碱性蛋白发酵工艺设计.doc

年产3吨碱性蛋白酶发酵工艺设计
王鑫
（中北大学化工与环境学院）

摘要
在现代食品工业中, 酶的应用几乎涉及到食品加工的各个领域。随着酶制剂日益广泛的应用,经济效益显著。蛋白酶是水解蛋白质肽链的一类酶的总称, 而碱性蛋白酶则适宜在碱性条件( pH9——11) 下水解动植物蛋白质, 广泛存在于动植物及微生物中。设计中一方面根据参考资料选定了碱性蛋白酶发酵生产的具体工艺流程，通过物料衡算拟定需要 立方米发酵罐 台和 立方米种子罐 台，在此基础上得出发酵工段所需要的各种原料量，通过能量衡算拟定水、无菌空气和蒸汽等的消耗量。然后对重要设备进行计算和选型，得出发酵罐、种子罐及通用设备、非标准设备等的结构尺寸、冷却装置、传动装置，根据工艺规定拟定罐的附属设备和辅助设备以及发酵过程中的优化控制。
根据计算结果，设计了两张图纸，分别为发酵罐装配图、工艺流程图。
关键词：碱性蛋白酶 发酵罐 种子罐 物料衡算

1绪论 1
1.1碱性蛋白酶概述 1
1.2碱性蛋白酶的性质 1
1.3碱性蛋白酶的使用条件 1
1.4碱性蛋白酶的保存 1
1.5注意事项 1
1.6碱性蛋白酶的重要应用 2
1.6.1在洗涤剂中的应用 2
1.6.2在皮革中的应用 2
1.6.3在饲料添加剂中的应用 3
1.6.4在纺织行业的应用 3
1.6.7在玉米深加工中的应用 3
1.7碱性蛋白酶的发展前景 4
2设计任务 4
2.1设计内容 4
2.2设计规定 4
3碱性蛋白酶生产工艺选择 5
3.1生产工艺的选择 5
3.2工艺流程图 5
3.3工艺流程图说明 6
3.3.1菌种的制备 6
3.3.2孢子的制备 6
3.3.3种子的制备 6
3.4菌种的改良 6
3.5培养基的制备 8
3.6灭菌的方法 8
3.6.1湿热灭菌 8
3.6.2培养基的连续灭菌 9
3.6.3空气除菌 9
3.6.4无菌空气的质量标准 10
3.6.5无菌空气的制备 10
3.7发酵 11
3.8分离纯化 12
4工艺计算 12
4.1 碱性蛋白酶发酵工艺技术指标 12
4.2 工艺参数与基本物性数据的选取 12
4.2.1 工艺参数 12
4.2.2基本物性数据的选取 13
4.3物料衡算 13
4.4热量衡算 14
4.4.1 基准温度的选定 14
4.4.2 连消塔的热量衡算 14
4.4.3 发酵罐的热量衡算 14
5分离干燥 14
5.1双水相萃取 14
5.2干燥 15
6后记 16
参考文献： 17

