总糖和还原糖的测定──费林试剂比色法.doc

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实验一 总糖和还原糖的测定（一）──费林试剂比色法

目的要求

掌握还原糖和总糖的测定原理，学习用直接滴定法测定还原糖的方法。

实验原理

将一定量的碱性酒石酸铜甲液和乙液等体积混合时，硫酸铜与氢氧化钠反应，生成氢氧化铜沉淀：

2NaOH + CuSO4 = Cu(OH)2 + Na2SO4

所生成的氢氧化铜沉淀与酒石酸钠反应，生成可溶性的酒石酸钾钠铜：

COOK
C
OH
H
C
OH
COONa
H
COOK
C
O
H
C
O
COONa
H
Cu(OH)
2
+
=
Cu + 2H2 H2 O

 在加热条件下，用样液滴定，样液中的还原糖与酒石酸钾钠铜反应，酒石酸钾钠铜被还原糖还原，产生红色氧化亚铜沉淀，还原糖则被氧化和降解，其反应如下：

△

反应生成的氧化亚铜沉淀与费林试剂中的亚铁氰化钾（黄血盐）反应生成可溶性复盐，便于观察滴定终点。

Cu2O + K4Fe(CN)6 + H2O K2Cu2Fe(CN)6 + 2KOH
（氧化亚铜） （淡黄色）

滴定时以亚甲基蓝为氧化－还原指示剂。因为亚甲基蓝氧化能力比二价铜弱，待二价铜离子全部被还原后，稍过量的还原糖可使蓝色的氧化型亚甲基蓝还原为无色的还原型的亚甲基蓝，即达滴定终点。根据样液量可计算出还原糖含量。

试剂和器材

一、试剂
碱性酒石酸铜甲液：称取15g硫酸铜（CuSO4·5H2O）及0.05g亚甲基蓝，溶于蒸馏水中并稀释到1000ml。
碱性酒石酸铜乙液：称取50g酒石酸钾钠及75g NaOH，溶于蒸馏水中，再加入4g亚铁氰化钾［K4Fe（CN）6］，完全溶解后，用蒸馏水稀释到1000ml，贮存于具橡皮塞玻璃瓶中。
0.1％葡萄糖标准溶液：准确称取1.000g经98～100℃干燥至恒重的无水葡萄糖，加蒸馏水溶解后移入1000ml容量瓶中，加入5ml浓HCl（防止微生物生长），用蒸馏水稀释到1000ml。
6mol/LHCl：取250ml浓HCl（35%～38%）用蒸馏水稀释到500ml。
碘－碘化钾溶液：称取5g碘，10g碘化钾溶于100ml蒸馏水中。
6N NaOH：称取120gNaOH溶于500ml蒸馏水中。
0.1%酚酞指示剂。
二、材料
山芋粉 
三、器材
电热恒温水浴锅，调温电炉，250ml锥形瓶，滴定管。

操作方法

一、样品中还原糖的提取
准确称取 2g山芋粉，放在100ml烧杯中，先以少量蒸馏水调成糊状，然后加入50ml蒸馏水，混匀，于50℃恒温水浴中保温20min，不时搅拌，使还原糖浸出混。过滤，将滤液全部收集在100ml的容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，即为还原糖提取液。
二、样品中总糖的水解及提取
准确称取1g山芋粉，放在锥形瓶中，加入6mol/L HCl 10ml，蒸馏水15ml，在沸水浴中加热0.5h，取出1～2滴置于白瓷板上，加1滴I-KI溶液检查水解是否完全。如已水解完全，则不呈现蓝色。水解毕。冷却至室温后加入1滴酚酞指示剂，以6N NaOH溶液中和至溶液呈微红色，并定容到100ml，过滤取滤液10ml于100ml容量瓶中，定容至刻度，混匀，即为稀释1000倍的总糖水解液，用于总糖测定。
三、碱性酒石酸铜溶液的标定
准确吸取碱性酒石酸铜甲液和乙液各5.00ml，置于250ml锥形瓶中，加蒸馏水10ml，加玻璃珠3粒。从滴定管滴加约9ml葡萄糖标准溶液，加热使其在2min内沸腾，准确沸腾30s，趁热以每2s 1滴的速度继续滴加葡萄糖标准溶液，直至溶液蓝色刚好褪去为终点。记录消耗葡萄糖标准溶液的总体积。平行操作3次，取其平均值，按下式计算：

