基于纳米技术的肺癌早期检测研究.doc

项目名称：基于纳米技术肺癌初期检测研究基于纳米技术肺癌初期检测研究 首席科学家：赵建龙赵建龙 中国科学院上海微系统与信息中国科学院上海微系统与信息技术研究所技术研究所 起止年限：.1.1 至至.8.8 依托部门：中国科学院中国科学院 上海市科委上海市科委 一、关键科学问题及研究内容 1、拟处理关键科学问题 本项目围绕肺癌初期检测重大需求，采用多学科交叉、综合研究措施，重点处理纳米材料定向偶联和有序组装机理、低丰度样品富集及微弱信号检测措施以及肺癌初期预警、筛查和检测新模式等三个方面关键科学问题：（1）纳米材料定向偶联和有序组装机理）纳米材料定向偶联和有序组装机理 为了获得性能良好生物功能化探针，生物分子在微纳米界面上组装后应当保持原有生物活性，具有很好生物相容性，这就需要研究纳米构造与生物分子定向偶联和有序组装机理。定向偶联机理问题：怎样实现生物探针在微纳米界面上定向分布，使生物分子活性部位背对界面，使其与靶分子结合时空间位阻最小。有序组装机理问题：怎样实现生物探针在微纳米界面上均一分布，不重叠，不堆积，展现为功能化生物分子单层，使探针发挥最佳靶分子性能。（2）低丰度生物样本富集及微弱信号检测措施）低丰度生物样本富集及微弱信号检测措施 初期肺癌病人肿瘤标志物浓度很低，由于检测敏捷度低而出现假阴性。此外，生物标本（如血清等）中具有大量内源性分子和代谢产物，一般这些物质浓度远高于肿瘤标志物浓度，是重要干扰原因，由于标本成分复杂产生干扰而出现假阳性。本项目将研究肺癌标志物与纳米材料互相作用机理以及在微流控芯片中运动特性，设计对应功能纳米器件，分离标本中干扰组份，保留待测分子及其活性，建立微量肿瘤标志物高效分离提取富集措施和体系，以到达肿瘤标志物高敏捷度检测。（3）肺癌初期预警、筛查和检测新模式）肺癌初期预警、筛查和检测新模式 针对没有适合中国人群肺癌初期检测敏感性和特异性问题，联合检测多种肺癌标志物，运用高敏捷、高通量纳米检测技术和生物信息学分析措施，建立肺癌初期检测鉴别模型，同步提高检测敏感度和特异性，建立与初期肺癌明显有关血清蛋白和核酸标志物谱，并在高危人群中进行验证，建立适合我国肺癌高危人群患者肺癌预警、筛查和检测新模式。2、重要研究内容 围绕肺癌初期检测重大需求，针对有关三个关键科学问题展开研究，然后运用临床标本对基于纳米技术肺癌初期检测新措施进行医学验证，与影像学、痰细胞学措施进行对照研究。本项目重要开展如下四个方面研究：功能纳米材料制备和表面修饰、纳米探针设计和构筑、纳米生物器件研制以及临床验证等研究。1.1 功能纳米材料制备和表面修饰 功能纳米材料制备重要包括制备荧光量子点材料，用于构建多种肺癌标志物同步检测纳米器件；包括制备表面等离子体共振金纳米构造和硅纳米线材料，分别用于构建表面等离子体共振传感器和硅纳米线传感器，用于肺癌标志物超高敏捷检测。（1）荧光量子点制备和表面修饰）荧光量子点制备和表面修饰 运用微波辅助水相量子点制备技术，合成出荧光产率高、光稳定性强、粒径分布窄多种构造 II-VI 族量子点。选用合适化学或生物材料修饰量子点，使修饰后量子点既保持原有光学特性又具有良好生物相容性。研究量子点尺寸及表面构成对其物理化学性质尤其是光学性质影响。（2）表面等离子体共振金纳米构）表面等离子体共振金纳米构造制备和表面修饰造制备和表面修饰 研究不一样表面等离子体共振金纳米构造如金纳米壳、金纳米星等制备措施。研究在 SiO2胶体晶膜微球表面金沉积机理以及金纳米壳层复合构造制备措施。研究金纳米壳层构造厚度和表面裂纹以及金纳米星枝角等控制措施，及其对局域表面等离子体共振光谱（LSPR）及表面增强拉曼光谱(SERS)信号影响。（3）硅纳米线制备和表面修饰）硅纳米线制备和表面修饰 研究光、电、温等影响原因对纳米硅材料腐蚀作用机理，提高纳米硅材料自停止腐蚀精度，发展硅纳米线阵列制造新机理和新措施；研究掩模、腐蚀、保护等关键工艺互相制约关系，提高硅纳米线尺寸和表面粗糙度控制精度，研究不一样基团在硅纳米线表面硅烷化修饰技术。1.2 用于肺癌初期检测纳米探针设计和构筑 纳米探针设计和构筑重要是为了获得有良好生物活性和生物相容性生物功能化探针，重要包括生物分子在荧光量子点、表面等离子体共振金纳米构造以及硅纳米线表面定向偶联和有序组装。