1绪论
1.1碱性蛋白酶概述
碱性蛋白酶是由细菌原生质体诱变选育出的地衣芽孢杆菌2709，经深层发酵、提取及精制而成的一种蛋白水解酶，其重要成分为地衣芽孢杆菌蛋白酶，是一种丝氨酸型的内切蛋白酶，它能水解蛋白质分子肽链生成多肽或氨基酸，具有较强的分解蛋白酶的能力。生产工艺是采用微滤超滤膜分离、喷雾干燥或真空冷冻干燥等先进技术，广泛应用于食品、医疗、酿造、洗涤、丝绸、制革等行业。
碱性蛋白酶是目前市场上流行的洗涤添加剂，能大幅度提高洗涤去污能力，特别对血渍、汗渍、奶渍、油渍等蛋白类污垢，具有独特的洗涤效果。碱性蛋白酶在技术采用细菌原生质体诱变解决方法，从国内碱性蛋白菌生产菌2709枯草杆菌中研究选育出若干稳定高性能菌株，在后解决上，采用去渣盐析沉淀法，减少了蛋白酶的杂质含量和产品特有的气味，提高了溶解速度，与洗涤剂有更好的配伍性，延长了保质期。目前，在世界范围内蛋白分解酶是工业酶种中用得最多的一种酶，约占酶总量的60%，其中碱性蛋白酶就占25%.它在商业中的巨大应用前景及在基础研究中的重要作用，吸引着国际国内的许多公司及研究单位竞相对其进行多方面的研究。
1.2碱性蛋白酶的性质
碱性蛋白酶外观为褐色粉末，有酵曲的特殊臭味，可以分解蛋白质分子中的肽键成为小分子的氨基酸和肽。碱性蛋白酶是由造育的地衣芽孢杆菌发酵而得，重要成分为枯草杆菌蛋白酶，是一种内切酶，催化部位为丝氨酸，分子量约为27300.
1.3碱性蛋白酶的使用条件
底物浓度10—25%，温度50—60℃，pH值9—11，反映时间3—6小时（根据规定可长可短），添加酶0.03—0.06%（以水解溶液重量计）。
1.4碱性蛋白酶的保存
5℃保藏，保质期一年；25℃储存，酶活保存期至少3个月以上。
1.5注意事项
（1）此产品可完全溶于水，使用安全可靠。操作时请勿直接与酶制剂接触，若有接触需及时用清水冲洗。
（2）原包装打开后尽快食用，剩余部分需扎口保存。
（3）本品在贮存中要避免雨淋和曝晒，严禁与有毒有害物质混运混存。

1.6碱性蛋白酶的重要应用
1.6.1在洗涤剂中的应用
平常生活中碰到的污垢，特别是衣服上的污垢组成是十分复杂的，一般来说，重要有尘土的微粒、人体分泌的皮脂和汗液、食物的汁液和残余物等，有机污垢是以蛋白质与纤维结合的方式存在的。用于洗涤这些污物的洗涤剂是由表面活性剂、纯碱、水玻璃(硅酸盐)、三磷酸盐等配制而成，洗涤时水溶液显示出较高的碱性pH一般在9-11之间，在这种条件下，碱性蛋白酶正好可以发挥其催化活性，催化污物中的蛋白质水解，使复杂的蛋白质分解成结构简朴、相对分子量较小的水溶性肤，或者进一步分解为氨基酸。这样，本来粘在衣物上的其它污物也可以一起被洗下来。在整个洗涤过程中，碱性蛋白酶可反复起分解蛋白质的作用，只是酶活越来越低。
1.6.2在皮革中的应用
我国皮革工业资源丰富，发展十分迅速，猪、羊皮产量居世界之首。猪、牛、羊皮制革时，一方面要除去皮上的毛，然后才干进一步加工蹂制成革。过去脱毛工艺沿用石灰、硫化钠浸渍，不仅时间长，工序多，并且劳动强度大，污染严重。采用蛋白酶脱毛是运用酶分解毛、表皮同真皮层连接处的蛋白质，从而使毛同皮的联结松开而脱毛。目前，我国的皮革制品不仅满足了国内市场的需求，还大量出口创汇。此外，在猪皮加工的包酶阶段，因皮液系统pH值约在10士0.5之间，故常用碱性蛋白酶进行局部解决

