遗传学研究方法与技术实验讲义.doc

遗传学研究方法与技术实验指导

王晓雯

前言
遗传学之所以被一些学生看作是生物学中最难的课程之一，重要是由于在遗传学学习过程中不得不加以思考和想象。产生遗传规律的染色体结构与遗传物质传递过程却几乎是不可见的，这是 P.C. Winter等对遗传学的描述，它生动地反映了遗传学的一个重要特点——抽象性。遗传学既抽象，又具有相称强的理论性，并且与实践紧密结合，应用广泛，是生物、医学、农林类等专业的重要专业基础课程，也是动物、植物育种的理论基础。遗传学的基本概念、基本原理来自于人类生产、生活和科学研究的实践，实验教学可使学生更易理解和接受遗传学抽象的概念和原理，因此实验是遗传学教学中不可缺少的重要环节。通过实验可以掌握从群体、个体、细胞以及分子水平来研究生物质量性状和数量性状的遗传变异现象及其规律的实验技术和实验结果的分析方法。所以说，遗传学的教学过程不仅是一个知识传授的过程，并且是一个探索生物遗传奥秘的过程，一个分析问题、解决问题的过程。遗传学应用的一个重要方面是指导动植物、微生物的遗传改良，通过实验也可以了解遗传学理论与技术在生物遗传改良等方面应用的基本原理和方法。
普通遗传学实验是与普通遗传学相配套的课程，是我校加强实践环节教学改革的尝试之一。普通遗传学课程以经典遗传学为基础，同时介绍细胞遗传学、分子遗传学、数量遗传学、群体遗传学等遗传学分支学科的基本理论，为继续进一步学习这些分支学科奠定基础。普通遗传学实验教学的内容也应涉及遗传学研究的基本原理、技术与方法，培养和提高学生实验操作技能与分析问题、解决问题的能力。为此，在结合我校数年开设遗传学实验课的特点和吸取兄弟院校遗传学实验教学的宝贵经验的基础上，我们组织数年从事遗传学理论与实验一线教学科研工作的教师整理编写而成适合我校教学实际的遗传学实验教材。
本实验教材涉及五个部分共 30 个实验，其内容安排重要以杨业华、朱军分别主编的面向 21 世纪教材《普通遗传学》（高等教育出版社，2023）和《遗传学》（农业出版社，2023）的内容为依据，并适当编入了一些有关细胞遗传学、数量遗传学、群体遗传学和分子遗传学方面的实验。
为了使学生了解遗传学实验室的操作规范和必要守则，认真作好实验前后的各项工作，教程一方面编入了实验室工作规程。同时，为了便于准备实验材料、用品和配制药品，在本教程的最后列出了八个附录，以供参阅。

