灯盏花素对牙龈卟啉单胞菌脂多糖诱导的人牙龈成纤维细胞损伤的影响.pdf

医学分子生物学杂志,2024,21(1):063-068 J Med Mol Biol,2024,21(1):063-068DOI:10.3870/j.issn.1672-8009.2024.01.010通讯作者:姚毅章(电话:[phone],E-mail:522131539 )Corresponding author:YAO Yizhang(Tel:[phone],E-mail:522131539 )灯盏花素对牙龈卟啉单胞菌脂多糖诱导的人牙龈成纤维细胞损伤的影响晁晓芹1,赵国廷1,董振耀1,马民英1,姚毅章2青海省第五人民医院1口腔科,2医学中心 西宁市,810000【摘要】目的 探讨灯盏花素(breviscapine,BVP)对牙龈卟啉单胞菌脂多糖(porphyromonas gingivalis,Pg-LPS,简称 LPS)诱导的人牙龈成纤维细胞(human gingival fibroblasts,HGFs)损伤的影响。方法 体外培养 HGFs 细胞,分为对照组、LPS 组、LPS+BVP 低、中、高剂量组。CCK-8 法检测细胞增殖;ELISA 法检测细胞上清液中 IL-1、肿瘤坏死因子-(tumor necrosis factor,TNF-)、IL-6 水平及超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性;蛋白质印迹法检测细胞中细胞周期素 D1(Cyclin D1)、细胞周期素 B1(Cyclin B1)及凋亡相关 B 淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)、BCL-2 相关 X 蛋白(BCL-2-associatedX protein,Bax)、半胱氨酸蛋白酶 3(Caspase-3)蛋白表达水平;TBA 比色法检测细胞丙二醛(malondial-dehyde,MDA)水平;二氢荧光素二乙酸酯(dichloro-dihydro-fluorescein diacetate,DCFH-DA)法测定细胞中活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平。结果与对照组比较,LPS 组 HGFs 细胞存活率、细胞迁移率、Cyclin B1、Cyclin D1、Bcl-2 蛋白表达水平及 SOD 活性显著降低(P 0.05),细胞凋亡率、Bax、Caspase-3 蛋白表达水平、炎症因子 TNF-、IL-1、IL-6 水平及 MDA、ROS 水平显著升高(P 0.05);与LPS 组比较,LPS+BVP 低、中、高剂量组细胞存活率、细胞迁移率、Cyclin B1、Cyclin D1、Bcl-2 蛋白表达水平及 SOD 活性显著升高(P 0.05),细胞凋亡率、Bax、Caspase-3 蛋白表达、炎症因子 TNF-、IL-1、IL-6 水平及 MDA、ROS 水平显著降低(P0.05)。结论 BVP 可通过抗炎、抗氧化作用减轻 LPS 诱导的 HGFs 细胞损伤。【关键词】灯盏花素;牙龈卟啉单胞菌脂多糖;人牙龈成纤维细胞;细胞损伤【中图分类号】R285.6Effect of Breviscapine on Porphyromonas gingivalis LipopolysaccharideInduced Injury in Human Gingival FibroblastsCHAO Xiaoqin1,ZHAO Guoting1,DONG Zhenyao1,MA Minying1,YAO Yizhang21Department of Stomatology,2Stomatological Center,Qinghai Fifth Peoples Hospital,Xining,810000,China【Abstract】Objective To investigate the effect of breviscapine(BVP)on the Porphyromonasgingivalis lipopolysaccharide(Pg-LPS,hereinafter referred to as LPS)induced injury in humangingival fibroblasts(HGFs).Methods HGFs cells were cultured in vitro and divided into 5groups:control group,LPS group,LPS+BVP low-,medium-and high-dose groups.CCK-8method