和终末分化的淋巴细胞也可诱导形成iPSC。③由此可见，似乎所有的体细胞都具备经过重编程而被诱导成为iPSC的潜能，但是不同细胞类型对产生iPSC的效率、诱导因子作用效果和获得的iPSC的安全性具有很大的差别。④例如，人类角质细胞比成纤维细胞重编程的效率高；小鼠胃细胞与肝细胞在激活ESC特异性Fbx15基因时，比成纤维细胞效率高，且整合的病毒少；不同类型的体细胞（小鼠尾部皮肤细胞、胃细胞以及胚胎皮肤细胞）诱导产生的iPSC会导致小鼠体内肿瘤出现概率的不同。
2 重编程因子的选择
尽管Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4是最先发现的可以将成纤维细胞重编程转化为iPSC的4种重编程因子，但是随着研究的深入，发现在一定情况下，一些因子的调整或替代，同样也能获得良好的诱导效果，⑤如Oct4、Sox2、Nanog、Lin28也可以将人类成纤维细胞重编程转化为iPSC；Oct4和Sox2两种因子就能将人脐血干细胞重编转化为iPSC；人成纤维细胞可以内源性表达c-Myc和Klf4，在重编程转化过程中，没有外源性c-Myc的参与也能成功获得iPSC；对于内源性高表达Sox2和c-Myc的神经干细胞，仅用Oct4即可重编转化为iPSC。这些研究结果说明成熟体细胞的重编程存在多个信号途径。
3 重编程因子的介导载体
慢病毒和逆转录病毒是iPSC技术研究初始阶段用于介导重编程因子的两种主要载体。但随着研究的逐渐深入，发现慢病毒载体和逆转录病毒载体可能会造成外援致瘤因子整合进入细胞基因组内，引起插入突变。病毒基因的激活已经导致由iPSC分化产生的小鼠体内产生了肿瘤，这一结果无疑给iPSC在临床转化及应用方面引入了不小的风险，甚至会导致不良后果。
正是因为发现了存在载体在使用过程中、或是诱导基因本身会引发致瘤的问题，很多研究小组致力于寻找方法能够产生非整合的iPSC来减少致瘤风险。这些方法包括腺病毒、仙台病毒、质粒、合成RNA、蛋白质、piggyBac转座子和小分子诱导重编程等，并且这些方法已经在实验室水平得到实现。⑤⑥虽然现阶段有关安全介导载体体系建立的研究还不太成熟，但相信随着研究的逐步深入，科学家们终将会寻找到最安全、也最适合用于人类iPSC的诱导方法，从而将风险降到最低。
4 iPSC的诱导转化率
虽然iPSC建系可重复，但效率很低，并且在提高iPSC安全性的同时会伴随着重编程效率的降低。因此，提高iPSC重编程效率也一直是该领域研究的重点。虽然iPSC形成的分子机制不是十分清楚，但是研究发现很多因素，如细胞类型、重编程因子、载体，甚至培养条件和微环境都与iPSC的诱导转化率相关。④⑤如脂肪干细胞以Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4因子重新编程的效率达到0.2%，且是相同条件下皮肤成纤维细胞的20倍；利用逆转录病毒作为载体诱导人幼年角质形成细胞重编程的效率要达到成纤维细胞的100倍；缺氧微环境培养iPSC，其生成效率可提高至原来的2.5-4.2倍。
5 iPSC的应用
iPSC对医学领域最直接的贡献在于为疾病的研究提供了体外模型，如，Rashid等⑦成功利用肝病患者的皮肤细胞培育出与病人肝脏细胞高度相似细胞；来自iPSC的心肌细胞和肝细胞，可以替代现有的方法用于毒理学试验，这些是其它细胞所无法比拟的。一方面，利用从病患身上产生的iPSC，可以简化建立疾病模型的过程，提高模型仿真性，更有利于了解该种疾病的发病机理；另一方面，iPSC可以为新药的开发提供模型，用于测试候选药物的疗效、毒性，以及筛选新的药物治疗方法。⑧
iPSC技术为未来使用干细胞研究及治疗各种疾病开辟了新的研究途径，如何将iPSC在体外定向分化为能模拟体内情况的功能性细胞，以及如何获得足够量的靶细胞用于下游的应用将成为今后研究的重点。
6 iPSC研究存在的问题
虽然iPSC技术发展迅速，有着诱人的应用前景，但对该领域的研究总体还处于最初的探索阶段，并且在该技术发展的过程中还存在诸多的问题，这些都使得iPSC技术应用在临床方面还具有很长的距离。
（1）iPSC与ESC有差异吗？iPSC存在的最重要的问题之一就是它与ESC是否真正相似。虽然有部分结果显示它们存在差异，但大部分实验还是表明iPSC与ESC在各方面都具有惊人的相似性。显示两者具有差异性的研究结果可能是由于不同实验室所采用的相关实验条件的不同所造成的。同时山中伸弥认为“ESC不应当成为判断iPSC特性的金标准，研究者应更加关注iPSC自身的性质”。
（2）iPSC产生的效率问题。iPSC产生的效率较低。这与基因导入的方式、整合位点、表观遗传学、转录因子表达的数量和模式等多种因素有关。如：Oct-4在胃或肠内的表达阻止了原始细胞的分化。同时，由于来源于多能干细胞的组织在移植后的存活率很低，因此iPSC在临床应用上也将会面临移植后要求组织存活较长时间的问题。
（3）安全问题。在iPSC技术中，用病毒作为载体可能会导致外援基因整合进入细胞基因组，致使一些癌基因的激活或某些重要基因的表达受阻；并且重编程因子c-Myc和Klf4属于致瘤因子，因此这些因素都将有可能引起基因的突变，从而产生具有高致瘤性的iPSC。这些问题将成为iPSC科学研究和临床应用的最大障碍。
（4）机制问题。几个转录因子如何完成细胞由分化状态逆转为多能性状态？如何从根本上解决致瘤性的问题？为何iPSC诱导效率低下，分化能力存在差异？这些问题都需要通过对体细胞重编程的分子机制、分化机制以及调控机制等进行深入的研究来解答。
注释
① Yamanaka S.诱导多能干细胞（iPSCs）：过去、现在和未来.朱丽华，译.中国细胞生物学学报，2012.34（10）：1055-1062.
②⑧Kiskinis E，Eggan K. Progress toward the clinical application of patient-specific pluripotent stem cells. Journal of Clinical Investigation，2010.120（1）：51-59.
③ Kim J， Lengner CJ， Kirak O， et al. Reprogramming of postnatal neurons into induced pluripotent stem cells by defined factors. Stem Cells，2011.29（6）：992-1000.
④ 李鑫，王加强，周琪.体细胞重编程研究进展.中国科学：生命科学，2016.46（1）：4-15.
⑤ Gonzalez F， Boue S， Belmonte， JCI. Methods for making induced pluripotent stem cells： reprogramming a la carte. Nature Reviews Genetics，2011.12（4）：231-242.
⑥ Ye JK， Hong JY， Ye FS. Reprogramming rat embryonic fibroblasts into induced pluripotent stem cells using transposon vectors and their chondrogenic differentiation in vitro. Molecular Medicine Reports， 2015.11（2）：989-994.
⑦ Rashid ST， Corbineau S， Hannan N， et al. Modeling inherited metabolic disorders of the liver using human induced pluripotent stem cells. J Clin Invest， 2010.120（9）：3127-3136.

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