（1）量子点与生物分子偶联和有序组装）量子点与生物分子偶联和有序组装 研究量子点与具有特异选择或识别功能生物分子定向偶联和有序组装；重点发展针对肿瘤初期检测具有超敏捷度和特异识别能力“纳米材料-生物分子”纳米生物复合探针；研究这些纳米生物探针同待测分子之间互相作用及其识别能力。研究量子点与待检测标志物有特异识别酶、抗体、基因等生物分子有序自组装（非简朴物理吸附和无序偶联），除运用分子间作用力、静电作用实现量子点与生物分子自组装外，重点发展基于特定生物分子介导生物分子有序组装措施，即通过表面功能基团或特定生物分子介导，实现生物分子在量子点表面定向偶联或有序组装。研究有效控制量子点标识数量和标识位置措施，获得既具有高标识效率又保持高活性“纳米材料生物分子”生物复合探针。研究量子点与不一样生物分子偶联方式，建立一套温和、有效生物标识措施，在此基础上建立不一样功能团量子点与抗体、酶和 DNA 等多种生物分子偶联措施及其纯化措施，并建立对应规范操作指南。（2）生物分子在表面等离子体共振金纳米构造上可控组装）生物分子在表面等离子体共振金纳米构造上可控组装 制备满足生物传感需要高质量聚苯乙烯有序多孔金纳米构造基底，研究试验条件对其 LSPR 和 SERS 性质影响；研究在金纳米构造基底多孔层表面均匀、高效地固定抗体及配基分子措施，以提高固定效率和固定化抗体及配基分子稳定性；运用 LSPR 位移检测抗原-抗体、配基-生物大分子等结合过程及结合容量等，得到生物分子互相作用原则曲线、结合常数及检测敏捷度等，研究非特异性吸附对分析影响；运用基于 SERS 分子独特振动能级和对应拉曼指纹图谱检测分子信息，并比较两种检测措施成果。（3）生物分子在硅基纳米界面上可控组装）生物分子在硅基纳米界面上可控组装 选择生物识别探针分子（抗体、核酸等），研究其通过不一样自身携带基团或衍生基团在硅基纳米界面上定位组装条件；研究其在界面上有序性、方向性和三维形态，探索多种不一样性质生物探针在特定环境中识别行为和捕捉行为；研究通过共组装技术和界面封闭技术减少探针分子与硅基纳米界面之间非特异性结合，优化硅基纳米生物界面后处理条件，提高其稳定性和耐受性；最终获取生物识别探针在一维纳米材料界面上实现可控组装若干共性条件。1.3 纳米生物器件研制 首先针对肺癌初期检测，选择合适联合检测肺癌标志物；然后构建微流控芯片用于样品中肿瘤标志物富集，同步消除基质效应；最终出检测敏捷度高、信噪比、反复性、稳定性和信号均一性等性能良好纳米生物器件，重要包括基于量子点纳米生物器件、表面等离子体共振传感器和硅纳米线传感器。（1）肺癌标志物选择肺癌标志物选择 根据前期研究成果，综合文献报道，针对肺癌选择癌胚抗原(CEA)、细胞角蛋白 21-1 片段(CYFRA 21-1)、鳞状上皮细胞癌抗原（SCC）、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、组织多肽抗原(TPA)、细胞维生素 A 结合蛋白(RBP)，1-抗胰蛋白酶(1-AT)、血清铁蛋白（FERRI）以及核酸标志物 miRNA（目前已在肺癌患者中检测到）:let-7、miR-29、miR-205,miR-99 b、miR-203、miR-202、miR-102 和miR-2042prec 作为初期肺癌联合检测标志物。（2）微流控分析芯片分离、富集系统构建微流控分析芯片分离、富集系统构建 针对临床检查待测样品（血清标本）具有干扰成分多、肺癌标志物含量低等特性。运用微流控芯片和纳米磁珠，研究实现微量肺癌标志物有效纯化和富集措施，重要研究纳米磁珠与肺癌标志物互相作用，以及微流控技术对结合纳米磁珠定向富集特性。设计微流控芯片各个功能单元，包括样品采集、富集、反应和分离等，同步处理微流控芯片稳定性和反复性问题，最终可以分离临床标本中干扰组份，保留待测分子及其活性。（3）基于量子点多种肺癌标志物联合检测生物器件构建）基于量子点多种肺癌标志物联合检测生物器件构建 为了到达多种肺癌标志物同步检测目，拟采用夹心式免疫分析措施同步检测多种肺癌标志物。将捕捉探针与纳米磁珠结合，将信号探针与荧光量子结合，固定有捕捉探针纳米磁珠和固定有信号探针量子点与待测样品中肺癌标志物夹心结合之后，运用微磁场实现纳米磁珠定向分离和富集，然后通过检测量子点信号颜色和强度来确定肺癌标志物种类和丰度。光学检测系统基于超光谱成像原理构建，然后通过自主开发检测分析软件解析出荧光量子点标识种类和待检测肿瘤标志物分子信号强度对应关系，完毕对检测成果分析。