was used to detect cell proliferation.ELISA method was used to detect the levels of inflamma-tory factors interleukin-1(IL-1),tumor necrosis factor-(TNF-),interleukin-6(IL-6)and the activity of superoxide dismutase(SOD).Western blotting method was used to detect the ex-pression levels of cyclin D1,cyclin B1 and apoptosis-related B-cell lymphocytoma-2(Bcl-2),BCL-2-associated X protein(Bax),Caspase-3 proteins in cells.TBA colorimetric method was usedto detect the level of malondialdehyde(MDA)in cells.DCFH-DA method was used to determinethe level of reactive oxygen species(ROS)in cells.ResultsThe HGFs cell survival rate,thecell migration rate,the protein expression levels of Cyclin B1,Cyclin D1,Bcl-2 and the SOD ac-tivity in the LPS group were significantly decreased when compared with those in the control group(P0.05).The apoptosis rate,the protein expression levels of Bax,Caspase-3,the levels of in-flammatory factors TNF-,IL-1,IL-6,and the levels of MDA and ROS in the LPS group weresignificantly increased when compared with those in the control group(P0.05).The cell survivalrate,the cell migration rate,the protein expression levels of Cyclin B1,Cyclin D1,Bcl-2 andSOD activity in the LPS+BVP low-,medium-and high-dose groups were significantly increasedwhen compared with those in the LPS group,and the apoptosis rate,the protein expression levels ofBax,Caspase-3,the levels of inflammatory factors TNF-,IL-1,IL-6,and the levels of MDAand ROS in the LPS+BVP low-,medium-and high-dose groups were significantly decreased whencompared with those in the LPS group(P0.05).Conclusion BVP can reduce LPS-induced HG-Fs injury through anti-inflammatory and antioxidant mechanism.【Key words】breviscapine;Porphyromonas gingivalis lipopolysaccharide;human gingival fi-broblasts;cell damage 牙周炎是主要由菌斑微生物引发的一种口腔疾病,是成人失去牙齿的主要原因,牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,Pg)是牙周疾病的重要致病菌,该菌外膜中的脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)可导致牙周组织细胞破坏,使牙周炎病情加重,因此,减轻 Pg-LPS(以下简称 LPS)诱导的人牙 龈 成 纤 维 细 胞(human gingival fibroblasts,HGFs)炎性损伤对预防和治疗牙周疾病具有重要意义1-3。