小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定.pptx

小容量注射剂药液微生物污染水平小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定测试及工艺时间限度确定小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定第1页一、概述一、概述二、试验目标二、试验目标三、试验方案三、试验方案四、试验结果及讨论四、试验结果及讨论五、污染菌判定五、污染菌判定六、注意事项六、注意事项小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定第2页一、概述在无菌药品生产中，预防微生物污染一直是生产企业关重视点。无菌是注射剂主要质量要求和安全性指标之一。按照药典进行无菌检验是存在不足：污染率越低，一样取样量误将产品判为合格概率越高；在同一个污染率下，取样量越大，以无菌试验结果判断批产品无菌可信度就越高。小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定第3页一、概述不过，对于污染率极低（如1%）批产品，即使加大取样数，提升可信度也是微不足道。同时，过多取样量也增加了试验过程污染概率，对无菌试验结果判断一样造成影响。从无菌药品生产各个步骤分析存在微生物污染原因，有利于进行微生物污染控制，从而确保药品无菌水平。小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定第4页一、概述药品生产质量管理规范（年修订）无菌药品附录第五十七条 应该尽可能缩短药液从开始配制到灭菌（或除菌过滤）间隔时间。应该依据产品特征及贮存条件建立对应间隔时间控制标准。小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定第5页二、试验目标在一定条件下，微生物将依据时间成几何级数增加，所以“微生物污染水平监测”实质也是一个时间间隔管理实施方法。咱们经过检测药液稀配后至灭菌前生产过程不一样时段药液微生物数量，建立微生物随时间改变趋势关系，找到抵达污染控制程度时间点，预留一定安全时间作为内部控制时限要求。小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定第6页二、试验目标无菌药品灭菌与灭菌前产品微生物污染程度相关，对灭菌前微生物污染情况进行检控是对产品作无菌评价先决条件。此次试验模拟生产品种：XX注射液，规格：5ml，生产批量：12万支，灌装时间：8h，灭菌：6柜次。小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定第7页二、试验目标除了微生物相关要求外，必须指出，个别产品在溶液或其它状态下存在不稳定性，极易降解，产生新杂质，所以基于药品化学稳定性时间管理，也是确定存放时限制订依据。小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定第8页三、试验方案（一）成立试验小组，明确职责（一）成立试验小组，明确职责1、小组组员：组长：质量责任人组员：QA、QC、针剂车间2、职责2.1 组长负责审批。小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定第9页三、试验方案2.2 QA负责起草试验方案和汇报试验过程取样和环境监测（生产全过程沉降菌和生产前中后尘埃粒子、风速、温湿度）。负责协调工作，以确保按要求项目顺利实施。负责现场监督。负责数据及结果审核。小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定第10页三、试验方案2.3 QC微生物检验试验准备及测试工作。负责依据检验结果出具检验汇报单。2.4 针剂车间负责指定操作人员和清洁人员。负责按照生产工艺规程和操作SOP进行操作。小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定第11页三、试验方案（二）确定风险点（二）确定风险点无菌检验并不能确保最终灭菌产品无菌状态。应该把成品无菌检验看做确保无菌一系列控制办法中最终一项办法。所以，灭菌前产品微生物控制应该作为生产中最主要质量确保办法和正常生产先决条件。小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定第12页三、试验方案我企业XX小容量注射剂为最终灭菌制剂，5ml生产线关键生产工艺流程为：称量、浓配、超滤、稀配定容、过滤（微生物负载滤器）、除菌过滤、灌装、灭菌检漏。小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定第13页三、试验方案小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定第14页三、试验方案经过分析，对成品无菌可能产生影响关键点为稀配液微生物污染水平，包含稀配结束时稀配液、灌装完成过程稀配液、灌装即将结束时稀配液；灌装液微生物污染水平，包含灌装开始时灌装药液、灌装过程灌装药液、灌装即将完成时灌装药液；灭菌前药液微生物污染水平。小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定第15页三、试验方案（三）制订取样计划（三）制订取样计划此次试验计划模拟灌装时间为8小时，依据灌装机灌装能力，确定生产批量为12万支，灭菌6柜次，按照xx注射液工艺规程组织生产。