（4）表面等离子体共振传感器）表面等离子体共振传感器 选择经典肺癌标志物作为经典检测体系，硕士物分子等在金纳米构造基底多孔层中固定以及抗原-抗体等生物分子互相作用，探索运用LSPR和SERS两种互补模式检测样品，在同一基底上实现LSPR与SERS分析技术组合，建立基于该基底生物纳米传感检测新措施，用于单个肺癌标志物生物分子检测。（5）硅纳米线传感器）硅纳米线传感器 选择多种肺癌标志物作为模式靶，研究组装高度有序功能化硅纳米线捕捉元件措施，研究影响硅纳米线和生物组装效果关键原因；研究传感器可靠性和稳定性封装技术，完毕基于硅纳米线生物传感器组装，用于肺癌标志物（蛋白标志物或核酸标志物）超高敏捷检测，可检测单个肺癌标志物分子。1.4 临床验证 临床验证重要包括大样本回忆性研究和前瞻性研究以及生物信息学分析。（1）回忆性研究回忆性研究 本项目拟开展临床验证重要运用 1500 例以上肺癌病人（包括 Ia-Ib 期，肿瘤直径不不小于 3cm）血清、组织标本和癌旁标本以及健康对照血样，比较新技术与常规诊断措施对肿瘤标志物检测吻合度，比较新技术检出率与低剂量螺旋 CT、常规血清肿瘤标志物、痰脱落细胞检测等措施对初期肺癌检测敏感度和特异性。通过有关性分析，确定不一样病理类型、不一样分化程度和不一样分期（TNM）肺癌特性性 mRNA 谱，通过 ROC 曲线分析确定几种标志物联合检测提高肺癌初期诊断敏感性和特异性，建立肿瘤标志物丰度和肿瘤发病进程鉴别模型（确立“正常值范围”），同步运用肿瘤发生前后病人自身对照血样进行模型修正和校验。（2）前前瞻性研究瞻性研究 运用建立鉴别模型，对 3000 例肿瘤高危人群进行筛查，分别采用新技术和常规诊断措施，如低剂量螺旋 CT、痰细胞学和常规血清肿瘤标志物检测对受试人群进行检测，比较新技术与常规诊断措施之间吻合度。对于新技术检测阳性健康人随访 24 月，观测受试者预后，比较检测成果与临床预后之间有关性，以评价新技术用于肺癌初期检测可行性。初步推测在 3000 个高危人群中待随访结束时可确诊肺癌 50-60 例。（3）建立在临床标本生物信息学分析措施）建立在临床标本生物信息学分析措施 在大量样本基础上，将肺癌关联标志物随机分群，运用生物信息学分析措施，找到哪些标志物群可以集中体目前某个标志物上，获得最优肺癌初期检测标志物组合，同步具有高敏感性和特异性。二、预期目 1、项目总体目 本项目面向肺癌初期检测重大需求，研究纳米材料制备和表面修饰、生物分子偶联、多种肺癌标志物联合检测以及高敏捷度检测器件构建，意在有关基础科学研究上获得突破，获得源头创新。首先探明纳米材料或纳米构造与具有特异选择或识别功能生物分子互相作用机制，到达生物分子定向偶联和有序组装，在此基础上，研制出用于多种肺癌标志物高敏捷联合检测纳米量子点生物器件。同步，研制出基于金纳米构造局域表面等离子共振和拉曼光谱传感器和硅纳米线传感器，作为量子点生物器件辅助措施，用于肺癌标志物超高敏捷检测。通过大样本临床验证，探明肺癌标志物与肿瘤发病进程关系，纳米生物器件检测敏感性和特异性均高于 85%，最终在肺癌高危人群初期检测中得到示范应用，从而指导肺癌早发现、早治疗，提高病人存活率，减小病人经济损失，为人民健康、国民经济建设、社会友好发展作出奉献。同步培养一批高水平青年科技人才。2、五年预期目（1）对处理国家重大需求预期奉献 国家中长期科学和技术发展规划纲要明确指出：疾病防治要“重心前移，坚持防止为主、增进健康和防治疾病结合。本项目完毕可以处理肺癌初期检测关键技术，从而明显提高肺癌治疗存活率，为人民健康和国民经济建设作奉献。同步通过纳米材料、生物、医学、信息等多学科交叉研究，深入推进纳米材料在生物医学中应用，增强我国在纳米科学领域国际竞争力。（2）在理论、措施、技术等方面预期获得进展、突破及其科学价值 1）新模式：获得肺癌初期预警、筛查和检测新模式，）新模式：获得肺癌初期预警、筛查和检测新模式，包括肺癌标志物种类、丰度和肺癌发生鉴别新模型，肺癌标志物异常与肺癌发病进程关系，多种肺癌标志物与肺癌分型、发生、发展及愈后程度有关性。2）新措施：）新措施：肺癌标志物富集和基质效应消除措施肺癌标志物富集和基质效应消除措施 运用生物大分子与纳米磁珠互相作用，以及微流控技术对纳米磁珠定向富集，建立肺癌标志物分离纯化措施，同步减小干扰成分影响，最终实现肺癌标志物有效富集。肺癌标志物迅速、联合检测措施肺癌标志物迅速、联合检测措施 采用夹心式免疫分析原理，固定有捕捉探针纳米磁珠和固定有信号探针量子点与待测样品中标志物夹心结合之后，运用量子点信号颜色和强度来确定标志物种类和丰度，检测反应在液相中进行，具有更高检测速度。