灯盏花素(breviscapine,BVP)是从菊科植物中提取的黄酮类成分,主要成分为灯盏乙素,具有抗炎、抗肿瘤、抗氧化、扩张血管等多种药理学作用4-5。研究显示,BVP 可通过上调微小RNA(microRNA,miR)miR-499 的 表 达,抑 制LPS 诱导的心肌细胞氧化应激和细胞凋亡,从而保护 LPS 所致心肌细胞损伤6。但是 BVP 对 LPS 诱导的 HGFs 炎症损伤的影响尚不清楚。因此,本研究建立 LPS 诱导的 HGFs 细胞损伤模型,观察 BVP对 LPS 诱导的 HGFs 细胞的影响,为寻找治疗牙周炎的新药提供理论基础。1 材料与方法1.1 材料HGFs 购自中科院上海细胞库,Pg-LPS(货号:ATCC33277)购自美国 R&D Systems 公司;BVP(规格:20 mg)购自中国药品生物制品检定所;RPMI 1640 培养基(货号:11875101)、胎牛血清(货号:26140-079)购自美国 Gibco 公司;二辛可宁酸(bicinchoninicacid,BCA)蛋白检测试剂盒、Annexin V-FITC/PI 试剂盒购自南京凯基生物技术有限公司;超氧化物歧化酶(superoxidedismutase,SOD)活 性 检 测 试 剂 盒(货 号:HZB002)购自上海沪峥生物科技有限公司;活性氧(reactive oxygen species,ROS)检测试剂盒-DCFHDA(货号:HR8687)购自北京百奥莱博科技有限公司;TNF-(货号:E-EL-H0109c)、IL-1(货 号:E-EL-H0149c)、IL-6(货 号:E-EL-H0192c)、酶联免疫吸附测定(enzyme linked im-munosorbent assay,ELISA)试剂盒、丙二醛(ma-londialdehyde,MDA)、比色法测试盒(TBA 法)(货号:E-BC-K025-M)购自 Elabscience 公司;辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)标记的兔抗二抗(批号:E030120)、鼠抗二抗(批号:E030110)购自美国 EarthOx 公司;兔抗人细胞周期素 Cyclin B1(Y106,货号:ab215436)、CyclinD1(SP4,货号:ab134175)、BCL-2 相关 X 蛋白(BCL-2-associated X protein,Bax)(E63,货号:ab263897)、B 淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)(EPR17509,货号:ab218123)、半胱氨酸蛋白酶 3(Caspase-3)(E87,货号:ab32150)和鼠抗人-actin 抗体(AC-15,货号:ab6276)购自英国 Abcam 公司。Epics Altra 型流式细胞仪购自美国 Beckman Coulter 公司,MK3 型全自动酶标仪购自美国 Thermo 公司。1.2 细胞培养及分组常规复苏 HGFs 细胞后,接种至 RPMI 1640 培养基中进行传代培养,每隔 2 3 天换液,待细胞生长至对数期时,将 HGFs 细胞分为对照组,LPS组,LPS+BVP 低、中、高 剂 量(25、50、100mol/L BVP)组。对照组不做处理,LPS 组使用10 mg/L LPS 处理 4 h,LPS+BVP 低、中、高剂量组使用 10 mg/L LPS 处理 4 h 后,再分别用终浓度为 5、50、100 mol/L 的 BVP 处理,置于细胞培养箱中进行培养。1.3 细胞计数试剂(cell counting kit 8,CCK-8)法检测细胞增殖 将处理好的各组 HGFs 细胞接种于 96 孔板中,培养 48 h 后,采用 CCK-8 法检测细胞增殖,计算细胞存活率。46晁晓芹,等.灯盏花素对牙龈卟啉单胞菌脂多糖诱导的人牙龈成纤维细胞损伤的影响1.4 细胞凋亡检测将处理好的各组 HGFs 细胞接种于 96 孔板中,培养 24 h 后,使用 70%乙醇固定,使用 AnnexinV-FITC/PI 试剂盒检测细胞凋亡。1.5 划痕实验检测细胞迁移将各组处理的 HGFs 细胞以4 104个/孔接种于6孔板中,待细胞贴壁融合后,使用 200 L 枪头在培养皿垂直划线,加入无血清的 RPMI 1640 培养基培养48 h,显微镜观察拍照,计算各组细胞迁移率。