1.6.3在饲料添加剂中的应用
猪、禽等单胃动物消化道的内源酶系不全;幼龄畜禽缺少淀粉酶、糖化酶和蛋白酶：处在疾病的畜禽，其内源酶(如淀粉酶、蛋白酶等)急剧下降。动物饲料是以淀粉、蛋白质等大分子化合物作为营养源，不同动物消化道中的酶系不同，数量也很有限，再加上饲料在消化道中停留的时间一般都很短，饲料往往未被充足消化就随粪便排出体外，导致部分浪费。据研究，不少动物对饲料的消化吸取率仅20%左右。在饲料中添加酶制剂就可以与动物内源酶发挥协同作用，将难消化吸取的蛋白质、淀粉等大分子化合物降解为氨基酸、肤、脉、单糖、寡糖等小分子物质，从而提高饲料的消化率和运用率，并提高畜禽及鱼类的生产性能，同时可以减少畜禽排泄物中氮、磷的排泄量，保护水体和土壤免受污染。饲用酶制剂多为复合酶，由非内源消化酶和内源消化酶两大类组成。非内源消化酶涉及木聚糖酶、p-葡聚糖酶、纤维素酶、果胶酶、甘露聚糖酶等，内源消化酶涉及蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等。其中蛋白酶是重要成分，可将饲料中的蛋白质分解多肽及游离氨基酸，从而提高饲料的运用率。
1.6.4在纺织行业的应用
在纺织工业中应用碱性蛋白酶可一定限度的取代强碱等有毒有害物质，为减少污染、保护生态环境提供经济有效的方法。特别是在羊毛减量加工和丝绸精炼脱胶等方面具有广泛应用，使用碱性蛋白酶可以解决羊毛仿羊绒物质的生硬、粗糙等问题，并能改善和提高丝绸与棉、麻、毛等纤维混纺产品的手感和风格，增长羊毛产品的附加值。
1.6.7在玉米深加工中的应用
玉米黄粉是玉米湿法淀粉厂的副产品，其中具有40%-60%的蛋白质，这些蛋白质大部分是醇溶蛋白、谷蛋白和球蛋白。玉米醇蛋白具有大区域的a-螺旋结构，N-末端有很强的疏水性，是高憎水蛋白，因此只能溶于异丙酮和乙醇中，不溶于水。谷蛋白只溶于碱水溶液。因此与其它商业化蛋白源相比，玉米蛋白的疏水性使得其食品功能特性极差。要想使蛋白质具有抱负的食品功能，就必须使其成为水溶解状态或处在较好的悬浮状态。为了提高玉米蛋白的水溶性以制备一些特殊产品，用碱性蛋白酶修饰玉米蛋白使其成为可溶性肤的研究成为热点。王梅谷等对碱性蛋白酶水解玉米蛋白的反映动力学进行了研究，探索了酶法修饰玉米蛋白的可行性，在适宜的反映体系中，可大幅度提高酶促玉米蛋白的溶解量。为玉米黄粉的食品工业应用和饲料营养的特殊规定提供可靠的依据。玉米鼓质白质具有独特的氨基酸组成，使它成为多种生理活性功能肤的良好天然来源。
1.7碱性蛋白酶的发展前景
蛋白酶是一种重要的工业用酶，占世界酶制剂销售量的60%以上。上世纪五十年代蛋白酶的重要来源是植物的木瓜蛋白酶，菠萝蛋白酶和动物内脏，而微生物来源的蛋白酶一经研究，因具有培养简便，耗时短，产量丰富等优点，应用尤为广泛，被认为是最重要的酶资源。水解蛋白的最适PH在碱性范围内的蛋白酶称为碱性蛋白酶。它在工业上具有巨大的应用潜力，如洗涤剂、皮革制造、食品加工、制药以及废物解决等工业中，碱性蛋白酶的使用能显著改善产品品质，大大减少了对环境的污染，节约成本，为传统的行业和生产带来了一场革命。特别是作为无磷洗衣粉的添加剂使用，已使碱性蛋白酶商业制剂的销售占整个蛋白酶市场的1/3。由于碱性蛋白酶作用环境的特殊性，规定其在极端的条件下具有较高的蛋白质水解活力。其克服不良环境的能力愈强，应用愈广泛，愈能耐受恶劣的工业条件。

2设计任务
2.1设计内容
涉及菌种选育、培养基的设计及灭菌、空气除菌（如为需氧发酵）、种子的扩大培养、发酵过程中的控制参数和下游加工等，并由此形成一套完整的生产工艺。
2.2设计规定
按照年产量规定进行工艺设计，不得导致设备浪费，节约人力、物力和能源。进行简朴的物料衡算。绘制设计图，规定至少一张工艺流程图和一张主设备结构图，A4纸。