式中：F──10ml碱性酒石酸铜溶液相当于葡萄糖的量，mg；
C──葡萄糖标准溶液的浓度，mg/ml；
V──标定时消耗葡萄糖标准溶液的总体积，ml。
四、样品糖的定量测定
(1) 样品溶液预测定：吸取碱性酒石酸铜甲液及乙液各5.00ml，置于250ml锥形瓶中，加蒸馏水10ml，加玻璃珠3粒，加热使其在2min内沸腾，准确沸腾30s，趁热以先快后慢的速度从滴定管中滴加样品溶液，滴定时要保持溶液呈沸腾状态。待溶液由蓝色变浅时，以每2s 1滴的速度滴定，直至溶液的蓝色刚好褪去为终点。记录样品溶液消耗的体积。
(2) 样品溶液测定：吸取碱性酒石酸铜甲液及乙液各5.00ml，置于锥形瓶中，加蒸馏水10ml，加玻璃珠3粒，从滴定管中加入比与测试样品溶液消耗的总体积少1ml的样品溶液，加热使其在2min内沸腾，准确沸腾30s，趁热以每2s 1滴的速度继续滴加样液，直至蓝色刚好褪去为终点。记录消耗样品溶液的总体积。平行操作3次，取其平均值。
五、结果处理

其中：m──样品重量，g；
式中：F──10ml碱性酒石酸铜溶液相当于葡萄糖的量，mg；
V──标定时平均消耗还原糖或总糖样品溶液的总体积，ml
V1──还原糖或总糖样品溶液的总体积，ml；
1000──mg换算成g的系数。

注意事项

（1）本法是根据一定量的碱性酒石酸铜溶液（Cu2＋量固定）消耗的样液量来计算样液中还原糖含量，反应体系中Cu2＋的含量是定量的基础，所以在样品处理时，不能用铜盐作为澄清剂，以免样液中引入Cu2＋，得到错误的结果。
（2）碱性酒石酸铜甲液和乙液应分别贮存，用时才混合，否则酒石酸钾钠铜络合物长期在碱性条件下会慢慢分解析出氧化亚铜沉淀，使试剂有效浓度降低。
（3）滴定必须是在沸腾条件下进行，其原因一是加快还原糖与Cu2＋的反应速度；二是亚甲基蓝的变色反应是可逆的，还原型的亚甲基蓝遇空气中的氧时会再被氧化为氧化型。此外，氧化亚铜也极不稳定，易被空气中的氧所氧化。保持反应液沸腾可防止空气进入，避免亚甲基蓝和氧化亚铜被氧化而增加消耗量。
（4）滴定时不能随意摇动锥形瓶，更不能把锥形瓶从热源上取下来滴定，以防止空气进入反应溶液中。
（5）样品溶液应预测，其目的：一是本法对样品溶液中还原糖浓度有一定要求（0.1%左右），测定时样品溶液的消耗体积应与标定葡萄糖标准溶液时消耗的体积相近，通过预测可了解样品溶液浓度是否合适，浓度过大或过小应加以调整，使预测时消耗样液量在10ml左右；二是通过预测可以知道样液大概消耗量，以便在正式测定时，预先加入比实际用量少1ml左右的样液，只留下1ml左右样液在继续滴定时加入，以保证在1分钟之内完成继续滴定工作，提高测定的准确度。
（6）必须严格控制反应液的体积，标定和测定时消耗的体积应接近，使反应体系碱度一致。热原一般采用800W电炉，电炉温度恒定后才能加热，热原强度应控制在使反应液在两分钟内沸腾，且应保持一致；否则加热至沸腾所需时间就会不同，引起蒸发量不同，使反应液碱度发生变化，从而引入误差。沸腾时间和滴定速度对结果影响也较大，一般沸腾时间短，消耗糖液多，反之，消耗糖液少。滴定速度过快，消耗糖量多，反之，消耗糖量少。因此，测定时应严格控制上述条件，力求一致。平行试验的样液消耗量相差不应超过0.1ml。