1.6 蛋白质印迹法检测细胞蛋白表达离心收集各组处理的 HGFs 细胞,使用蛋白裂解液裂解细胞,提取各组 HGFs 细胞总蛋白,经变性后进行十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate,SDS)-聚丙烯酰氨凝胶电泳(polyacrylamide gel e-lectrophoresis,PAGE),转膜封闭后,分别加入兔抗人 Cyclin B1(1500 稀释)、Cyclin D1(11 500稀释)、Bax(1 1 000 稀释)、Bcl-2(1 1 000 稀释)、Caspase-3(1 1 500 稀释)和鼠抗人-actin(11 000)抗体,4 孵育过夜,再加入辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)标记的 IgG二抗(12 000 稀释),室温孵育 1 h,DAB 显色,以-actin 为内参,Quantity One 软件分析条带灰度,并计算目的蛋白相对表达量。1.7 ELISA 法检测细胞上清液中 TNF-、IL-1、IL-6 水平 各组细胞培养 48 h 后取细胞培养上清液,采用 ELISA 法测定各组 HGFs 细胞上清液中 TNF-、IL-1、IL-6 水平。1.8 SOD、MDA 与 活 性 氧(reactive oxygen species,ROS)的检测 取各组处理的细胞,裂解液裂解细胞后,用试剂盒检测细胞中 SOD 和 MDA。各组处理的 HGFs细胞接种于黑色 96 孔板中,每孔加入 10 mol/L的二氢荧光素二乙酸酯(dichloro-dihydro-fluoresce-in diacetate,DCFH-DA)探针,37 避光孵育 30min,以空白孔做对照,荧光酶标仪检测各孔 A 值,计算相对 ROS 水平。1.9 统计学处理每组实验设置 6 个复孔,计量资料以 x s 表示,采用 SPSS 23.0 统计分析,多组间比较与进一步两两组间比较分别使用单因素方差分析与 SNK-q检验。2 结果2.1 BVP 对 LPS 诱导的 HGFs 细胞增殖及其相关蛋白表达的影响 与对照组比较,LPS 组细胞的存活率、CyclinB1、Cyclin D1 蛋白表达水平显著性降低(P 0.05)。与 LPS 组比较,LPS+BVP 低、中、高剂量组细胞存活率、Cyclin B1、Cyclin D1 蛋白表达水平显著升高,并呈 BVP 浓度依赖性(P0.05)(图1、表 1)。1:对照组;2:LPS 组;3:LPS+BVP 低剂量组;4:LPS+BVP 中剂量组;5:LPS+BVP 高剂量组。图 1 各组细胞 Cyclin B1、Cyclin D1 蛋白表达情况表 1 BVP 对 LPS 诱导的 HGFs 细胞增殖及其相关蛋白表达的影响组别细胞存活率(%)Cyclin B1/-actinCyclin D1/-actin对照组99.35 0.981.02 0.121.05 0.11LPS 组69.32 2.580.32 0.040.41 0.05LPS+BVP 低剂量组78.47 3.050.51 0.050.65 0.06LPS+BVP 中剂量组85.58 3.620.75 0.080.83 0.08LPS+BVP 高剂量组92.69 2.780.90 0.090.93 0.09 注:与对照组比较,P0.05;与 LPS 组比较,P0.05;与 LPS+BVP 低剂量组比较,P0.05;与 LPS+BVP 中剂量组比较,P0.05。2.2 BVP 对 LPS 诱导的 HGFs 细胞凋亡及其相关蛋白表达的影响 与对照组比较,LPS 组 Bcl-2 蛋白表达显著降低,HGFs 细胞凋亡率、Bax、Caspase-3 蛋白表达水平显著升高(P 0.05);与 LPS 组比较,LPS+BVP 低、中、高剂量组 Bcl-2 蛋白表达水平显著升高,细胞凋亡率、Bax、Caspase-3 蛋白表达水平显著降低,并呈 BVP 浓度依赖性(P0.05)(图2、表2)。56医学分子生物学杂志,2024,21(1):063-068 J Med Mol Biol,2024,21(1):063-068A:各组细胞 Bax、Bcl-2、Caspase-3 蛋白表达情况;B:BVP 对 LPS 诱导的 HGFs 细胞凋亡的影响。1:对照组;2:LPS 组;3:LPS+BVP 低剂量组;4:LPS+BVP 中剂量组;5:LPS+BVP 高剂量组。