3碱性蛋白酶生产工艺选择
3.1生产工艺的选择
采用液态深层发酵
3.2工艺流程图
空气 菌种 培养基 离心分离 PEG盐

预热 冷冻干燥
除菌
连消 产品

无菌空气 二级种子 维持

降温

发酵液

高压匀质机

离心分离

废液项 PEG水相

3.3工艺流程图说明
3.3.1菌种的制备
选择枯草芽孢杆菌2709，通过度离、选育、纯化和鉴定后成为菌种。菌种可用沙土管保存，若有条件可采用液氮超低温保存。
3.3.2孢子的制备
（1）制备母液斜面孢子
将保存在冰箱中的沙土孢子，在无菌超净工作台上接种于以灭菌的斜面培养上于37℃培养9-10天，放入2-6℃冰箱中备用。
（2）制备子瓶斜面孢子
将生长好且在冰箱存放一周以上的母瓶取出，制成菌悬液接种于子瓶斜面上，于37℃恒温培养8-9天，培养好的子斜面侧摇瓶效价合格后保存在2-6℃冰箱中备用。
3.3.3种子的制备
其目的是使孢子发芽、繁殖以获得足够数量的菌丝，并接种到发酵罐中，种子制备可用摇瓶培养后再接入种子罐进行逐级扩大培养。以微孔压差法或打开接种口在火焰保护下接种。接种量视需要而定，在罐内培养过程中需要搅拌和通入无菌空气。控制罐温、罐压，并定期取样做无菌实验，观测菌丝形态，测定种子液中发酵单位和进行生化分析，并观测有无杂菌的情况种子质量合格后移到发酵罐中。

3.4菌种的改良
菌种改良的方法有很多，最常用的方法有诱变育种。诱变育种的原理：是用物理或化学的诱变剂使诱变对象内的遗传物质（DNA）的分子结构发生改变，引起性状变异并通过筛选获得符合规定的变异菌株的一种育种方法。诱变的方法：A:物理方法：射线（紫外线、X 光线、Y 射线，中子线），激光 微束，离子束，微波，超声波，热力等。 B:化学诱变 常用方法：浸渍法、涂抹法、 滴液法、注射法、施入法和熏蒸法。化学诱变剂有碱基类似物、烷化剂，移码诱 变剂，硫酸二乙酯（DFS）、5-溴尿嘧 啶（5－BU）、氮芥（Nm）。C: 生物方法：空间条件解决诱变，病原微生物诱变，转基因诱变。
出发菌株
诱变育种的过程

原种特性考察

斜面

制备单孢子菌悬液

做活菌计数，记录存活率

诱变解决

观测菌株形态

稀释涂平板

挑取单菌落传种斜面

摇瓶初筛

挑出高产斜面

埋制沙土管

留种保藏

传种斜面

复筛，摇瓶次数

摇瓶复筛

挑出高产菌株做稳定性实验和菌种特性考察

放大罐实验，中试考察

大型投产

3.5培养基的制备
培养基是指可供微生物细胞生长繁殖所需的一组营养物质和原料，同时也为微生物生长提供除营养外的其他生长所需的条件。原则上①必须具有细胞组成所必须原料；②满足一般生化反映的基本条件（温度、溶氧和批pH）；③来源丰富、价格低廉、取材方便、质量稳定；④培养基成分性质稳定不影响下游产品的提取加工。
培养基按照用途可以提成孢子培养基、种子培养基和发酵培养基。
孢子培养基是供菌种繁殖孢子的一种常用固体培养基，对这类培养基的规定是能使菌体生长迅速,产生数量多并且优质的孢子,并且不会引起菌体变异。所以孢子培养基的配置规定如下：①培养基的营养不要太丰富，特别是有机氮源要低一些，否则孢子不易形成。②无机盐的浓度要适当,不然会影响孢子的颜色和数量。③应注意培养基的pH值和湿度。

3.6灭菌的方法
常用的灭菌方法有：化学灭菌；射线灭菌；干热灭菌；湿热灭菌和过滤除菌等。影响灭菌效果的因素：①微生物的种类和数量，②培养基性质、浓度、成分，③灭菌的温度、时间。
本实验采用湿热灭菌。湿热灭菌即运用饱和水蒸气进行灭菌。由于蒸汽有很强的穿透力，并且冷凝时放出大量的冷凝热，很容易是蛋白质凝固而杀灭各种微生物。通常蒸汽灭菌的条件是在121℃（表压约0.1MPa）维持30min。
3.6.1湿热灭菌
对培养基进行湿热灭菌时，培养基中的微生物受热死亡速率与残存数量成正比，即 （3—1）
式中：N 培养基中活微生物的个数；τ为微生物受热时间，s； κ为比死亡速率，；若开始灭菌时（τ=0），培养基中或微生物数为N0，将式（3—1）积分可得
（3—2）
上式被称为对数残留定律。其中N为经τ时间灭菌后培养基中活微生物数。