3）新技术（成果形式）：）新技术（成果形式）：多种肺癌标志物联合检测技术：多种肺癌标志物联合检测技术：对初期肺癌检测敏感性和特异性均高于85%，对抗体检测限到达皮克/毫升(pg/mL)水平，对核酸检测限到达单碱基差异和皮摩尔(pM)水平，实现 4 种以上肿瘤标志物迅速联合检测；基于表面等离子体共振金纳米构造传感器：基于表面等离子体共振金纳米构造传感器：敏捷度到达单分子水平；硅纳米线传感器：硅纳米线传感器：敏捷度到达单分子水平；用于肺癌高危人群筛查试剂盒：用于肺癌高危人群筛查试剂盒：完毕高敏捷度试剂盒小批量生产，并完毕 1500 例临床标本测试和医学验证，完毕产品注册申报准备工作。（3）优秀人才培养 培养高水平学术人才：形成一支思维活跃、创新能力强基础研究团体，造就具有国际影响力领军人物 1-2 名；培养博士、硕士 150 人；五年内刊登 SCI、EI 收录学术论文 200 篇以上，领域内顶级期刊上刊登文章 20 篇，出版 1 本以上专著，申请发明专利 50 项。三、研究方案 1、总体研究思绪 面向肺癌初期检测重大需求：本项目以肺癌初期检测为最终目，目前临床诊断重要以影像学和痰细胞学为主，无法做到真正初期检测，而血清学检测又缺乏单一敏感和特异肺癌标志物，因此，本项目将以多种肺癌标志物敏感和特异联合检测作为实现目手段。需要处理三个方面科学问题：纳米材料定向偶联和有序组装机理、低丰度样品富集及微弱信号检测措施以及肺癌初期预警、筛查和检测新模式。通过学科交叉，实现技术突破：在荧光量子点、微流控芯片、表面等离子体共振传感器、硅纳米线传感器和肺癌临床治疗方面，我国已经有很好研究基础，但互相结合比较少，创新能力未得到充足发挥。本项目将研究三种高敏捷检测技术，（1）荧光量子点与微流控芯片技术相结合，研制纳米生物器件，用于多种肺癌标志物敏感和特异同步检测；（2）研制基于金纳米壳拉曼光谱传感器，用于肺癌标志物超高敏捷检测；（3）研制硅纳米线传感器，用于肺癌标志物超高敏捷度检测。其中（2）和（3）作为（1）技术补充。在此基础上，运用临床大样本进行医学验证，并用于肺癌高危人群初期检测，获得肺癌标志物与肺癌发病进程关系，得到肺癌初期预警、筛查和检测新模式，以指导肺癌临床治疗，增进人类健康水平提高。（见图 1 所示）图 1 项目总体研究思绪 2、技术路线 本项目通过学科交叉，充足结合各单位在荧光量子点、微流控芯片、表面等离子体共振传感器、硅纳米线传感器和肺癌临床治疗等方面优势，实现技术突破。重要包括四方面内容，（1）肺癌标志物富集微流控芯片，用于血液样本中肺癌标志物分离、纯化和富集；（2）基于荧光量子点纳米生物器件，用于多种肺癌标志物敏感和特异同步检测，通过量子点信号颜色和强度确定肺癌标志物种类和丰度；（3）基于表面等离子共振金纳米构造传感器和硅纳米线传感器，用于超低丰度肺癌标志物检测；（4）运用研制纳米生物器件，对临床样本进行检测，并与常规措施对照，以验证技术可行性。详细技术途径分述如下：（1）肺癌标志物富集微流控芯片 针对临床样品干扰成分多、肺癌标志物含量低等特性，运用微流控芯片和纳米磁珠技术，实现微量肺癌标志物有效纯化和富集，同步清除也许背景杂质。根据检测对象规定，设计微流控分析平台各个功能单元，包括样品采集、富集、反应、分离检测等，通过模拟分析进行有效集成；选择石英玻璃或聚合物材料（PDMS、PMMA、SU-8 等），基于 MEMS 加工工艺，制造微流控芯片；基于电驱动原理，优化电场、缓冲介质等条件，处理反应条件难于控制、进样量较少、进样重现性较差以及样品中不一样组分富集率差异等问题，处理稳定性和反复性问题，最终用于临床样本中肺癌标志物富集。芯片详细构造如图 2 所示。图 2 肺癌标志物富集微流控芯片（2）基于荧光量子点多种肺癌标志物联合检测生物器件 根据需求设计和制作不一样尺寸和特性荧光量子点，然后在纳米磁珠上偶联上捕捉探针，在量子点上偶联上信号探针。将功能化量子点探针和纳米磁珠探针加入待测样本中进行反应和检测。固定有捕捉探针纳米磁珠和固定有信号探针量子点与待测样品中肺癌标志物夹心结合之后，运用微流控芯片对磁珠定向富集，将未结合磁珠量子点清除，采用光学检测系统采集量子点荧光图像，通过荧光量子点信号颜色和强度解析出肺癌标志物种类和丰度，完毕对检测成果分析。