图 2 BVP 对 LPS 诱导的 HGFs 细胞凋亡及其相关蛋白表达的影响表 2 BVP 对 LPS 诱导的 HGFs 细胞凋亡及其相关蛋白表达的影响组别凋亡率(%)Bax/-actinBcl-2/-actinCaspase-3/-actin对照组3.78 0.520.27 0.041.01 0.110.38 0.05LPS 组28.73 2.340.98 0.110.25 0.031.05 0.12LPS+BVP 低剂量组19.62 2.130.80 0.080.45 0.050.81 0.09LPS+BVP 中剂量组13.08 1.580.63 0.050.71 0.060.53 0.07LPS+BVP 高剂量组7.64 0.890.41 0.040.87 0.050.34 0.05 注:与对照组比较,P0.05;与 LPS 组比较,P0.05;与 LPS+BVP 低剂量组比较,P0.05;与 LPS+BVP 中剂量组比较,P0.05。2.3 BVP 对 LPS 诱导的 HGFs 细胞迁移的影响使用划痕实验检测细胞的迁移能力,与对照组比较,LPS 组 HGFs 细胞迁移率显著降低(P 0.05);与 LPS 组比较,LPS+BVP 低、中、高剂量组细胞迁移率呈 BVP 浓度依赖性升高(P 0.05)(图 3、表 3)。2.4 BVP 对 LPS 诱导的 HGFs 细胞炎症因子 TNF-、IL-1、IL-6 表达的影响 ELISA 实验结果显示,与对照组比较,LPS 组HGFs 细胞培养液中 TNF-、IL-1、IL-6 表达水平显著升高(P0.05)。与 LPS 组比较,LPS+BVP 低、中、高剂量组HGFs 细胞培养液中 TNF-、IL-1、IL-6 表达水平显著降低(P0.05)(表 4)。表 3 BVP 对 LPS 诱导的 HGFs 细胞迁移的影响组别迁移率(%)对照组95.56 3.49LPS 组31.42 2.63LPS+BVP 低剂量组47.33 3.56LPS+BVP 中剂量组68.08 4.54LPS+BVP 高剂量组82.35 4.23 注:与对照组比较,P 0.05;与 LPS 组比较,P0.05;与 LPS+BVP 低剂量组比较,P 0.05;与 LPS+BVP 中剂量组比较,P0.05。1:对照组;2:LPS 组;3:LPS+BVP 低剂量组;4:LPS+BVP 中剂量组;5:LPS+BVP 高剂量组。图 3 BVP 对 LPS 诱导的 HGFs 细胞迁移的影响(100)66晁晓芹,等.灯盏花素对牙龈卟啉单胞菌脂多糖诱导的人牙龈成纤维细胞损伤的影响表 4 BVP 对 LPS 诱导的 HGFs 细胞炎症因子 TNF-、IL-1、IL-6 表达的影响组别TNF-(ng/L)IL-1(ng/L)IL-6(ng/L)对照组53.42 6.8987.35 9.6568.43 13.35LPS 组118.46 15.36408.64 65.23238.47 30.32LPS+BVP 低剂量组98.35 12.35324.53 41.29172.38 20.45LPS+BVP 中剂量组83.58 8.46210.71 26.33126.44 15.33LPS+BVP 高剂量组64.63 6.58123.52 12.5591.56 8.38 注:与对照组比较,P0.05;与 LPS 组比较,P0.05;与 LPS+BVP 低剂量组比较,P0.05;与 LPS+BVP 中剂量组比较,P0.05。2.5 BVP 对 LPS 诱导的 HGFs 细胞 SOD、MDA 与 ROS的影响 试验检测 SOD、MDA 和 ROS 活性,结果显示,与对照组比较,LPS 组 HGFs 细胞 SOD 活性显著降低,MDA、ROS 水平显著升高(P 0.05);与 LPS 组比较,LPS+BVP 低、中、高剂量组 HG-Fs 细胞 SOD 活性显著升高,MDA、ROS 水平显著降低(P0.05)(表 5)。表 5 BVP 对 LPS 诱导的 HGFs 细胞 SOD、MDA 与 ROS 的影响组别SOD(kU/g)ROS(%)MDA(nmol/mg)对照组185.67 15.23100.002.97 1.21LPS 组74.65 7.73269.47 20.2513.52 3.14LPS+BVP 低剂量组105.33 8.25201.39 15.1610.54 2.75LPS+BVP 中剂量组137.83 10.41171.58 10.457.62 2.23LPS+BVP 高剂量组164.91 8.75135.26 8.365.31 1.64 注:与对照组比较,P0.05;与 LPS 组比较,P0.05;与 LPS+BVP 低剂量组比较,P0.05;与 LPS+BVP 中剂量组比较,P0.05。3 讨论BVP 是灯盏花的主要活性成分,具有抗炎、抗氧化和抗血管生成等作用,在肿瘤与炎症疾病中具有良好的应用前景7-8。据报道,BVP 可通过抑制 LPS 所致小鼠巨噬细胞内 ROS 升高而保护线粒体功能,发挥细胞保护作用9。BVP 可以抑制高糖诱导的人视网膜色素上皮(RPE)细胞氧化损伤和凋亡的发生10。