实验室工作规程

为保证遗传学实验能正常进行并获得抱负的实验结果，避免在实验中发生差错和意外事故，实验操作者必须严格遵守实验室规则，认真做好实验前后和实验过程中的各项工作。
一、基本规则
1．实验前必须预习，明确本次实验的目的、原理、内容和方法。实验时须保持安静，按实验教材和指导教师的规定进行操作，并详实记录实验中出现的情况和获得的实验结果，对资料进行整理分析，得出结论，写出实验报告。
2．实验室、工作台、各种仪器、用品、玻璃器皿等必须保持清洁整齐，工作台要严防酸、碱腐蚀。
各种化学药品、试剂等必须贴上标签，分门别类，放置一定位置，便于取用。
3．对的使用显微镜及各种仪器，切勿使染料或试剂沾污镜头、镜台和所用仪器。如有沾污，须立即用镜头纸擦拭干净。
4．取用药品时，所用各类量具必须分开，严禁混用，用后须立即冲洗干净。称量固体药品时，必须在秤盘上铺垫清洁白纸或蜡光纸，调试平衡后再称，以防药品腐蚀秤具。称量纸要做到一称一换，以防药品混杂，导致所配试剂不纯。
5．遵守化学实验的操作规定，注意药品配制和使用时的安全。
6．实验完毕，须做好清洁整理工作，所用仪器、物品应放还原处。实验过程中如有损坏或丢失仪器用品，应如实填写报告单，视情况进行相应解决。
7．全班实验结束后，值日生安排整个实验室的全面清理打扫。离开实验室前，必须关闭所用仪器和灯具的电源，关紧水龙头和门窗。
二、显微镜的清洁和保养
显微镜是遗传学实验的重要仪器，使用时必须防尘、防高温、防湿、防药品侵蚀，在清洁保养中要做到以下几点：
1．取镜时必须一手提镜臂，一手托镜底，防止显微镜滑落损坏。
2．取出显微镜后，先用软毛刷、纱布拂擦镜身的防尘污物，用洗耳球吹去缝隙及镜头上的灰尘和纤维等物，再用镜头纸擦拭物镜和目镜，最后用细白丝绸把镜头再擦一次。
3．镜检时物镜只能由低倍镜到高倍镜，在高倍镜下只能用微调螺旋调焦，细心操作，以防压碎玻片，损坏镜头。
4．若发现镜头被药物或脏物污染，立即用擦镜纸醮少许二甲苯（以刚湿润纸为度）擦掉污物，再用擦镜纸擦干。
5．用完显微镜后进行清洁整理，将载物台放至最低处，转动物镜使之不要对着聚光镜，将显微镜放回原处。
6．严禁将显微镜与化学药品混藏。
三、玻璃器皿的清洁
实验室所用玻璃器皿的清洁与否直接影响实验结果，实验前必须对玻璃器皿彻底清洗。
（一）初用玻璃器皿的清洗
1．新购置的玻璃器皿表面常附有游离的碱性物质，可先用肥皂水或去污粉洗刷，再用清水冲洗干净，然后用 1％～2％的盐酸浸泡 4h 以上，再用清水冲洗后用蒸馏水冲洗 2～3 次，100℃～130℃烘干备用。
2．新载玻片和盖玻片分别在盐酸乙醇[70％～95％工业乙醇（C2H5OH）100ml 加浓盐酸（HCl）2ml]中浸泡 4h，流水冲净，蒸馏水荡涤、晾干，置 95％乙醇中加盖，以便随时取用。
（二）使用过的玻璃器皿的清洗
1．使用过的器皿应在未干前洗涤，如不能及时清洗，应浸在凉水中。洗涤方法：放入洗衣粉水中煮沸半小时，刷洗，清水冲净，蒸馏水荡涤，晾干或烘干；或在洗涤液中浸泡半小时，清水冲洗，蒸馏水荡涤，晾干或烘干。
2．对移液管、滴定管、量筒、量器等，使用后应立即浸泡于凉水中，避免残留的溶液干涸，难以清洗。工作完毕后用流水冲洗，除去附着的试剂、蛋白质等物质，晾干后浸泡在铬酸洗液中 4～6h 或过夜，再用清水充足冲洗，最后用蒸馏水冲洗 2～4 次，风干后备用。
注：铬酸洗液配制方法 重铬酸钾（K2Cr2O7） 20g，浓硫酸（H2SO4，工业用，比重 1.84）或废硫酸100ml，清水 100ml。先将重铬酸钾溶于温水，冷却后渐渐加入浓硫酸，避免发热。此液呈红色，加盖防氧化变质，反复使用至变蓝黑色为止。器皿玻片洗净后再用此液浸泡，可延长其使用时间。
3．陈旧或用过的永久制片的玻片，可先在肥皂水中煮沸 5～10min，或将玻片微热后浸入二甲苯中脱胶，洗去残留的树胶和浆糊，并用清水冲洗干净。然后放入洗液中浸泡 30min，再用清水冲洗掉残留的洗液，最后用蒸馏水洗净，置 95％乙醇中保存备用。
四、玻璃器皿的干燥和灭菌
遗传学实验中以微生物为实验材料时，实验所用的玻璃器皿必须干燥和高温灭菌，防止杂菌污染。
（一）干燥
干燥的方法有自然晾干和烘干两种。自然晾干所需时间长，但器皿上无水渍。烘干是将器皿及其它用品置 60℃～80℃烘箱中干燥，但器皿上也许留有水渍，因此，在干燥之前应尽也许除去器皿上的水滴。
（二）灭菌
因高温能使微生物蛋白质变性，所以高温解决能达成灭菌的目的。高温灭菌的方法有干热灭菌法和湿热高压灭菌法两种。
1．干热灭菌法
将器皿及用品置 160℃ 2h，即可运用热空气杀死所有微生物及芽孢。在干热灭菌过程中要注意：
（1）烘箱内忌放易燃、易挥发物品，物品不能装得太满，棉塞等物品不能接触烘箱壁，以免发生燃烧事故。
（2）烘箱温度达 100℃以上后，切忌打开烘箱玻璃门，否则新鲜空气进入会引起燃烧，或因剧烈的冷热变化而使玻璃器皿爆裂。
2．湿热高压灭菌法
此法高温与高压结合，蒸汽传热均匀，灭菌时间短，效果好。常用各种高压蒸汽灭菌锅进行灭菌。一般当蒸汽压力达 15～20 lb/in 2 、温度达 121℃～125℃时，保持 20～40min 即可达成满意的效果。用此法灭菌应注意：
（1）灭菌锅内水量要适当，过少会烧干而发生事故，过多会导致消毒物品水湿。
（2）灭菌开始时打开放气阀，加热使蒸汽将锅内的冷气排出，然后再关上放气阀继续加热。否则灭菌效果不好。
（3）灭菌加热时要随时注意压力变化，如压力指针超过红色警戒线而安全阀仍未放气，则也许是安全阀失灵，应立即停止加热，以防爆炸。
（4）溶液或培养基灭菌后不能立即放气， 以免器皿炸裂或溶液喷出，需待其自然冷却，压力降至零时才可打开放气阀，揭开锅盖。