3.6.2培养基的连续灭菌
培养基连续灭菌在短时间内被加热到灭菌温度(130～140),短时间保温（一般为5～8min），升降温时间相对较短，可以实现自动控制、提高发酵罐的设备运用率、蒸汽用量平稳等优点，培养基在短时间内被加热到灭菌温度，短时间保温后被快速冷却，再进入早已灭完菌的发酵罐，这样不仅可以节省时间，更重要的是减少了培养基的破坏率。对补料培养基的灭菌方法跟发酵培养基的灭菌方法同样都是湿热灭菌，其加热蒸汽的压力规定较高，一般不小于0.45Mpa.连续灭菌的流程，如图所示

3.6.3空气除菌
根据国家药品质量管理规范的规定，生物制品、药品的生产场地业需要符合空气洁净度的规定。

3.6.4无菌空气的质量标准
国家所规定无菌空气的质量标准为：1、连续提供一定流量的压缩空气。2、空气的压强为0.2~0.4Mpa。3、进入过滤器前空气的相对湿度应小于等于70.4、进入发酵罐的空气温度可比培养基温度高10~30℃左右。5、压缩空气的洁净度，在设计空气过滤器时，一般取失败概率为0.001为指标。

3.6.5无菌空气的制备
过滤是空气除菌的重要手段，按过滤介质孔隙将空气过滤器分为两类：绝对过滤，深层过滤。后者重要原理为：1、惯性滞留作用2、拦截滞留作用3、布朗扩散作用4、重力沉降5、静电作用。
其过滤除菌流程为：采风塔→粗过滤器→空气压缩机→空气储存罐→冷却器→气液分离设备→空气加热设备→空气过滤设备。如图5-1。

图5-1 空气除菌设备流程图
设备如下：
①采风塔：采风塔建在工厂的上风头，远离烟囱，采风塔越高越好，高至少10 m,气流速度8 m/s。
②粗过滤器：安装在空压机吸入口前，重要作用是拦截空气中较大的灰尘以保护空气压缩机，同时起一定的除菌作用，减轻总过滤器的承担。应阻力小，容量大。
③空气压缩机：作用是提供动力，以克服随后各设备的阻力。
④空气储罐：作用是消除压缩空气的脉动。
规定：H/B=2～2.5 ， V=（0.1～0.2）V1
其中，H为罐高；
B为罐直径；
V1为空压机每分钟排气量（20℃，1×105Pa状况下），
⑤旋风分离器：是运用离心力进行气-固或气-液沉降分离的设备。作用是分离空气中被冷却成雾状的较大的水雾和油雾粒子。
⑥冷却器：空压机出口温度气温在120℃左右，必须冷却。此外在潮湿的地区和季节还可以达成降湿的目的。空气冷却器可采用列管式热互换器空气走
壳程，管内走冷却水。
⑦丝网除沫器：可以除去空气中绝大多数的20µm 以上的液滴和1µm以上的雾滴，一般采用规格为直径0.25㎜×40孔且高度为150㎜的不锈钢丝网。
⑧空气加热器：采用列管换热器，空气走管程，蒸汽走管外。
⑨总过滤器：填充物按下面顺序安装：
孔板 →铁丝网→麻布 → 活性炭 → 麻布 → 棉花 → 麻布→ 铁丝网→ 孔板
介质要紧密均匀，压紧一致，上下棉花层厚度为总过滤层厚度的1/4，中间活性炭层为1/3。
无菌空气的检查
空气系统的无菌检测重要考察过滤器是否失效。过滤器失效的检测方法之一是检测过滤器两侧的压降，压降大说明过滤介质被堵塞；二是用粒子计数器测定空气中的粒子数是否超标，有无达成洁净度规定。
3.7发酵
以2％的接种量接种于发酵培养基，35℃培养56小时，进行液体深层发酵培养；在发酵过程中，采用调节pH的方法控制发酵，即：将种子接种于发酵培养基后，使发酵液初始pH为7；在发酵期间，当发酵液酸性逐渐增长时，应控制发酵液pH不低于6.0；随后，当发酵液碱性逐渐增长时，应控制发酵液的pH不高于8.0。
3.8分离纯化
工业中使用的基本都是碱性蛋白酶的粗制品，进一步的分离纯化有助于更好地拟定酶的性质及作用机制。 以菌株的发酵液为解决对象，一方面离心除去菌体细胞及其它不溶性物质，对无细胞发酵液进行沉淀，达成分离和浓缩的目的。再通过等电层析、亲和层析等不同的色谱层析手段对碱性蛋白酶进一步纯化。

