膳食纤维含量测定方法.doc

酶-重量法 
1.原理： 
样品分别用α-淀粉酶、蛋白酶、葡萄糖苷酶进行酶解消化以去除蛋白质和可消化的淀粉。总膳食纤维（TDF）是先酶解，然后用乙醇沉淀，再将沉淀物过滤，将TDF残渣用乙醇和丙酮冲洗，干燥称重。不溶性和可溶性膳食纤维（IDF和SDF）是酶解后将IDF过滤，过滤后的残渣用热水冲洗，经干燥后称重。SDF是将上述滤出液用4倍量的95%乙醇沉淀，然后再过滤，干燥，称重。 TDF、IDF和SDF量通过蛋白质、灰分含量进行校正。 
2.适用范围 
AOAC991.43 本方法适用于各类植物性食物和保健食品。 
3.仪器 
3.1烧杯：400或600ml高脚型。 
3.2 过滤用坩埚：玻料滤板，美国试验和材料学会（ASTM）40-60μm，Pyrex 60ml（Corning No.36060 buchner，或同等的）。如下处理： 
（1） 在灰化炉525℃灰化过夜。炉温降至130℃以下取出坩埚。 
（2） 用真空装置移出硅藻土和灰质。 
（3） 室温下用2%清洗溶液浸泡1小时。 
（4） 用水和去离子水冲洗坩埚；然后用15ml丙酮冲洗然后风干。 
（5） 在干燥的坩埚中加0.5g硅藻土，在130℃烘干恒重。 
（6） 在干燥器中冷却1小时，记录坩埚加硅藻土重量，精确至0.1mg。 
3.3 真空装置： 
（1） 真空泵或抽气机作为控制装置。 
（2） 1L的厚壁抽滤瓶。 
（3） 与抽滤瓶相配套的橡皮圈。 
3.4振荡水浴箱： 
（1） 自动控温使温度能保持在98±2℃。 
（2） 恒温控制在60℃。 
3.5 天平：分析级，精确至±0.1mg。 
3.6马福炉：温度控制在525±5℃。 
3.7干燥箱：温度控制在105和130±3℃。 
3.8干燥器：用二氧化硅或同等的干燥剂。干燥剂两周一次在130℃烘干过夜。 

3.9 PH计：注意温控，用pH4.0、7.0和10.0缓冲液标化。 
3.10 移液管及套头：容量100μl和5ml。 
3.11 分配器或量筒： 
（1） 15±0.5ml，供分配78%的乙醇，95%的乙醇以及丙酮。 
（2） 40±0.5ml，供分配缓冲液。 
3.12. 磁力搅拌器和搅拌棒。 
4. 试剂 
全过程使用去离子水，试剂不加说明均为分析纯试剂 
4.1 乙醇溶液： 
（1） 85%：加895ml95%乙醇在1L量筒中，用水稀释至刻度。 
（2） 78%：加821ml95%乙醇在1L量筒中，用水稀释至刻度。 
4.2 丙酮： 
4.3 供分析用酶：在0-5℃下储存。 
（1） 热稳定α-淀粉酶溶液：Cat. No. A3306，Sigma Chemical Co.，St. Louis，MO63178，或 Termamyl 300L，Cat. No. 361-6282，Novo-Nordisk，Bagsvaerd，Denmark，或等效的酶。 
（2） 蛋白酶：Cat. No. P3910，Sigma Chemical Co.，或等效的。当天用MES/TRIS缓冲液中现配50mg/ml酶溶液。 
（3） 淀粉葡糖苷酶溶液：Cat. No. AMG A9913，Sigma Chemical Co.，或等效的。 
4.4 硅藻土：酸洗（Celite 545 AW，No.C8656，Sigma Chemical Co.，或等效的）。 
4.5 洗涤液：两者挑一。 
（1） 铬酸：120g重铬酸钠Na2Cr2O7·2H2O，1000ml蒸馏水和1600ml浓硫酸。 
（2） 实验室用液体清洁剂，预备急需清洗的（Micro，International Products Corp.，Trenton，NJ08016，或等效的）。用水配制2%溶液。 
4.6 MES-TRIS缓冲液：0.05mol/L，温度在24℃时pH值为8.2。 
（1） MES：2-（N-吗啉代）磺酸基乙烷（No.M-8250，Sigma Chemical Co.或等效的）。 
（2） TRIS：三羟（羟甲基）氨基甲烷（No.T-1503，Sigma Chemical Co.或等效的）。 
在1.7L的蒸馏水中溶解19.52gMES和12.2gTRIS，用6mol/L NaOH调pH到8.2，用水定容至2L。（注意：24℃时的pH为8.2，但是，如果缓冲液温度在20℃，pH就为8.3，如果温度在28℃，pH为8.1。为了使温度在20-28℃之间，需根据温度调整pH值。） 