染色体观测基础知识
生物之所以能表现出复杂的生命活动，重要是由于生物体内遗传物质表达，推动生物体内新陈代谢过程的结果。生命之所以能世代延续，也是由于遗传物质延绵不断传递给后代的缘故。真核生物的遗传物质在细胞中重要以染色质的形式存在于细胞核内，在细胞分裂期形成染色体。染色体是基因的载体，其形态特性和数目因物种不同而各有差异，同一物种的染色体数目及形态特性是相对稳定的，真核细胞染色体的数目和结构是重要的遗传指标之一。染色体的形态特性在细胞分裂过程中呈周期性变化，要对染色体的形态、结构和数目进行研究，必须熟悉细胞分裂过程以及染色体的行为变化，掌握染色体标本的制作技术。最常见的高等生物细胞分裂涉及有丝分裂和减数分裂。
一、细胞周期与有丝分裂
有丝分裂是多细胞生物体细胞增殖的重要方式，细胞通过有丝分裂，一个细胞分裂为两个子细胞；核内染色体准确地复制、均等地分派到两个子细胞中，子细胞染色体组成与母细胞完全同样。从细胞上一次分裂完毕到下一次分裂结束的这段历程称为一个细胞周期（Cell Cycle），一个细胞周期包含一个分裂间期和一个分裂期。
（一）分裂间期(interphase)
一次细胞分裂结束到下一次细胞分裂开始之间的一段时期。此时在光学显微镜下看不到染色体，只能看到均匀一致的细胞核及染色较深的染色质。实质上间期核处在高度活跃的生理生化代谢阶段，为细胞继续分裂准备条件。
（二）分裂期(mitosis)
有丝分裂期是一个连续过程，为了便于研究和描述，通常将有丝分裂期划分为前期、中期、后期和末期。有丝分裂期在整个细胞周期中约占 10％，而其余大部分时间是处在细胞两次连续分裂之间的间期。细胞有丝分裂各时期染色体的行为变化与形态特性简述如下：
1．前期(prophase)
核内染色质开始逐渐螺旋化，浓缩为细长而卷曲的染色体，并逐渐缩短变粗。每条染色体含两个染色单体，拥有一个共同的着丝点。核仁和核膜逐渐模糊不明显。动物细胞的中心体一分为二，并向细胞两极移动，周边出现星射线，形成纺锤丝；高等植物直接从细胞两极放出纺锤丝。这个时期又可细分为三个时期：
（1）早前期 染色体细而长，染色质螺旋卷曲形成大小不同、着色较深的染色粒，一般制片染色线不可见，镜检时仅见核内充满大小不一、深浅不同的染色粒。核仁染色较深，仔细观测便可见到。
（2）中前期 染色体继续收缩，染色线周边基质不断增长，染色加深，染色体呈连续的线状。此时染色体仍扭曲很长，并互相缠绕，犹似一团搅乱的粗麻线。这时仍可见核膜、核仁，但在普通生物显微镜下核膜一般不易见到，核仁隐约可见。
（3）晚前期 染色体进一步螺旋化缩短变粗，明显可见每一染色体具有两个染色单体，染色体趋向中央赤道板，但仍然互相缠绕，核膜、核仁逐渐消失。
2．中期(metaphase)
染色体高度螺旋化，核仁、核膜均已消失，纺缍丝与染色体的着丝点相连形成纺缍体（因纺锤丝不着色，在光学显微镜下不可见，但有时会因纺锤丝影响细胞质着色微粒的排列，可隐约见到纺锤丝分布位置）。由同一着丝点相连的两个姊妹染色单体非常清楚，具有典型、稳定的形态特性。着丝点位置清楚（在染色体某个地方出现的不着色透明点即着丝点，它将染色体提成两段），且排列在赤道面上，染色体臂自由伸展，分布于赤道面两侧。中期侧面观染色体排列图象形似轮辐条状；极面观犹似某种菊花状。此期是采用适当制片技术进行染色体形态和数目鉴别的最佳时期之一。
3．后期(anaphase)
染色体着丝点纵裂为二，姊妹染色单体在纺锤丝牵引下互相分开，各成为一条独立染色体移向细胞两极；每极有一组染色体，其数目和母细胞染色体数目相同。
4．末期(telophase)
分开后的两组染色体到达细胞的两极，纺锤体解体，染色体解螺旋化，逐渐变得松散细长，核仁、核膜重新出现植物细胞赤道板处形成膜体，并形成细胞板，将细胞一分为二；动物细胞则通过细胞质缢缩，细胞膜在赤道板处向内凹陷，形成两个子细胞。细胞质随着核和子细胞形成相继随机分派到两个子细胞中。
高等植物有丝分裂重要发生在根尖、茎生长点及幼叶等部位的分生组织，植物染色体标本可运用这些组织，通过一定预解决压片而得。由于根尖取材容易，操作和鉴定方便，所以一般采用根尖作为观测植物有丝分裂的材料。获得动物染色体标本最常用的途径是从骨髓细胞、血淋巴细胞和组织培养的细胞中制备。
二、减数分裂(meiosis)
减数分裂是一种特殊方式的有丝分裂，发生在配子形成过程中。减数分裂过程的特点是：染色体复制一次而细胞连续分裂两次，形 成四个子细胞，每 个子细胞所含染色体数目只有母细胞染色体数目的一半。
除此之外，尚有一个特点是前期特别长，且染色体行为变化复杂，涉及同源染色体配对、同源染色体非姊妹染色单体的互换、联会复合体的解体与分离等。
减数分裂过程中染色体的形态、结构也呈周期性变化，且在特定期期呈现稳定的形态特性，因而也是进行染色体形态、结构与数目鉴定的有利时期。同时由于减数分裂过程中染色体出现同源配对、非姊妹染色单体间片段互换、同源染色体互相分离等一系列独特行为对遗传物质的分派和重组产生了重大影响。
因此，观测减数分裂过程对结识染色体形态、结构、数目的动态变化，鉴定染色体结构、数目变异以及分析染色体(组)间亲缘关系等都有重要作用；熟悉减数分裂过程，掌握减数分裂染色体制片方法，也是从事遗传研究与育种工作的基本技能之一。现将减数分裂各时期染色体的行为变化、形态特性简述如下。