4工艺计算
4.1 碱性蛋白酶发酵工艺技术指标
指标名称
单位
指标数
生产规模
t/a
3
生产方法
深层液态发酵
年生产天数
d/a
100
产品日产量
t/a
0.03
产品质量
比活力（U/g）
50万
倒罐率
%
1.0
发酵周期
h
36
发酵液酶活力
U/ml
18000
碱性蛋白酶提取率
%
85
冷冻干燥酶收率
%
80
平均总收率率
%
68

4.2 工艺参数与基本物性数据的选取
4.2.1 工艺参数
碱性蛋白酶比活力比活力为50万U/g，生产周期为36h，发酵温度为37℃，溶氧为0.03-0.04MPa。

4.2.2基本物性数据的选取
在低温下油或油脂的平均热容在2.05-2.51kJ/(kg·℃)，随着温度升高比热将增长。
4.3物料衡算
根据物料衡算的质量守衡定律，在间歇操作过程中，若系统内不发生物料量的积累，输入的物料量等于输出的物料量。
表1 物料的基本物性参数

密度（kg/m3）
汽化替热
kJ/kg
比热容
kJ/(kg·℃)
沸点(℃)
培养基
1000

4.183

水
998
2258
4.183
100
生产1000kg比活力为50万U/g的发酵液量：
50万U/g×1000×1000=108万U
108万U/18000=2.78×107ml=27.8m3
18000U/ml –发酵液酶活
每日所需量
V0=V发/(0.68×0.7)=0.278/(0.68×0.7)=1.75m3
0.68—平均总收率 0.7—填充系数
发酵液所需淀粉量:1.75×2%=0.035kg
发酵液所需麸皮量:1.75×5%=0.0875kg
发酵液所需玉米浆量:1.75×3%=0.0525kg
二级接种量：V2=1%V1=0.0175m3
吐温-80(M / V)：0.02%×1.75=0.00035kg
MgSO4(M / V)：0.02%×1.75=0.00035kg
发酵罐的尺寸个数：
尺寸：2立方米 个数;1个

