小麦萌发前后淀粉酶活性的比较.doc

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实 验 报 告
实验课程： 小麦萌发前后淀粉酶活性的比较
学生姓名： xxx
学 号： xxx
专业班级： xxx
2017年 4 月 25 日
实验背景:
淀粉是植物最主要的储藏多糖，也是人和动物的重要食物和发酵工业的基本原料。淀粉经淀粉酶作用生成麦芽糖、葡萄糖等小分子物质而被机体利用。淀粉酶是水解淀粉的糖苷键的一类酶的总称。按照其水解淀粉的作用方式，可以分成α-淀粉酶、β-淀粉酶等。实验证明，在小麦、大麦、黑麦的休眠种子中只含有β-淀粉酶，α-淀粉酶是在发芽过程中形成的，所以在禾谷类萌发淀粉酶的种子和幼苗中，这两类淀粉酶都存在。其活性随萌发时间的延长而增高。本实验以淀粉酶催化淀粉生成还原的性糖的速度来测定酶的活力，淀粉水解成还原性糖，还原性糖能使3，5—二硝基水杨酸还原成棕色的3-氨基，5-硝基水杨酸。可用分光光度计法测定。
一、 实验目的
1、学习分光光度法测定酶活力的原理与方法；
2、了解小麦萌发前后淀粉酶活力的变化。
二、 实验原理
淀粉酶是水解淀粉的糖苷键的一类酶的总称。实验证明，在某些植物如小麦、大麦的休眠种子中只含有β-淀粉酶，α-淀粉酶是在发芽过程中形成的，所以在禾谷类萌发的种子和幼苗中，这两类淀粉酶都存在。其活性随萌发时间的延长而增高。
本实验以淀粉酶催化淀粉生成麦芽糖的速度来测定酶的活力。麦芽糖是还原性糖，能使3，5-二硝基水杨酸还原成棕色的3-氨基5-硝基水杨酸，后者在500 nm处有最大吸光度，而进行定量测定。
三、 实验仪器和试剂
1、实验仪器：
①紫外-可见分光光度计；②离心机；③研钵.
2、实验试剂
①小麦种子（萌发种子10粒、干种子10粒）；②1%氯化钠溶液；③标准麦芽糖溶液；④3，5--二硝基水杨酸溶液；⑤0.02 mol/L 磷酸缓冲液.⑥0.2%淀粉溶液..
四、 实验步骤
1．麦芽糖标准曲线制作
取7支具塞刻度试管，编号，按表 1 加入试剂：
表1 制作麦芽糖标准曲线配方表

充分摇匀，置于沸水浴中煮沸 5 min 。取出后流水冷却，加蒸馏水定容至 20 m L 。以 1 号管作为空白调零点，在 500 nm 波长下比色测定。以麦芽糖含量为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。
2、小麦萌发前后的酶液提取
（1）幼苗酶的提取：取萌发的幼苗10株入研钵，加1 % NaCl 3 ml，研磨成匀浆，0-4 °C下放置20 min。 离心，2000 r/min 10 min .测定上清酶液的总体积。
（2）种子酶的提取：取干燥种子10粒作对照，操作方法同上。
3、二硝基水杨酸法测定酶活力
量取待测酶液1 ml，pH6.9的0.02mol/L磷酸缓冲液稀释10倍，作为酶活力测定物。取6根试管按下表加各物质：
表2

测定各管的A500nm值
五、 数据处理和分析
1、数据记录：
（1）标准曲线：
麦芽糖含量（mg）
0
0.4
0.8
1.2
1.6
2.0
吸光度
0
0.234
0.493
0.698
0.998
1.286

（2）小麦麦芽糖吸光度
试管编号
1
2
3
4
5
6
吸光度
1.105
1.093
2.204
2.120
0.003
0.002
吸光度平均值
1.099
2.162
0．0025
其中1、2号管是小麦干种子，3、4号管是小麦幼苗，5、6号管属于空白管。
2、数据处理和分析
（1）将上面实验数据带入标准曲线直线方程即可计算出对应的麦芽糖含量：小麦干种子液麦芽糖含量：C种子=1.754mg
小麦幼苗液麦芽糖的含量：C幼苗=3.421mg
空白管液麦芽糖含量：C0 =0.035mg
（2）总酶活力单位= (C酶—C0)× n × V酶
式中：C酶为种子酶或幼苗酶分解淀粉产生的麦芽糖的浓度 （mg/ml）；C0为表2中空白管的麦芽糖浓度；n为酶溶液稀释的倍数；V酶为提取酶液的总体积（ml）。
设在40℃、pH 6.9的条件下，3 min内水解淀粉释放1 mg麦芽糖所需要的酶量为1个活力单位（U）。
小麦干种子总酶活力单位=（0.681-0.00159）/20×10*（20/0.5）1.0U=34.4U
小麦萌发种子总酶活力单位=（1.359-0.00159）/20×10*（20/0.5）1.0U=67.7U
由实验数据知萌发种子的酶活力值大约是干种子的两倍，验证了种子在萌发过程中合成了新的淀粉酶。
六、 误差分析和思考题
1、误差分析
①不同的种子质量会有所不同，所含淀粉酶量也会有所不同；
②因离心管为1.5ml，不能装下全部研磨液，可能丧失部分酶；
③干种子较难研磨，有部分酶未分离出来；
④两次测量使用了不同的分光光度计，可能有一定的仪器偏差。
2、思考题
（1）为什么提取酶液的过程应该在0-4 ℃下进行？测定淀粉酶活性时为什么要在40 ℃条件下水解淀粉？
答：提取酶液的过程在0-4 ℃下进行是为了保护酶蛋白，防止其在较高温度下变性，甚至滋生微生物对其进行分解。测定淀粉酶活性时在40 ℃条件下水解淀粉是因为酶活性相对于温度是一个先上升后下降的曲线，在40度左右酶活性最高，因此在40度下进行该实验时所得的数据较为准确。
（2）小麦萌发过程中淀粉酶活性升高的原因和意义是什么？
答：①原因：因为它需要能量,而产生淀粉酶,更多的生产出糖分来进行一系列活动,呼吸,光合等作用；
②意义：小麦种子在萌发过程中淀粉酶活力升高的直接结果是淀粉的水解增多，那么就可以提供较多的能量供应萌发时候的细胞分裂以及细胞生长使用，同时还能够为细胞的生命活动提供原料。能够更快地将储存的有机物中的能量释放出来，保证萌发过程能量供应充足。
七、 参考文献
毕淑峰，胡晓倩，陈向阳. “小麦萌发前后淀粉酶活力比较”实验的改进与探讨.安徽农学通报. 1007-7731( 2013) 03- 29-02
郑集，陈钧辉. 基础生物化学实验( 第三版).北京: 高等教
育出版社，2008
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