4.7 盐酸溶液：0.561mol//L，加93.5ml6mol/L盐酸到700ml水中，用水定容至1L。 
5. 操作方法 
5.1. 样品制备： 
（1） 固体样品：如果样品粒度＞0.5mm，研磨后过0.3-0.5mm（40-60目）筛。 
（2） 高脂肪样品：如果脂肪含量＞10%，用石油醚去脂。每克样品用25ml，每次提取完静置一会儿再小心将烧杯倾斜，慢慢将石油醚倒出，共洗三次。 
（3） 高碳水化合物样品：如果样品干重含糖＞50%，用85%乙醇去除糖份，每克样品每次10ml，共洗三次轻轻倒出，然后在40℃烘箱中不时翻搅干燥过夜，并研磨过0.5mm筛。 
5.2. 样品消化 
（1） 准确称取双份1.000±0.005g样品（M1和M2），置于高脚烧杯中。 
（2） 在每个烧杯中加入40ml MES-TRIS缓冲液，在磁力搅拌器上搅拌直到样品完全分散。（防止团块形成，使受试物与酶能充分接触）。 
（3） 用热稳定的淀粉酶进行酶解处理：加100μl热稳定的淀粉酶溶液，低速搅拌。用铝箔片将烧杯盖住，在95-100℃水浴中反应30分钟。（ 起始的水浴温度应达到95℃）。 
（4） 冷却：所有烧杯从水浴中移出，凉至60℃。打开铝箔盖，用刮勺将烧杯边缘的网状物以及烧杯底部的胶状物刮离，以使样品能够完全的酶解。用10ml蒸馏水冲洗烧杯壁和刮勺。 
（5） 用蛋白酶进行酶解处理：在每个烧杯中各加入100μl蛋白酶溶液。用铝箔盖住，在60℃持续摇动反应30分钟（开始时的水浴温度应达60℃），使之充分反应。 
（6） pH值测定：30分钟后，打开铝箔盖，搅拌中加入5ml0.561mol/L HCL至烧杯中。60℃时用1mol/L NaOH溶液或1mol/L HCL溶液调最终pH为4.0-4.7。（注意：当溶液为60℃时检测和调整pH，因为在较低温度时pH会偏高。） 
（7） 用淀粉葡糖苷酶溶液酶解处理：搅拌同时加100μl淀粉葡糖苷酶溶液。用铝箔盖住，在60℃持续振摇反应30分钟，温度应恒定在60℃。 
5.3 测定 
5.3.1.总的膳食纤维测定 
（1） 用乙醇沉淀膳食纤维：在每份样品中，加入预热至60℃的95%乙醇225ml，乙醇与样品的体积比为4∶1。 室温下沉淀1小时。 
（2） 过滤装置：用15ml78%乙醇将硅藻土湿润和重新分布在已称重的坩埚中。用适度的抽力把坩埚中的硅藻土吸到玻板上。 

（3） 酶解过滤，用78%乙醇和刮勺转移所有内容物微粒到坩埚中。（注意：如果一些样品形成胶质，用刮勺破坏表面，以加速过滤。） 
（4） 抽真空，分别用15ml的78%乙醇，95%乙醇和丙酮冲洗残渣各2次，将坩埚内的残渣抽干后在105℃烘干过夜。将坩埚置干燥器中冷却至室温。坩埚重量，包括膳食纤维残渣和硅藻土，精确称至0.1mg。减去坩埚和硅藻土的干重，计算残渣重。 
（5） 蛋白质和灰分的测定:取成对的样品中的一份测定蛋白质，用 本书前述或GB-960.52方法测定。用（N×6.25作为蛋白质的转换系数）。 
分析灰分时用平行样的第二份在525℃灼烧5小时，在干燥器中冷却，精确称至0.1mg，减去坩埚和硅藻土的重量，即为灰分重量。 
5.3.2 .不溶性膳食纤维测定： 
（1） 称适量样品按5.2进行酶解，过滤前用3ml水湿润和重新分布硅藻土在预先处理好的坩埚上，保持抽气使坩埚中的硅藻土抽成均匀的一层。 
（2） 过滤并冲洗烧杯，用10ml70℃水洗残渣2次，然后再过滤并用水洗，转移到600ml高脚烧杯，保留用以测定可溶性膳食纤维，按5.3.3。 
（3） 用抽滤装置，分别用15ml78%乙醇，95%乙醇和丙酮各冲洗残渣2次。 
（注意：应及时用78%乙醇、95%乙醇和丙酮冲洗残渣否则可造成不溶性膳食纤维数值的增大。） 
（4）按5.3.1.5用双份样品测定蛋白质和灰分。 
5.3.3.可溶性膳食纤维测定： 
（1） 将不溶性膳食纤维过滤后的滤液收集到600ml高脚烧杯中，对比烧杯和滤过液，估计容积。 
（2） 加约滤出液4倍量已预热至60℃的95%乙醇。或者将滤液和洗过残渣的蒸馏水的混合液调至80g，再加入预热至60℃的95%乙醇320ml。 
（3） 室温下沉淀1小时。下面按5.3.1测定总膳食纤维，从"湿润和重新分布硅藻土……"。 
6. 计算 
TDF、IDF、SDF均用同一公式计算 
膳食纤维（DF，g/100g）测定： 
DF={[（R1+R2）/2]-P-A}/[（M1+M2）/2]×100 

式中：R1和R2=双份样品残留物重量（mg） 
P和A=分别为蛋白质和灰分重量（mg） 
M1和M2=样品重量（mg）