（一）减数第一分裂
1．前期Ⅰ(prophaseⅠ，PⅠ) 此期又可分为五个时期：
（1）细线期(leptonema，PⅠ1) 核内染色质螺旋化呈长线状，互相缠绕，形似线团，难以辨别成双的染色体。
（2）偶线期(zygonema，PⅠ2) 染色体进一步螺旋化，缩短变粗，同源染色体互相纵向靠拢配对，称为联会。联 会的一对同源染色体称为二价体。由 于每条染色体各含两个姊妹染色单，故 又称之为四合体。
（3）粗线期(pachynema，PⅠ3) 二价体继续缩短变粗，形成紧密相连的联会复合体，此时同源染色体的非姊妹染色体间也许发生片段互换。
（4）双线期(diplonema，PⅠ4) 同源染色体互相排斥，联会复合体开始松散。若粗线期同源染色体的非姊妹染色单体间发生了互换，同源染色体在一定区段内会出现交叉结，可清楚地观测到同源染色体交叉的现象。
（5）终变期(diakinesis，PⅠ5) 染色体更加浓缩粗短，交叉结移向二价体的两极，核仁、核膜逐渐解体。此时二价体分散于核内，是染色体计数的好时期。
2．中期Ⅰ(metaphaseⅠ，MⅠ)
核仁、核膜解体，所有二价体排列在赤道面上，纺锤丝与着丝点相连，形成纺锤体，二价体两条染色体的着丝点分别趋向细胞的两极，此时最适于染色体计数和形态特性观测。
3．后期Ⅰ(anaphaseⅠ，AⅠ)
同源染色体开始分开，在纺锤丝收缩力的作用下分别向细胞两极移动，完毕染色体数目减半的过程。注意，此时染色体的着丝点尚未分裂，每条染色体仍由两个姊妹染色单体构成。
4．末期Ⅰ(telophaseⅠ，TⅠ)
染色体移到细胞两极，松开变细，核仁、核膜重新出现，形成两个子核；细胞质随机分裂，在赤道面上形成细胞板，成为二分体。
（二）减数第二分裂
减数第一分裂完毕后有一短暂的间期，二分体中的核仁、核膜完全形成，但染色体螺旋并不完全解开，紧接着进入减数第二分裂。
1．前期Ⅱ(prophaseⅡ，PⅡ)
染色体又开始缩短变粗，两姊妹染色单体互相排斥分开，着丝点处仍相连形成剪刀状。
2．中期Ⅱ(metaphaseⅡ，MⅡ)
染色体显著缩短变粗，着丝点排列在两子细胞的赤道面上，且与纺锤丝相连，形成纺锤体。
3．后期Ⅱ(anaphaseⅡ，AⅡ)
染色体的着丝点纵裂为二，姊妹染色单体分开成为独立的染色体，在纺锤丝牵引下分别移向两极。
4．末期Ⅱ(telophaseⅡ，TⅡ)
分向两极的染色体聚合，解螺旋形成新核，核仁、核膜重新形成，细胞质也分隔为二，从而使一个母细胞分裂为四个子细胞，称为四分体。每个子细胞内所含染色体数只有原母细胞（2n）的一半（n高等动、植物的性母细胞（2n）在形成雌雄配子（n）时必须通过减数分裂。在观测减数分裂过程时，无论动物或植物均以雄性较为方便。在适当的时机采集植物花蕾(花序)或动物精巢，经适当技术解决后制片，就可以在显微镜下观测到细胞的减数分裂过程。
三、染色体标本的制备方法
优良的染色体制片是其它技术（如显带、原位杂交等）的先决条件，制备染色体标本无疑是遗传学研究最基本的技术。染色体标本的制备原则上可以从所有发生有丝分裂的组织和细胞悬液中得到。因此，熟悉细胞有丝分裂全过程，掌握有丝分裂细胞染色体标本制作方法，是从事遗传研究的基本功之一。制备染色体标本的方法重要有压片法和空气干燥法两种。
（一）压片法
压片法是指将处在有丝分裂状态的组织或细胞（如植物根尖、茎生长点及幼叶的分生组织）经预解决、固定、解离（酶解或酸解）后，用人工外加的机械压力使染色体分散在载玻片上的一种染色体制片技术。此法操作快速、简便，节省材料，植物染色体标本的制作常用此方法。具体操作见相关实验。
（二）空气干燥法
空气干燥法简称气干法，是将细胞通过秋水仙素解决、低渗解决、充足固定、滴片（又叫染色体分散）等环节之后，在载玻片上得到染色体标本的制片技术。该方法操作稍繁，但染色体易于展开而不易导致染色体变形。动物染色体标本的制作常用此法。对含较多成熟组织的材料（如芽、幼叶等）或细胞含染色体数目多而小（ 如多种果树）的 植物可 将材料经预解决→前低渗→酶解离→后低渗等解决后制备细胞悬液，再行固定→滴片→空气（或火焰）干燥→Giemsa 染色制成染色体片，其制片效果明显优于压片法。
四、染色体分析方法
对染色体的数目、大小、形态特性等进行综合分析的方法称为核型分析。核型又称染色体组型，是指一个个体或一组相关个体的特有染色体组，通常以有丝分裂中期染色体的数目和形态来表达。根据染色体
的结构，按照长度、着丝点的位置及其它特性排列而成的图形称为核型图。核型分析的内容涉及染色体总数、染色体组数（x）、每一染色体的形态结构、异染色质和 DNA 的含量、核型对称限度等。染色体的形态、结构用染色体长度（绝对长度和相对长度臂指数或着丝粒指数等指标来描述。不同物种、不同品
种，甚至同种生物不同个体的核型均有差异。
染色体（臂）绝对长度（μm）＝放大的染色体（臂）长度（mm）/放大倍数] ×1000
植物：
相对长度（％）＝（某染色体长度/单套染色体组全长）100％
动物：
相对长度（％）＝[某染色体长度/（单套常染色体＋X 染色体）的总长]×100％