量子点量子点制备制备 以廉价 CdCl2、Te、Na2S、ZnS 等为原料，运用微波辅助水相量子点制备技术，通过优化半导体量子点制备条件（反应温度、时间、pH 等），实现量子点可控生长和组装，精确控制量子点生长尺寸和粒径分布，合成出荧光量子产率高、光稳定性强、粒径分布窄多种构造 II-VI 族量子点如 CdTe/CdS、CdSe/ZnS 等。采用场发射透射电子显微镜、场发射扫描电镜、X-射线单晶衍射仪等表征量子点微观构造；运用瞬态和稳态荧光光谱和紫外吸取光谱研究量子点光物理行为和光化学稳定性。采用原位包覆、配体互换、静电自组装以及二氧化硅包覆等措施对量子点表面进行修饰或包裹，以减少许子点表面富余离子基团，减低量子点探针非特异吸附，改善量子点水溶性，处理量子点生物相容性问题；以人类白血病 K562 细胞为研究对象，考察不一样浓度和不一样培育时间下量子点对 K562 细胞毒性试验，以评价量子点生物相容性。量子点与生物分子偶联和有序组装量子点与生物分子偶联和有序组装 生物分子偶联和有序组装重要包括量子点与生物分子自组装、复合探针纯化以及性质鉴定和性能评价。纳米生物自组装：研究量子点与待检测标志物有特异识别酶、抗体、基因等生物大分子互相作用机理及其偶联或自组装措施。除运用分子间作用力、静电作用实现量子点与生物分子自组装外，本项目重点发展基于特定生物分子介导生物分子有序组装措施，即通过表面功能基团或特定生物分子介导，实现抗体和基因在量子点表面定向偶联或有序组装。例如，未端标识 BiotinDNA 先联接在量子点QD 表面上，得到 QD-DNA-biotin 复合物，再与链霉亲和素（Strepavidin）自组装（基于 biotin 与 avidin 特异性结合），可获得 DNA 分子介导有序组装纳米复合探针QD-DNA-biotin-Strepavidin；或者免疫球蛋白 G（IgG）通过 EDC/NHS 偶联措施与QD 连接，再与特定单抗（Ab）自组装，可获得 IgG 分子介导探针 QD-IgG-Ab。通过这些定向偶联或有序组装，可以有效处理纳米材料与生物分子间因简朴物理吸附或无序偶联而导致纳米生物复合探针稳定性差和生物识别功能失效问题，从而实现构建高效纳米生物复合探针。制备与纯化：将荧光量子点与生物分子通过多种浓度配比、缓冲体系、温度、时间进行自组装反应，产物通过色谱技术或超滤技术等进行纯化，清除游离量子点和生物分子，纯化探针贮存于具有多种保护组分储存缓冲液中，备用。性质鉴定：应用原子力显微镜和荧光光谱仪等鉴定纳米生物复合探针物化性质，如尺寸大小、量子效率、分散性等；应用免疫沉淀反应鉴定探针靶蛋白结合性能；通过发光效率与生物活性时间曲线鉴定探针稳定性。纳米生物器件研制纳米生物器件研制 选择相对较低廉 PDMS 材料基于聚合物微加工制备微流控芯片平台，该芯片包括待测样品采集、富集、混合、反应、分离和检测等功能模块；基于磁珠分离和富集技术实现肿瘤标志物高效富集。设计和制作微混合器实现反应组分有效混合，以及提供特定温度条件提高反应效率等。基于超光谱成像检测原理，设计并制造光学检测装置，为提高检测装置可靠性，整个装置拟采用模块化设计，包括光源和光学元件模块、信号采集处理模块、微流控芯片台模块、仪器自动控制、数据存储和显示处理模块，以及外壳等，到达美观、实用和集成规定。此外，根据标志物临床检测规定，开发数据分析软件，实现检测谱图显示和存储，各组分相对含量计算、比对和记录，并最终以常规检查汇报单形式打印输出。纳米生物器件详细构造如图 3 所示。图 3 基于荧光量子点多种肺癌标志物联合检测生物器件 （2）基于表面等离子体共振金纳米构造传感器 表面等离子体共振金纳米材料规模化制备和表面修饰表面等离子体共振金纳米材料规模化制备和表面修饰 运用自组装和胶体还原化学技术规模化制备出具有合理核-壳比金纳米壳材料，使其产生等离激元共振吸取峰峰波长位置位于近红外光区并适合全血分析规定；完善金纳米壳材料表面生物功能化途径；研究抗体等生物分子在金纳米壳材料表面固定措施；通过对金纳米壳材料功能化修饰，将生物分子识别作用和金纳米壳材料光学特性巧妙地结合在一起。对金纳米壳表面进行功能化修饰可以增长稳定性、生物相容性，排除非特异性干扰，可以使其更好地与生物体系结合，提高其生物分子识别能力。通过 LSPR 吸取峰位置变化定量分析全血体系中肺癌标志物；建立基于 LSPR 原理肺癌初期诊断新措施。