此外,在脑缺血再灌注(ische-mia/reperfusion,I/R)损伤大鼠模型中,BVP 可有效降低 I/R 损伤组织中炎性细胞因子表达、氧化应激及促凋亡蛋白表达,抑制核转录因子-B(nu-clear transcription factor-B,NF-B)信号通路和小胶质细胞的活化,改善脑 I/R 诱导的损伤和大鼠的神经功能11。Cyclin B1、Cyclin D1 为细胞周期调节蛋白,Cyclin B1 促进 G/M 期转换,Cyclin D1 可调节 G1/S 期转换,其水平升高可促进细胞增殖。Bax 与 Bcl-2 为促凋亡与抗凋亡蛋白,Bax 表达水平升高促进细胞凋亡,而 Bcl-2 则发挥抗凋亡作用,Caspase-3 可降解细胞内的功能蛋白和结构蛋白,促进细胞死亡。本研究结果显示,LPS 诱导的HGFs 细胞凋亡率、Bax、Caspase-3 蛋白表达水平显著升高,细胞存活率、迁移率、Cyclin B1、Cyc-lin D1、Bcl-2 蛋白表达水平显著降低,而使用不同浓度的 BVP 处理 LPS 诱导的细胞后,HGFs 细胞凋亡率、Bax、Caspase-3 蛋白表达水平均降低,细胞存活率、迁移率、Cyclin B1、Cyclin D1、Bcl-2 蛋白表达水平均升高,表明 BVP 可抑制 LPS 诱导的HGFs 凋亡,促进其增殖和迁移,减轻 HGFs 细胞损伤。HGFs 能够产生多种炎症相关因子,发挥抗炎作用,而经过 LPS 刺激,可放大炎症反应,过度释放炎症因子(TNF-,IL-1 等),使牙周炎加重12。研究表明,在大鼠颅脑损伤模型中,BVP预处理可减少脑组织炎症因子 TNF-和 IL-1 水平,抑制炎症损伤13。本研究发现,经 LPS 处理的 HGFs 细胞上清液中 TNF-、IL-1、IL-6 表达水平均升高,而 25、50、100 mol/L 的 BVP 处理细胞后,HGFs 细胞上清液 TNF-、IL-1、IL-6 表达水平均降低,表明 BVP 可抑制 LPS 诱导的 HGFs细胞炎症因子的释放,减轻 LPS 所致 HGFs 细胞炎症损伤。SOD 是细胞内的抗氧化酶,其水平高低可反映细胞抗氧化能力,MDA 与 ROS 可反映细胞的氧化损伤程度14-15。研究显示,大鼠皮质神经元缺氧/复氧损伤模型中,BVP 可增加 SOD 的表达,降低细胞内 MDA 水平,抑制神经元细胞内76医学分子生物学杂志,2024,21(1):063-068 J Med Mol Biol,2024,21(1):063-068ROS 水平,保护缺氧/复氧诱导的神经元氧化损伤16。在本研究中,LPS 处理的 HGFs 细胞中 SOD活性降低,MDA、ROS 水平升高,而不同浓度的BVP 处理 HGFs 细胞后,细胞 SOD 活性升高,MDA、ROS 水平降低,表明 BVP 可通过抗氧化作用抑制 LPS 诱导的 HGFs 细胞氧化损伤。综上所述,BVP 可通过抗炎、抗氧化作用减轻 LPS 诱导的 HGFs 细胞损伤,对牙周疾病中的应治疗有一定潜在价值,但其具体作用机制仍需进一步研究。参考文献1 李坤阳,陈栋,左春然,等.姜黄素通过上调 miR-124 抑制牙龈卟啉单胞菌 LPS 诱导的人牙龈成纤维细胞炎症反应J.中国病理生理杂志,2020,36(10):1867-1874.2 刘瑜,李树锦,张森林,等.牙龈卟啉单胞菌脂多糖促进牙龈成纤维细胞的自噬J.细胞与分子免疫学杂志,2017,33(3):315-319.3JIANG S,HU Y,DENG S,et al.miR-146a regulates in-flammatory cytokine production inporphyromonas gingival-is lipopolysaccharide-stimulated B cells by targeting I-RAK1 but not TRAF6J.Biochim Biophys Acta Mol Ba-sis Dis,2018,1864(3):925-933.4 杨迎春,任占川,陈新骥.大鼠脑缺血再灌注后环氧合酶-2 促进 E-选择素表达增多及灯盏花素的脑保护作用J.解剖学报,2018,49(6):703-707.5 LIU Y,WEN P H,ZHANG X X,et al.Breviscapine amel-iorates CCl4 induced liver injury in mice through inhibi-ting inflammatory apoptotic response 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