臂比＝长臂长度/短臂长度

长度比＝最长染色体/最短染色体

着丝粒指数＝（短臂长度/染色体全长）×100

表 1着丝粒位置的拟定（Levan 1964 年的标准）
臂 比
或着丝粒指数
着丝粒位置
简写
1.0
50.0
正中部着丝粒
M
1.0～1.7
50.0～37.5
中部着丝粒
m
1.7～3.0
37.5～25.0
亚中部着丝粒
sm
3.0～7.0
25.0～12.5
亚端部着丝粒
st
大于7.0
12.5～0.00
端部着丝粒；
t
∞
0
正端部着丝粒
T

核型分析能明确辨认各个染色体的特性，有助于基因定位，是细胞遗传学的一项基本技术，也是染色体工程、细胞分类学和进化理论的重要研究手段。不同物种的核型分析参照的标准各有差异，动物核型分析都参照人类核型分析的标准进行，植物核型分析有植物核型分析的标准。
（一）人类核型分析标准
人类细胞的正常核型是具有 2n=2x=46 条染色体，互相配对构成 23 对，其中有 22 对常染色体和 1 对性染色体，男性为 46，XY；女性为 46，XX。
根据州佛（1960）、伦敦（1963）、芝加哥（1966）会议提出的标准，即按照染色体的长度依次减少和着丝点的位置及其它特性，可把人类体细胞中的 23 对染色体分为七群。A 群：涉及第 1、2、3 三对染色体，体积大，中央着丝粒，易区别。第 2 对的着丝粒略偏离中央。
B 群：涉及第 4、5 两对染色体，体积大，亚中部着丝粒，彼此不易区分。
C 群：涉及第 6－12 对常染色体和 X 染色体，中档大小，具亚中部着丝粒，彼此间难以区分第 6对染色体的着丝粒靠近中央，X 染色体大小介于第 6 与第 7 对之间。第 9 对染色体长臂上有次缢痕，第 11对染色体的短臂较长，第 12 对染色体的短臂较短。
D 群：涉及 13、14、15 三对染色体。中档大小，近端着丝粒，有随体，彼此间不易区分。
E 群：涉及 16、17、18 三对染色体。中档大小，第 16 对有中央着丝粒，长臂上有次痕，易于区别。
第 17 和第 18 对有亚中部着丝粒，难于区分，后者短臂较短。
F 群：涉及 19、20 两对染色体。体积小，具中部着丝粒，彼此间难于区分。
G 群：涉及 21、22 两对常染色体和 Y 染色体。常染色体体积小，具近端着丝粒，有随体，长臂常呈分叉状，彼此不易区分。Y 染色体较前两对略大，也是具近端着丝粒，无随体，长臂常彼此平行，根据这_些特点可加以辨认。
（二）植物核型分析的基本原则
高等植物属异源多倍体的种类较多，进行核型分析时不能完全按染色体大小进行排列，而应事先根据系统发育的来源进行分组，然 后才在各组内按染色体大小、着 丝点位置、随 体的有无等特点进行排列组型。
如人工哺育的小黑麦，其染色体组来自普通小麦（AA BB DD）和黑麦（RR），核型分析时不仅要把 RR染色体组分开，并且也要把 AA、BB、DD 染色体组分开，在各染色体组内进行分析。常见的植物如棉花、烟草、马铃薯以及许多果树、蔬菜、花卉等均存在多倍体品种，核型分析时应特别注意。植物核型分类标准如表 2。
表 2植物核型分类标准
染色体长度比
臂比＞2∶1 的染色体的比例
0 1～50 51～99 100
＜2∶1
1A 2A 3A 4A
2∶1～4∶1 1
1B 2B 3B 4B
＞4∶1 1
1C 2C 3C 4C

