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桑黄免疫调节作用的动物实验研究

【摘要】目的：研究了桑黄对小鼠的免疫调节作用。方法：测定小鼠的NK细胞活性、免疫器官脏器/体重比值、迟发型变态反应（DTH）、ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化能力、抗体生成细胞数、半数溶血值（HC50）、单核—巨噬细胞碳廓清实验吞噬指数、巨噬细胞吞噬鸡红细胞吞噬率指标。结果：各剂量组能提高ConA诱导脾淋巴细胞增殖、抗体生成细胞检测、小鼠碳廓清实验吞噬指数、NK细胞活性。中高剂量组能提高DNFB诱导DTH、小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞吞噬指数；高剂量组能提高半数溶血值。结论：桑黄具有增强免疫力的功能。
关鍵词：桑黄；免疫调节
StudiesontheimmunizationregulatingfunctionofInonotusbaumii
[Abstract]Objective：TostudytheimmunizationregulatingfunctionofInonotusbaumii．Methods：TheactivityofNKcell，theratiooforgantobodyofthemice，delayed-typehypersensitivity（DTH），lymphocytetransformationinducedbyConA，thequantityofantibodygeneratingcells，thephagocytosisindexofmonocytemacrophage，phagocyticpercentofmacrophagecock’sRBCweremeasured．Results：0.5g/Kg.bw、1g/Kg.bw、1.5g/Kg.bwcouldsignificantlyincreasetheactivityofNKcell，thequantityofantibodygeneratingcells，thephagocytosisindexofmonocytemacrophage，andlymphocytetransformationinducedbyConA..1g/Kg.bw、1.5g/Kg.bwcouldsignificantlyincreasedelayed-typehypersensitivity（DTH），phagocyticpercentofmacrophagecock’sRBC.1.5g/Kg.bwcouldsignificantlyincreasehalfvalueofhemolysin（HC50）inserum.Conclusion：Inonotusbaumiihastheimmunizationregulatingfunction.
Keywords：Inonotusbaumii；regulatingimmunization
桑黄属于多孔菌科、木层孔菌属真菌，又叫鲍氏层孔菌，是一种多年生、黄褐色的珍稀药用真菌，药用最早收载于李时珍的《本草纲目》中。研究表明，桑黄子实体具有抗肿瘤、增强免疫、降血糖、抗氧化、抗诱变、抗突变等药理作用。据《药性论》记载：桑黄性甘平、无毒、治血崩、血淋、脱肛泻血、带下、闭经。近年来，随着桑黄提取物具有增强免疫力、抗肿瘤活性的报道，桑黄的用量日益加大，野生桑黄资源的。近年来我国桑黄的人工栽培技术已经成熟，并已大量供应药材市场。
临床研究证实，桑黄能够提高人体的免疫力，减轻抗癌剂的副作用，所以可用来辅助肿瘤病人的放疗和化疗。多糖是桑黄的主要活性成分之一，目前对桑黄增强免疫功能的研究主要集中在多糖提取技术、分离纯化及其免疫功能方面。近来研究表明，桑黄的功效成分除了多糖外，还有桑黄黄酮、三萜类化合物、吡喃酮类化合物、甾体、桑黄素等多种[1-4]。因此，有必要采用桑黄子实体全粉进行药理研究，以比较全面探讨其增加免疫力的作用和用量。
目前，国内外对桑黄子实体的免疫调节作用研究都是采用多糖进行的[5-7]，采用桑黄子实体全粉进行体内动物免疫功能试验的报道不多。本文采用了的人工栽培的桑黄子实体粉，对其在调节免疫作用方面进行了研究，现将结果报告如下。
1.材料和方法
1.1桑黄样品制备
桑黄子实体经70℃80℃热风烘干机烘干，粉碎为微粉。样品密封置通风、干燥处保存，保质期24个月，成人推荐剂量3g/人/日。
1.2实验动物、剂量与分组
成人推荐量为每日3.0g/d。按成人60kg体重计，即0.05g/kg.bw。试验设三个剂量组：10倍人体摄入量（0.5g/Kg.bw）组、20倍人体摄入量（1.0g/Kg.bw）组、30倍人体摄入量（1.50g/Kg.bw）组和对照组。小鼠灌胃体积为0.2ml/10g.bw。对照组予以等体积的水，分别给予受试动物灌胃，每天一次，灌胃体积为0.1ml／10g•bw，连续30天。采用SPF级昆明种雌性小鼠200只，体重为18g～22g，由长沙市天勤生物技术有限公司提供，实验动物生产许可证号为SCXK（湘）2009—0012。对小鼠NK细胞活性的影响、碳廓清实验、进行脏体比值测定、小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验、迟发型变态反应实验、半数溶血值（HC50）的测定和抗体生成细胞数的测定、ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化实验测定。