用于肺癌初期检测纳米探针设计和构筑用于肺癌初期检测纳米探针设计和构筑 完善有序排列、厚度可控及大面积均匀 SiO2胶体晶膜制备体系，制备满足多种需要不一样微球直径和厚度氨基化 SiO2胶体晶膜；以吸附 GNPs 为核，选择不一样还原剂，还原 AuCl4-，控制反应速度和沉积时间，在 SiO2胶体晶膜微球表面沉积金制备金纳米壳层复合构造。通过控制微球直径、金纳米壳层构造厚度以及表面裂纹等调控 LSPR，研究 SERS 对于 LSPR 吸取峰波长依赖性；制备满足生物传感检测需要高质量聚苯乙烯有序多孔金纳米构造基底并研究多种试验条件对其LSPR 和 SERS 性质影响，通过调整 LSPR 使 SERS 信号最优化；在聚苯乙烯有序多孔金纳米构造基底多孔层表面均匀、高效地固定抗体及配基分子，提高固定效率和固定化抗体及配基分子稳定性，研究靶标分子在不一样孔径多孔层中微流体性质；运用 LSPR 位移检测抗原-抗体、配基-生物大分子等结合过程及结合容量等，得到生物分子互相作用原则曲线、结合常数及检测敏捷度等，研究非特异性吸附对分析影响；运用基于 SERS 分子独特振动能级和对应拉曼指纹图谱检测和鉴别分子信息，比较两种检测途径分析成果，证明 LSPR 与 SERS 互补性等。基于等离子体共振金纳米构造传感器研制基于等离子体共振金纳米构造传感器研制 通过控制 SiO2胶体微球直径、胶体晶膜厚度、金纳米壳层厚度以及表面裂纹等调整基底 LSPR 吸取峰波长位置使 SERS 信号最优化，实现稳定、可反复有序金纳米壳构造 SERS 基底规模化制造；在基底多孔层表面形成均匀及高稳定吸附肺癌标志分子层，减小环境中背景噪音，提取增强光学信号信号；最终研制出基于纳米金构造拉曼光谱传感器，用于肺癌标志物高敏捷度定量分析。传感器构造如图 4 所示。图4 基于金纳米构造肺癌标志物拉曼光谱传感器示意图 （3）硅纳米线传感器）硅纳米线传感器 硅纳米线传感器重要运用探针分子和被分析物特异结合在硅纳米线表面，产生电场或者电势变化，实现针对特定基团生物检测。它重要长处是超高敏捷度、直接电读出、无标识、易于与电路实现整体集成。该传感器重要包括硅纳米线制备、功能探针有序组装和传感器构建。硅纳米线制备硅纳米线制备 基于硅材料工艺选择性，采用 IC 工艺构建自对准硅纳米线腐蚀掩模版，可以实现硅纳米线尺寸精确可控和批量加工制造。本措施重要是通过工艺选择性来制造纳米线，与详细工艺参数有关性非常小，完全可以在实现纳米线精确定位同步，实现硅纳米线尺寸精细控制。详细是：选用低掺杂 SIMOX SOI 圆片，通过氧化、光刻工艺，以氧化硅为掩膜，运用 TMAH 对硅进行腐蚀形成（111）面。再使用低温化学气相沉积（LPCVD）生长 Si3N4，保护已腐蚀出硅（111）面。在距离该面不远地方光刻开出窗口，腐蚀二氧化硅直到靠近已形成硅(111)面上端。使用 TMAH溶液腐蚀表层硅，形成横截面为等腰三角形三棱柱。最终，淀积铝制作电极，完毕硅纳米线制作。生物分子在硅纳米线表面有序组装生物分子在硅纳米线表面有序组装 选择生物分子（以 DNA 探针为例），运用其自身携带或衍生基团实现其与硅纳米线表面偶联；设计 DNA 探针分子支架末端修饰方案，使修饰端与硅纳米线表面实现共价偶联。优化各项偶联条件，使该复合构造中生物分子保持后续生物反应活性（探针生物识别性能和生物分子滚环复制性能）；同步减少探针分子与硅纳米线之间非特异性结合，优化该纳米生物复合构造后处理条件，提高其稳定性和耐受性。详细包括：将抗体加入磷酸纳缓冲液（含 PNGase F 酶）中进行酶解去糖基化。然后加入胃蛋白酶琼脂糖、Triton X-100，振荡反应，用醋酸纳缓冲液洗脱产物，超滤浓缩并转移至磷酸钠溶液中，得到纯 F(ab)2。上述溶液经 2-巯基乙胺处理，然后经磷酸钠缓冲液透析过夜，然后过柱脱盐，除净巯基乙胺，得到 Fab；5端修饰功能基团（氨基或炔基等）；将官能团修饰 Fab（蛋白质探针）和 DNA 寡核苷酸，通过化学键合实现定向偶联在特定纳米界面区域内；首先在特定区域组装 Fab，然后在其他区域装配 DNA 寡核苷酸。组装完毕后，加入纳米界面封闭液（具有酪蛋白、随机 DNA 序列、两亲有机分子等）对界面进行钝化。鉴定措施：免疫分析法鉴定 Fab探针与靶分子结合性能，计算亲和常数，记录活性变化状况；比色与电泳法结合鉴定 DNA 组装效率。硅纳米线传感器研制硅纳米线传感器研制 通过控制生物分子在硅基纳米线表面有序性、方向性和三维形态，实现硅基纳米线表面高可控生物组装制造。完毕生物探针分子在硅基纳米线表面密度调控组装后，通过测量硅纳米线传感器源漏电流值，并比较结合目检测物前后源漏电流值，就可以得到肺癌标志物特异性响应。