4.4热量衡算
4.4.1 基准温度的选定
为便于计算，热量输入和输出的基准温度选为20℃(293K)。
4.4.2 连消塔的热量衡算
Q=Gc(t2-t1)=13406×3.91×(115-70)=2.36×106(kJ/h)
4.4.3 发酵罐的热量衡算
发酵时放出的生物热：Q总=4.18×6000×102.14=2.56×106(kJ/h)
5分离干燥
5.1双水相萃取
萃取原理:将亲水性聚合物加入水中会形成两相聚合物以不同的比例分派与这两相中，而水分在每一相中都会占很大的比例(85%-95%)，生物蛋白质等在这种体系中可以保持自然活性。
当两种聚合物的水溶液互相混合时，究竟是分层成两相，还是混合成一相，取决于两种因素，一是混合熵的变化，二是分子间的作用力。对大分子而言，则分子间的作用力占主导地位，也就是说，由分子间的作用力决定混合的结果。
若两种聚合物的分子间存在斥力，那么再某一分子的周边就也许系同种分子而非异种分子。当达成平衡后则提成两相，两种聚合物分别进入到每一相中，达成分离的目的。反过来，假如两种聚合物之间存在引力，如在带相反电荷的两种聚合物电解质之间，则它们互相结合而存在于同一相中，若两种聚合物间不存在分子间力，则它们互相混合。根据上述分析可知，可以进行双水相萃取的必要条件是：形成的两种聚合物分子间存在引力。
双水相萃取中，影响分派的重要参数有聚合物的分子质量和浓度、pH、盐的种类和浓度、操作稳定等。聚合物分子质量低时，生物大分子易分派于富含该聚合物的相中，当远离临界点时，双水相萃取自身受温度的影响很小。大规模生产总是在常温下操作，一则节省制冷费用，再则聚合物在常温下对蛋白质有稳定作用，不会引起损失，同时温度高时，粘度低，有助于相的分离操作。因此，拟定适宜的操作条件，可达成较高的分派系数和选择性。双水相萃取的一个重要优点是可直接从细胞破碎浆液中萃取蛋白质而无需将细胞碎片分离，一步操作可达成固液分离和纯化两个目的。
双水相萃取方法： 双水相萃取法的一个重要应用是胞内酶的提取，采用双水相系统可使欲提取的酶与细胞碎片以较大的分派系数分派在不同的相中，进而采用离心法就可实现分离。采用双水相萃取时，通常将蛋白质分派在上相(PEG)，细胞碎片分派在下相(盐)。反过来对相的分离不利，由于当上相固含量髙时，分离机的性能会受到影响。在操作时，单位重量相系统中料浆的加入量是一个重要参数。显然，料浆的加入量愈多愈经济，但过量的料浆会影响本来聚合物的成相系统，是分派系数减少，结果收率减少。根据经验，一般每1kg萃取系统解决200-400湿菌体为宜。
5.2干燥
冷冻干燥原理：冷冻干燥是将湿物料在较低温度下冻结成固态，然后在高度真空(130Pa-0.1MPa)下，将其中固态水分直接升华为气态而除去的干燥过程，也称为升华干燥。冷冻干燥也是真空干燥的一种特例。
冷动干燥也可将湿物料不预冻，而是运用高度真空时水分汽化吸热而将物料自行冻结。这种冻结能量消耗小，但对液体物料易产生泡沫或飞溅现象而遭致损失，同时也不易获得多孔性的均匀干燥物。冷冻干燥中升华温度一般为-35℃--5℃，而抽出的水分可在冷凝器上冷冻聚集或直接为真空泵排出。若升华时需要的热量直接由所干燥的物料供应，这种情况下，物料温度减低不久，以至于冰的蒸汽压很低而使升华速率减少。一般情况下，热量由加热介质通过干燥室的间壁供应，因此，既要供应湿物料的热量以保证一定的干燥数率，又要避免冰的融化。
与其他干燥相比，冷冻干燥具有以下特点：
1) 干燥温度低，特别适合于高热敏性物料的干燥，生物制品的干燥。又系在真空下操作，氧气很少，物料中易氧化物质得到了保护，因此，制品中的有效物质及营养成分损失很少。
2) 能保持原物料的外观形状。物料在升华脱水前先进行预冻，形成稳定的固体骨架。干燥后体积形状基本不变，不失原有的固体结构，无干缩现象。
3) 冻干制品具有多孔结构，因而有抱负的速溶性和快速复水性。干燥过程中，物料中溶于水的溶质就地析出，避免了一般干燥方法中因物料水分向表面转移而将无机盐和其他有效成分带到物料表面，产生表面硬化现象。
4) 冷冻干燥脱水彻底(一般低于2%-5%)，质量轻，产品保存期长，若采用真空密封包装，常温下即可运送、保存，十分简便。
但冷冻干燥需要昂贵的专用设备，干燥周期长，能耗较大，产量小，加工成本高。
冷冻干燥流程：冷冻干燥过程分为两个阶段，第一阶段，在低于熔点的温度下，使物料中的固态水分直接升华，大约有98%-99%的水分在这一阶段除去。第二阶段中，将物料温度逐渐升高甚至高于室温，使水分汽化除去，此时水分可以减少到0.5%。冷东干燥系统重要有4部分组成，即冷冻装置、真空装置、水汽去除装置和加热部分，用于生物制品的了扭动干燥流程见带控制点饿工艺流程图。预冷冻和干燥均在一个箱内完毕。带干燥的物料放入干燥室内，开动预冷用冷冻机对物料进行冷冻，随之启动冷凝器和真空装置，实现升华干燥操作。加热器以作冷凝器内化霜之用。第一阶段升华干燥结束后，启动油加热循环泵对干燥室加热升温，使之汽化排除剩余的水分。
6后记
通过本次课程设计使我更扎实的掌握了有关发酵的一系列问题，使本来枯燥乏味的发酵课程变得有趣。
在这过程中碰到了很多问题，从前都未曾涉猎，但通过这次课程设计让我不光懂得了有关发酵的问题，还懂得了CAD的使用，增长了自己各方面的结识，我不断地查找资料，碰到不懂得及时请教丰富了自己的知识面，同时深刻领悟了“致知于行”的意义。从理论到实践的过程是一个很重要的过程终于明白“纸上得来终觉浅，绝知此事要躬行”的意义，纸上谈兵终究不能让自己在所学的领域有多大的成就与奉献，我在这段时间里学到的我觉得比我这一学期的都多，由于这是一种实践和理论的结合。
历时两个星期的课程设计，查阅了大量的资料，在这个过程中我有时候真的心烦，由于找不到碱性蛋白酶的相关资料，但最后还是耐心的寻找，通过去图书馆查阅教辅资料和上网查找再加上向学长学姐请教，终于完毕了这份课程设计，无论质量如何，这都是我精心设计的成果，他让我在完毕了发酵这门课程的同时，把理论付诸于实践，让我对这门课程的了解更加进一步和系统化。