1.3实验环境条件：温度23℃～24℃，湿度50％～56％，实验动物使用许可证号SYXK（湘）2010-0010。
1.4实验方法：根据国家《保健食品功能学评价程序和检验方法》（2003版）进行。
1.5主要仪器与试剂：5mm直径打孔器、显微镜、微量血凝试验板、离心机、酶标仪、96孔培养板、5%CO2培养箱、200目筛网注射用墨汁、刀豆蛋白A（ConA）、MTT、DNFB、丙酮、麻油、脱毛剂、SRBC、生理盐水、鸡红细胞、甲醇、Giemsa染液、YAC-1细胞、Hanks液（pH7.2-7.4）、RPMI1640完全培养液、乳酸锂、碘硝基氯化四氮唑（INT）、吩嗪二甲酯硫酸盐（PMS）、NAD、Tris-HCl缓冲液（pH8.2）、1%NP40、台盼兰、1mol/L盐酸等。
2.结果
2．1桑黄对小鼠体重和脏器/体重比的影响
桑黄三个剂量组均未见对动物体重及体重增长有明显的影响。桑黄对小鼠脏器/体重比的影响结果见表1。
注：*与对照组比较，P<0.05
经方差分析，三个剂量组与对照组比较，P<0.05，有显著性差异。
3.结果与讨论
桑黄的药理研究起源于日本，日本学者TetsuroIkekawa等发现其抗癌功能。桑黄野生子实体的提取物对小鼠肉瘤S180的抑制率为96.7%；桑黄菌人工培养菌丝提取物小鼠肉瘤S180同样具有明显的抑制作用[8]；并且桑黄菌对肿瘤转移也具有抑制作用[9]。
机体抗肿瘤免疫包括体液免疫和细胞免疫，但以细胞免疫为主，主要为T淋巴细胞、NK细胞和巨噬细胞等介导免疫反应，这其中T细胞介导的细胞免疫反应作用最为重要。T淋巴细胞具有广泛的免疫功能，在抗肿瘤的免疫应答过程中处于关键地位，如辅助B细胞使之发育成为产生抗体的细胞、增强单核-巨噬细胞的杀伤活性、抑制某些类型的免疫反应、直接杀伤靶细胞以及激发炎症反应等。本研究桑黄三个剂量组对小鼠细胞免疫功能实验表明，在脾淋巴细胞转化实验中，桑黄人体推荐量的三个剂量组OD差值显著高于对照组，呈阳性结果；迟发型变态反应实验表明，耳肿程度与对照组比较，20、30倍剂量组差异极显著，呈阳性结果。小鼠体液免疫功能实验表明，在抗体生成细胞实验中，与对照组相比，桑黄三个剂量组脾细胞溶血空斑数显著升高，呈阳性结果；小鼠半数溶血值测定表明，30倍剂量组的HC50值与对照组比较有显著差异，呈阳性结果。小鼠单核-巨噬细胞功能实验结果表明，在小鼠碳廓清实验中，桑黄三个剂量组的吞噬指数显著高于对照组，呈阳性结果；小鼠巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验表明，20、30倍剂量组的吞噬指数显著高于对照组，呈阳性结果。NK细胞活性测定实验表明，与对照组比较，桑黄三个剂量组NK细胞的活性显著升高，呈阳性结果。由以上结果说明，每天3g桑黄子实体能增强机体的免疫功能。桑黄抗肿瘤作用与上述增强免疫功能相关。
国内外对桑黄子实体的免疫调节作用研究都是采用多糖进行的。傅海庆[10]探讨了由桑黄液体发酵液提取桑黄多糖制成的口服液对小鼠免疫功能的影响。结果表明，与对照组相比，桑黄口服液高剂量组可见桑黄口服液具有提高网状内皮系统功能的作用，可显著增强免疫功能。结果与本研究报告一致。
李婷婷[5]以桑黄子实体为材料，比较了普通粉碎和超微粉碎对桑黄子实体多糖提取及其理化性质和刺激巨噬细胞活性的影响。结果表明，相对于传统粉碎方式，超微粉碎可以显著提高桑黄子实体多糖的得率，但超微粉碎后50％和70％乙醇沉淀多糖组分活性低于普通粉碎后所得的相应组分。说明桑黄前处理方式和提取工艺对免疫功能有一定的影响，在无法确定多糖最佳提取方式情况下，采用全粉方式服用可能效果更好。
参考文献：
[1]张维博，王家国，李正阔，杨丽群，秦俭，向仲怀，崔红娟.药用真菌桑黄的研究进展[J].中国中药杂志，2014，15：2838-2845.
[2]闫国卿.中药桑黄和鼠妇化学成分研究[D].安徽大学，2014.
[3]张维博，王家国，李正阔，杨丽群，秦俭，向仲怀，崔红娟.药用真菌桑黄的研究进展[J].中国中药杂志，2014，15：2838-2845.
[4]刘凡，庞道睿，邹宇晓，廖森泰，肖更生.桑黄总黄酮含量及其体外抗氧化活性研究[J].中国食用菌，2014，02：47-49+56.
[5]李婷婷，杨焱，刘艳芳，邵倩，张劲松，鲍大鹏.超微粉碎对桑黄子实体粗多糖理化性质和刺激巨噬细胞活性的影响[J].天然产物研究与开发，2015，27（2）：333-337
[6]谢丽源，张勇，彭卫红，甘炳成.桑黄胞内多糖免疫及抗氧化活性研究.食品科学.2011.276-281
[7]沈学香，杨焱，张劲松.桑黄多糖的分离纯化及体外免疫活性的研究[J].食用菌报，2008，15（2）：31-36
[8]IkekawaT，NakanishiM，UeharaN，etal.Antitumoractionofsomebasidiomycetes，especiallyPhellinuslinteus.Gann，1968；59：155-177
[9]HanSB，LeeCW.TheinhibitoryeffectofpolysaccharidesisolatedfromPhellinusLinteusontumorgrowthandmetastasis.Immunopharmacology，1999；41：157~164
[10]傅海庆，陈绍军，陈汉清，林河通.桑黄口服液对小鼠免疫功能的影响.福建农林大学学报：自然科学版，2006，35（5）：538-541

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