目录
实验一 果蝇的饲养与形态观测
实验二 果蝇的伴性遗传
实验三 果蝇唾腺染色体
实验四 有丝分裂
实验五 减数分裂
实验六 一对质量性状的遗传分析
实验七 玉米两对性状的遗传分析
实验八 玉米的连锁和互换
实验九 脱氧核糖核酸(DNA)的鉴定 ——（1）孚尔根(Feulgen)反映
实验十 植物多倍体的诱发
实验十一 植物染色体标本的制备（去壁低渗法）
实验十二 永久压片制片法
实验十三 植物染色体Giemsa N带技术
实验十四 作物花粉育性的鉴定
实验十五 植物染色体的核型分析．
实验十六 X－染色质的观测

实验一　果蝇的饲养与形态观测

一． 实验目的：
1. 观测几种常见品系的果蝇，纯熟掌握雌雄果蝇的鉴别。
2. 了解果蝇的生活史及饲养方法。
二． 实验原理：
1.果蝇的生活史：
果蝇属于昆虫纲、双翅目，与家蝇是不同的种。果蝇具有繁殖率高、饲养简朴、生活史短的特点，它的生活史涉及卵　　幼虫　　蛹　　成虫。
果蝇的生活周期长短与温度关系很密切，30℃以上的温度能使果蝇不育和死亡，低温则使它生活周期延长，同时生活力也减低，果蝇培养的最适合温度20－25℃。

10℃
15℃
20℃
25℃
卵　→幼虫
幼虫→成虫　　　　　

57天

18天
8天
6.3天
５天
4.2天

2.果蝇的雌雄区别与观测：
果蝇有雌雄之分，幼虫期区别较难，成虫区别容易。雄性的腹部环纹５节，末端钝而圆，颜色深。第一队脚的跗节前端表面有黑色鬃毛流苏，称性梳。雌性腹部环纹７节，末端尖，颜色浅，跗节前端无黑色鬃毛流苏。

雌雄
方法
观测项目
雌蝇
雄蝇

肉
眼
鉴
　　别　

解下
剖观
镜察

腹　

部

较大　　　　　　　　　　

较小
膨大呈椭圆形，尾端较尖
圆筒形，尾端较钝
腹
背
侧
有黑色横纹5－7条，粗细均匀
有黑色横纹3－5条，末端一条特别粗，尾端呈黑色
腹部
6个腹片
4个腹片
性梳
无
第一对跗节有性梳

　3.果蝇的饲养：
　　　果蝇在水果摊或果园常可见到，但它并不是以水果为生，而是食生长在水果上的酵母菌，因此实验室内凡能发酵的基质，均可作为果蝇的饲养物质。我们实验室常用的是玉米粉饲养法。

　　　300ml 体系中需加的成分：
　　　A: 糖　18.6g　琼脂　1.86g 水　108ml 。
　　　B: 玉米粉　25.2g　酵母粉　2.10g　水　108ml。
　　　A和B混合加热成糊状后，加1.5ml丙酸，即可分装到培养瓶中。
三．实验材料及用品：
１．材料：各种品系果蝇。
2. 用品：麻醉管，解剖镜等。
3. 药品：乙醚等。
四．实验方法：
把果蝇转入麻醉瓶中，塞上滴有乙醚的棉塞，待果蝇所有昏迷后，倒在解剖镜的白瓷板上进行观测。对不需再培养的果蝇（如只进行性状观测的果蝇），可以深度麻醉，致死也无妨（果蝇翅膀外展45℃角，说明果蝇已死亡）。
观测果蝇的形状特点，如：眼型、颜色、体色、翅形、性梳等形态特性。
五．作业：
1. 画出雌、雄果蝇腹部和背面简图。
2. 列表说明野生型与相应突变型异同。