参考文献：
[1] 邓菊云.微生物碱性蛋白酶研究进展[J].现代食品科学技术，2023,11(293)：03-04.
[2] 夏凡，琚争艳.微生物碱性蛋白酶在食品工业中的应用及其安全性研究进展[J]. 山东食品发酵，2023，1(149)：32-35.
[3] Tsuyoshi Nonaka，Masahiro Fujihashi，Akiko Kita，Katsuhisa etal.The crystal structure of an oxidatively stable subtilisin alkaline serine protease，with a Centerminal β barrel do main [J].J.Biol.Chem，Sep 2023，4(3)：11-14.
[4] Kunamneni Adinarayana，Poluri Elllaiah，Davuluri Siva Prasad etal.Purification and Partial Characterization of Thermostable Serine Alkaline Protease from a Newly Isolated B acillus sublitis PE211[J].AAPS PharmSciTech 2023，4(4)：23-26.
[5] 裘娟萍.提高碱性蛋白酶生产效益的措施[J].氨基酸和生物资源，1996，18(2)：32-35.
[6] 苑琳.碱性蛋白酶的发酵与酶学性质的研究[D].天津科技大学.2023.
[7] 邱秀宝，袁影.嗜碱性芽孢杆菌碱性蛋白酶的研究:Ⅱ.1诱变株选育及产酶条件[J].微生物学报，1990，30(2)：129-133.
[8] 吴琼，程建军，杨秋萍等.碱性蛋白酶水解大豆分离蛋白[J].食品工业科技，2023，3(10)：19-23.
[9] 徐子渊，朱青虹，王建华等.碱性蛋白酶发酵条件的研究[J].食品与发酵工业，1984，5(4)：12-16.
[10] 郑铁曾，涂提坤.提高C1213菌碱性蛋白酶活力的研究[J].食品与发酵工业，1993，2(1)：25-31.
[11] 冯清平，薛林贵.复合诱变原生质选育耐热碱性蛋白酶高产菌[J].微生物学报，1996，36(6)：453–459.
[12] 姚刚，程建军，孙鹏.枯草芽孢杆菌发酵产碱性蛋白酶的研究[J].食品科学，2023，(23)：347.
[13] 陈敏恒等.化工原理(上册)[M].化学工业出版社.
[14] 陈敏恒等.化工原理(下册)[M].化学工业出版社.
[15] 陈国豪，余俊棠.生物工程设备[M].化学工业出版社.
[16] 梁世中.生物工程设备[M].中国轻工业出版社.
[17] 吴思方.发酵工厂工艺设计概论[M].中国轻工业出版社.