思考题：
1．   在费林试剂比色法中为什么可以用亚甲基蓝作为滴定终点的指示剂？
2．   用费林试剂比色法测定还原糖，为什么整个滴定过程必须使溶液处于沸腾状态？
3．   用费林试剂比色法，为什么必须用已知浓度的葡萄糖标准溶液标定碱性酒石酸铜溶液？
4．   在费林试剂比色法中样品溶液预测定有何作用？
5．   在费林试剂比色法中影响测定结果的主要操作因素是什么？为什么必须严格控制实验条件和操作步骤？
菲林试剂法的说明与讨论
    ①此法所用的氧化剂碱性酒石酸铜的氧化能力较强，醛糖和酮糖都可被氧化，所以测得的是总还原糖量。
    ②本法是根据—定量的碱性酒石酸铜溶液(Cu+2量一定)消耗的样液量来计算样液中还原糖含量，反应体系中Cu+2的含量是定量的基础，所以在样品处理时，不能用铜盐作为澄清剂，以免样液中引入Cu+2，得到错误的结果。
    ③次甲基蓝也是一种氧化剂，但在测定条件下氧化能力比Cu+2弱，故还原糖先与Cu+2反应，Cu+2完全反应后，稍过量的还原糖才与次甲基蓝指示剂反应，使之由蓝色变为无色，指示到达终点。
    ④为消除氧化亚铜沉淀对滴定终点观察的干扰，在碱性酒石酸铜乙液中加入少量亚铁氰化钾，使之与Cu2O生成可溶性的无色络合物，而不再析出红色沉淀。
    ⑤碱性酒石酸铜甲液和乙液应分别贮存，用时才混合，否则酒石酸钾钠铜络合物长期在碱性条件下会慢慢分解析出氧化亚铜沉淀，使试剂有效浓度降低。
    ⑥滴定必须在沸腾条件下进行，其原因一是可以加快还原糖与Cu+2的反应速度；二是次甲基蓝变色反应是可逆的，还原型次甲基蓝遇空气中氧时又会被氧化为氧化型。此外，氧化亚铜也极不稳定，易被空气中氧所氧化。保持反应液沸腾可防止空气进入，避免次甲基蓝和氧化亚铜被氧化而增加耗糖量。
    ⑦滴定时不能随意摇动锥形瓶，更不能把锥形瓶从热原上取下来滴定，以防止空气进入反应溶液中。
    ⑧样品溶液预测的目的：一是本法对样品溶液中还原糖浓度有一定要求(0.1％左右)，测定时样品溶液的消耗体积应与标定葡萄糖标准溶液时消耗的体积相近。通过预测可了解样品溶液浓度是否合适，浓度过大或过小应加以调整，使预测时消耗样液量在l0ml左右；二是通过预测可知道样液大概消耗量，以便在正式测定时，预先加入比实际用量少1ml左右的样液，只留下1ml左右样液在续滴定时加入，以保证在1分钟内完成续滴定工作，提高测定的准确度。
    ⑨影响测定结果的主要操作因素是反应液碱度、热源强度、煮沸时间和滴定速度。反应液的碱度直接影响二价铜与还原糖反应的速度、反应进行的程度及测定结果。在一定范围内，溶液碱度愈高，二价铜的还原愈快。因此，必需严格控制反应液的体积，标定和测定时消耗的体积应接近，使反应体系碱度一致。热源一般采用800W电炉，电炉愠度恒定后才能加热，热源强度应控制在使反应液在两分钟内沸腾，且应保待一致。否则加热至沸腾所需时间就会不同，引起蒸发量不同，使反应液碱度发生变化，从而引入误差。沸腾时间和滴定速度对结果影响也较大，一般沸腾时间短，消耗糖液多，反之，消耗糖液少；滴定速度过快，消耗糖量多，反之，消耗糖量少。因此，测定时应严格控制上述实验条件，应力求一致。平行试验样液消耗量相差不应超过0.1ml。
    ⑩测定时先将反应所需样液的绝大部分加入到碱性酒石酸铜溶液中，与其共沸，仅留lml左右由滴定方式加入，而不是全部由滴定方式加入，其目的是使绝大多数样液与碱性酒石酸铜在完全相同的条件下反应，减少因滴定操作带来的误差，提高测定精度。
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