实验二 果蝇的伴性遗传

一． 实验目的：
1.　记录交配结果和掌握记录解决方法。
2.　对的结识伴性遗传的正、反交的差别。
二． 实验原理
位于性染色体上的基因，其传递方式与位于常染色体上的基因不同，它的传递方式与雌雄性别有关，因此称为伴性遗传（sex-linked inheritance）。
果蝇的性染色体有X和Y两种，雌蝇为XX，是同配性别；雄蝇为XY，是异配性别。
1. 交配方式：
A: ♀[+/＋] ×[W] ♂ B: ♀[W/W] ×[+] ♂
P: [+/+]♀♀×[W] ♂♂ [W/W]♀♀×[+] ♂♂
F1: [+/+;+/W]♀♀×[+] ♂♂ [+/W]♀♀×[W] ♂♂
F2: ♀[+/+] ♀[+/W] ♀[+/W] ♀[W/W]
♂[+] ♂[W] ♂[+] ♂[W]
若A为正交，F1代♀、♂都为野生型[+]，F1互相交配得F2代，则♀都是野生型[+]，♂性则野生型[+]和白眼[W]各占一半，比例为1:1。
B是A的反交，F1代与A不同，♀为野生型[+]，而♂为白眼[W]，此现象又称为绞花式遗传（lriss-cross inheritance）。F1互相交配得F2代，♀的红眼与白眼比例为1:1，♂的红眼与白眼比例也是1:1。
2. 注意：
1） 常染色体性状遗传的正、反交所得子代♀、♂性状相同，而伴性遗传则不同。
2） 在进行伴性遗传实验时，也有例外个体产生，这是由于两条X不分离导致的（B杂交组合），F1中出现了不应当出现的♀性白眼，但这种情况极为罕见，约几千个个体中有一个。
三． 实验材料及用品：
1. 材料：黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）品系；野生型（红眼），wild type（+）突变型（白眼），white eye（w），此基因在X染色体上。
2.用品：解剖镜，麻醉管，解剖针等。
3.药品：乙醚等。
四． 实验方法
1.收集处女蝇：由于雌蝇生殖器官中有贮精囊，一次交配可保存大量精子，供多次排卵受精用，因此做杂交实验前必须收集未交配过的处女蝇。由于孵化出的幼蝇在12小时内（更可靠是8小时）不交配，因此必须在这段时间内把雌、雄蝇分开培养，所得的雌蝇即为处女蝇。
2.准备好培养基，按正、反交组合，把已麻醉的红眼♀、白眼♂和红眼♂、白眼♀分别放入不同管内进行杂交，贴上标签。标签形式如下：

B组合

ww х +Y
日期
姓名

A组合

++ х wY
日期
姓名

　　　　　　　　　　　　　　　3.6—7天后，见到有F1幼虫出现，即除去亲本果蝇（一定要除干净！）
4.再过3—4天，观测F1成蝇的性状。（正、反交有什么不同？眼色和性别的关系如何？
5.所出现的F1雌、雄果蝇麻醉后，挑3—5对果蝇换入新的培养基继续饲养（此处无需处女蝇，为什么？）。两组合后代不能混合，应分别培养。
6.6—7天后又需除干净F1代亲本果蝇。
7.再过3—4天，F2代成蝇出现，麻醉后倒在白瓷板上观测眼色和性别，进行记录。
8.每隔1—2天记录一次，累积6—7天数据。
五． 实验结果记录:

A组合：（正交）♀＋＋хwY♂
F1
　　　　 观测结果
记录日期
各　类　果　蝇　的　数　目
红眼♀［＋］
红眼♂［＋］

B组合：（反交）♀wwх＋Y♂
F1
　　　　 观测结果
记录日期
各　类　果　蝇　的　数　目
红眼♀［＋］
白眼♂［w］

A组合：
F2
　　　　 观测结果
记录日期
各　类　果　蝇　的　数　目
♂红眼［＋］
♂白眼［w］
♀红眼［＋］
♀白眼［w］

合　　计

百　分　比

B组合：
F2
　　　　 观测结果
记录日期
各　类　果　蝇　的　数　目
♂红眼［＋］
♂白眼［w］
♀红眼［＋］
♀白眼［＋］

合　　计

百　分　比

χ2 测验：
　　　　　X2=Σ(观测值－理论值)２/理论值
根据X2测定，查X2表，若P>5%,说明观测值与理论值之间的偏差是没故意义的，也就是说，可以认为观测值是符合假设的。具体对这个实验来说，所得到的实验结果应当是符合伴性遗传的假说，也就是说眼色的这对性状是由于性染色体X上的一对等位基因控制的。
实验三 果蝇唾腺染色体