重要包括：采用硅烷化试剂APTES乙醇溶液和羧基活化剂实现硅纳米线表面硅烷化，然后进行miRNA探针组装，测量miRNA杂交缓冲液和参比成果，得到对目检测物特异性响应。（4）临床医学验证 研制出纳米生物器件提供应医院进行临床试验应用和考核，运用大样本肿瘤病人（目前已经有肺癌血清和组织标本）和健康对照血样（大体相似人数）和组织标本（肺癌患者手术癌旁组织），检测样本肿瘤标志物丰度，通过有关性分析，确定不一样病理类型、不一样分化程度肺癌特性性 microRNA 谱，通过 ROC 曲线分析，确定几种肺癌标志物联合检测提高肺癌初期诊断敏感性和特异性，建立肿瘤标志物丰度和肿瘤发病进程鉴别模型。运用建立鉴别模型，对肿瘤高危人群进行筛查、随访 24 个月，评价它们在肿瘤初期检测中价值。详细方案如图 5 所示。图 5 生物标识物（以核酸为例）鉴别模型建立路线示意图 根据有关临床标本选择原则选择肺癌标本、癌旁组织标本及肺癌患者和健康对照组（非吸烟者）血清标本和痰标本，进行核酸提取和蛋白提取，运用研制纳米生物器件，针对以上核酸和蛋白标本进行检测，与病理类型、细胞分化程度、分期（TNM 分期）进行有关性分析，并通过 ROC 曲线分析确定几种标志物联合检测提高肺癌初期诊断敏感性和特异性，建立肿瘤标志物丰度和肿瘤发病进程鉴别模型。运用该鉴别模型进行高危人群筛查，高危人群招募期限为 1 年，共招募 3000人，入组原则：吸烟指数在 400 以上、年龄不小于 40 岁者;有肺癌和其他恶性肿瘤家族史者;有职业暴露史者（煤烟、油烟、放射线、石棉）。有慢性肺部疾病者（如肺结核、支气管扩张、慢性阻塞性肺疾病）。同步招募健康对照者（人数未定），其入组原则为：同高危人群性别、年龄匹对无吸烟和被动吸烟史、无肿瘤家族史、无慢性肺部疾病者。入组时检查项目：对招募患者行外周血和低剂量螺旋 CT（胸部检查），血样行蛋白标志物和检查。其他任何处理取决于就诊医生。在随访 24 月期间内患者分为分为如下几组（如有任何症状，检查和治疗取决于就诊医生），至患者确诊时，记录病理类型、分化程度、TNM 分期、核酸和蛋白标志物浓度、其他任何不良事件（其他恶性肿瘤等），检查流程如图 6 所示。图 6 运用建立鉴别模型进行肺癌高危人群筛查流程 大临床标本生物信息学分析措施大临床标本生物信息学分析措施：根据大规模临床验证，运用贪婪算法搜索支持向量机分类器状态下，对样本分类精确率最高特点，将肺癌关联标志物随机分群，运用贪婪算法测试和评估训练样本集和预测样本集中，找到哪些标志物群可以集中体目前某个标志物上，哪些标志物群对特异性肺癌类型有较高特异性和敏感性，从而获得最优肺癌诊断标志物组合。在此基础上，获得肺癌初期预警、筛查和检测新模式，完毕肺癌初期检测应用流程制定，用于指导肺癌高危病人筛查和检测。3、可行性分析 本项目根据设定研究目和研究内容，凝聚了一支来自国内重要优势单位多学科紧密配合创新群体，中科院上海微系统与信息技术研究所、东南大学、南京邮电大学、复旦大学附属中山医院、天津医科大学附属肿瘤医院和香港都市大学深圳研究院等单位联合申请，各单位在各自领域具有扎实研究基础，符合优势互补，强强联合规定。在项目预研过程中，各单位之间就已开展通力合作，形成了科研能力强研究联合体，已经具有了开展本项目软硬件条件。联合申请单位对项目科学问题和研究内容进行了长期调研、分析和讨论。除了重视科学前沿性之外，亲密关注国外最新发展动态，保证项目学术思绪对、技术途径可行。各单位在国家自然科学基金、国家 863 计划等资助下，已经开展了肺癌初期检测有关肿瘤标志物、荧光量子点、探针标识、微流控技术、表面等离子体共振传感器和硅纳米线传感器等有关基础研究，并获得了某些创新成果，为本项目打下了扎实基础。与本项目有关重要研究成果如下：（1）在肺癌初期检测临床研究方面）在肺癌初期检测临床研究方面 在肺癌初期诊断方面曾先后承担国家自然基金和卫生部肺癌初期诊断课题，用改良二步 PCR 措施检测痰脱落细胞中 K-ras 基因突变，提高敏感性约 20。研究发现非小细胞肺癌 hTERT 体现阳性率为 86.3%，与 c-myc mRNA 体现存在明显有关，能辅助诊断肺癌、判断肺癌预后。与上海市肿瘤研究所合作研究检测肺癌基因甲基化发生和转录水平变化，发现人非小细胞肺癌细胞株 WT1、RASSF1A、MYDO1、GMGT、RAR 基因启动子 CpG 岛发生甲基化与非小细胞肺癌明显有关，同步，这些基因 mRNA 转录水平有不一样程度减少甚至不转录，对辅助诊断肺癌有积极作用。