一． 实验目的：练习取出果蝇幼虫唾腺组织，制作唾腺组织染色体标本。
二． 实验原理：双翅类昆虫（摇蚊、果蝇等）幼虫期的唾腺细胞很大，其中的染色体称为唾腺染色体（salivary chromosome）。这种染色体比普通染色体大得多，宽约5μm，长约400μm，相称于普通染色体的100－200倍，因而又称为巨大染色体。唾腺染色体通过多次复制而并不分开，大约有1000－4000根染色体丝的拷贝，所以又称多线染色体（polytene chromosome）。多线染色体经染色后，出现深浅不同、密疏各别的横纹，这些横纹的数目和位置往往是恒定的，代表着果蝇等昆虫的种的特性。如染色体有缺失、反复、倒位、易位等，很容易在唾腺染色体上认别出来。
三． 实验用品：

1. 材料：果蝇的三龄幼虫。
2. 用品：解剖镜、显微镜、镊子、解剖针、载玻片、盖玻片、吸水纸等。
3. 药品：改良苯酚品红等。
四． 实验方法：
1. 把载玻片置于解剖镜下。载玻片上滴水一滴，取三龄幼虫放在其中，操作者两手各握一枚解剖针，左手的解剖针压住幼虫后端１/３处，固定幼虫。右手解剖针按住幼虫头部，用力向右拉，把头部从身体拉开，唾腺随之而出，唾腺是一对透明的棒状腺体（如图）。

2. 在载玻片上除去幼虫其他组织部分，还要把唾腺周边的白色脂肪剥离干净，再滴上改良苯酚品红染色。
3. 固定染色5－10分钟后，盖上干净的盖玻片，用吸水纸覆盖上，然后放在平的桌子上，用大拇指用力压下住。
4. 制成标本进行观擦。
作业：绘制果蝇唾腺染色体图。
实验四 有丝分裂

实验目的

1、 学习醋酸洋红染色法的操作方法；
2、 观测植物根尖细胞有丝分裂各个时期染色体的变化和特性。

实验原理

有丝分裂是生物体细胞增值的重要方式。在有丝分裂过程中，细胞核内染色体能准确的复制，并能有规律地、均匀地分派到两个子细胞中去，使子细胞遗传组成与母细胞完全同样，从而可以推断生物性状的遗传与染色体的准确复制和均等分派有关，支配生物性状的遗传物质重要存在于细胞核内的染色体上。
细胞有丝分裂是一个连续过程，可分为前期、中期、后期和末期。有丝分裂在整个细胞周期中约占10%的时间，而其余大部分时间是处在细胞连续两次分裂的间期。有丝分裂各时期染色体变化的特性简述如下：
前期：核内染色体逐渐浓缩为细长而卷曲的染色体，每一染色体具有两个染色单体，他们具有一个共同的着丝点；核仁和核膜逐渐模糊不明显。
中期：核仁和核膜逐渐消失，各染色体排列在赤道板上，从两极出现纺锤丝，分别与各染色体的着丝点相连，形成纺锤体。中期染色体呈分散状态，便于鉴别染色体的形态和数目。
后期：各染色体着丝点分裂为二，其每条染色体也相应地分开，并各自随着纺锤丝的收缩而移向两极，每组有一组染色体，其数目和本来的染色体数目相同。
末期：分开在两极的染色体各自组成新的细胞核，在细胞质两极赤道板处形成新的细胞壁，使细胞分裂为二，形成两个子细胞。这时细胞进入分裂间期。
间期：细胞分裂末期到下一次细胞分裂前期之间的一段时期。在光学显微镜下，看不到染色体，只看到均匀一致的细胞核及其中许多的染色质。实质上间期的核是处在高度活跃的生理生化的代谢阶段，为细胞继续分裂准备条件。
高等植物有丝分裂重要发生在根尖、茎生长点及幼叶等部位的分生组织。由于根尖取材容易，操作和鉴定方便，故一般采用根尖作为观测有丝分裂的材料。

实验材料
洋葱（ Allium cepa ，2n=16）　的鳞茎。
蚕豆（ Vicia faba ，2n=12）的种子

实验用品药品
（一） 仪器用品
显微镜、乙醇灯、培养皿、载玻片、盖玻片、镊子、刀片、解剖针、木夹、吸水纸、滤纸、标签、铅笔。
（二） 药品试剂
无水乙醇、95%乙醇、80%乙醇、70%乙醇、1N盐酸、醋酸洋红、卡诺氏（Carnoy’s）固定液（1份冰醋酸+3份无水乙醇）、氢氧化铁、秋水仙碱。
醋酸洋红染色液：将90ml醋酸加入到110ml蒸馏水中，加入洋红1克，煮沸，使其充足饱和，冷却过滤，并加醋酸铁或氢氧化铁（媒染剂）水溶液数滴或在加入1克洋红的同时加入1枚大头针，煮沸，然后文火2～3小时，冷却过滤。

实验环节

1、 材料准备
选取新鲜饱满的蚕豆种子，于沸水中煮