为下一步临床验证和示范应用打下坚实基础。天津肿瘤医院拥有肺癌新鲜组织标本 2700 例，肺癌患者血清标本 2500 例，组织标本和血清配对标本800 例，可以用于进行大规模临床试验。（2）在荧光量子点和微流控芯片方面）在荧光量子点和微流控芯片方面 在纳米材料制备上，已掌握多种制备技术，合成了纳米金、量子点、石墨烯、金属氧化物等多种纳米材料，尤其开发了具有自主知识产权微波辅助水相量子点制备技术，实现量子点可控生长和量子点尺寸与分布精确控制，制备了高质量核壳构造量子点，有关研究成果刊登在 Adv Mater、Small、Biomaterials、Chem Mater和 J Mater Chem 等杂志上。通过量子点与生物分子分子间偶联或自组装，已实现量子点对 Avidin、Strepavidin、IgG、DNA 等多种生物分子有序自组装，运用此类具有高亮信号特性和高特异性“量子点生物分子”复合探针，不仅能成功标识人胚胎期肾细胞HEK293T 骨架蛋白 actin，并且量子点荧光性能和光稳定性均优于荧光染料分子FITC；此外，运用构建量子点荧光探针 QD-IgG 或 QD-avidin，结合微流控芯片技术，已实目前血清样本中对肿瘤标志物 CEA 和 AFP 高敏捷分析和定量检测，其检测限到达 250 fM，比染料探针 FITC-IgG 提高 10000 倍，也比常规 ELISA 提高近10 倍。表明基于量子点微流控芯片不仅具有超敏捷分析能力，并且在血清样本中也具有良好特异性（Nano Research-v1-p490、ACS Nano-v4-p488、Chem Commun-v46-p6126）。由此可见，运用新型量子点荧光探针，并结合具有“多元多指标”检测能力微流控芯片技术，是极有也许实现肺癌在临床上初期诊断。发展了微量样品富集、核酸扩增及电泳分离检测等功能集成化微流控芯片，在此基础上开发了检测仪器，并用于临床尿蛋白、血脂蛋白迅速分离和分析，其中尿蛋白检测仪可以同步迅速检测尿液中多种微量蛋白，用于肾病综合症等重要疾病诊断，获得医疗器械产品注册证书（注册号：浙食药监械准字第 2400516）；血脂蛋白检测仪可以同步检测血液中低密度脂蛋白，用于冠心病等迅速诊断，目前已经完毕临床试验，医疗器械产品注册证书正在审批。（3）表面等离子体共振传感器方表面等离子体共振传感器方面面 制备出孔径可调三维有序大孔（3DOM）聚苯乙烯基底，建立了一种用 3DOM聚苯乙烯材料作为固定生物分子基底免疫分析新措施。运用衍射峰位移研究了3DOM 敏感材料微流体性质和蛋白质分子在多孔层里结合过程、结合容量、特异性分子识别反应及检测敏捷度等。制备出能同步耦合金纳米壳（GNPs）LSPR 和光子晶体衍射光学特性新型微纳构造敏感材料，该复合材料不仅再现了GNPsLSPR 峰，并且也复制了模板衍射峰。两个特性峰可逆叠加展现出有趣光学“开关”能力，为监控微环境变化提供了一种新三维检测平台。有关工作分别刊登在 Chem.Mater.、Langmuir 上。制备出具有可调光学性质 GNSs，控制 GNSs 核-壳比可使其 LSPR 位于光谱近红外区(700-1300 nm)，该光谱区域是光学传播透过生物组织最佳区域。将 GNSs组装到 APTES 修饰玻璃基底表面，制备出新型自组装 GNSs 敏感膜。运用 GNSs对周围介质介电常数变化敏感性，研制出一种适合于全血样品分析生物传感器，并实现了全血体系中生物素与链霉亲和素互相作用实时检测。有关工作刊登在Biosens.Bioelectron.上。（4）硅纳米线传感器方面 项目组于发明了一种基于各向异性湿法腐蚀技术纳米线加工技术，通过采用老式光刻、刻蚀和沉积技术，运用 Si（111）面自停止腐蚀和硅纳米线自限制氧化特性，成功地制造了宽度在 100nm 如下硅纳米线，并于获得了发明专利。该技术由于完全采用既有半导体工艺，工艺简朴，尤其适合批量制造需要。近一年以来，对这种自上而下硅纳米线开展了表面硅烷化研究，目前已经初步实现了表面自组装单分子膜层，并通过硅纳米线表面单链 DNA 探针修饰，实现了对 1 fM DNA 分子响应。总之，本项目符合国家中长期科学与技术发展规划，瞄准了肺癌初期检测重大需求，立足于早发现、早治疗，为节省治疗费用、挽救人们生命、增进友好发展作出奉献。在已经有研究基础上，