对生产当日注射用水进行微生物程度检验，生产环境进行监测：温度、湿度、尘埃粒子（生产前、生产过程、生产结束）、风速（生产前、生产结束）沉降菌（生产全过程），人员5指手套，接触碟表面微生物（生产结束）小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定第16页三、试验方案1、取样点及取样频次样品1：稀配罐内稀配液，自稀配定容结束后至生产结束，每隔1小时取样检测一次微生物量样品2：除菌过滤之前药液，即自微生物负载滤器过滤后药液，自灌装开始至灌装结束，每隔1小时取样检测一次微生物量小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定第17页三、试验方案样品3：灌装后药品，即除菌过滤后药液，自灌装开始至灌装结束，每隔1小时取样检测一次微生物量样品4：灭菌前药液，即灭菌前放置时间最长药液，取第一锅和最终一锅分别检测微生物量样品5：待灭菌药液放置1小时后，取第一锅和最终一锅待灭菌时间最长药液，灭菌程序开启后再放置一小时后检测微生物量小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定第18页三、试验方案小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定第19页三、试验方案小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定第20页三、试验方案2、样品标签小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定第21页三、试验方案3、依据标准及相关文件药品GMP指南无菌药品药品生产验证指南年版中华人民共和国药典年版XX注射液工艺规程小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定第22页三、试验方案当代医药工业微生物试验室质量管理与验证技术4、取样器具取样瓶为250ml无菌玻璃磨口瓶。小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定第23页三、试验方案（四）检验方法（四）检验方法采取薄膜过滤法进行药液微生物程度检验。取滤膜孔径 0.45m，直径为 75mm一次性全封闭薄膜过滤器（北京牛牛基因技术有限企业，滤器类型：NS01-75D1），将过滤器逐一插放在滤液槽座上，将其塑胶软管装入集菌仪蠕动泵管槽内，注意定位准确，软管走势顺畅。小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定第24页三、试验方案其进液软管双芯针头插入供试液容器塞上，开启集菌仪，将供试液容器倒置，使药液均匀经过滤器，滤净。打开过滤器菌面朝上贴于营养琼脂培养基和玫瑰红钠琼脂培养基平板上培养。每种培养基制备一张滤膜。细菌培养3天，霉菌、酵母菌培养5天，逐日观察菌落生长情况，点计菌落数，必要时，可适当延长培养时间至7天进行菌落计数并汇报。小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定第25页四、试验结果及讨论（一）微生物污染水平检测结果见下表小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定第26页小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定第27页四、试验结果及讨论样品1：稀配罐内稀配液，稀配定容后至生产结束，每隔1小时取样检测一次微生物量，微生物量随时间改变趋势图以下：小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定第28页四、试验结果及讨论0小时1小时2小时3小时4小时5小时6小时7小时8小时0100200300400稀配罐的稀配罐的药液液小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定第29页四、试验结果及讨论讨论：第0、1、2、3、4、5、6、7、8小时在稀配罐分别取样进行微生物程度检验，在第5小时后开始检出微生物，数量为8cfu/100ml，随时间增加微生物数量呈上升趋势。在生产即将结束时检测药液微生物数为369cfu/100ml。小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定第30页四、试验结果及讨论依据颇尔除菌过滤器过滤效果验证，理论上定容后药液载菌量为：6.01010cfu，（除菌过滤器最少能到达107/cm2过滤面积浓度缺点假单胞菌，过滤面积为0.6m2）在除菌过滤器除菌能力范围内。我企业工艺验证要求微生物程度检验结果应小于10cfu/ml。小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定第31页咱们经过检测稀配罐药液在生产过程不一样时段药液微生物数量，8小时能够作为稀配液污染控制程度时间点。小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定第32页四、试验结果及讨论样品2：除菌过滤之前药液，即自微生物负载滤器过滤后药液，自灌装开始至灌装结束，每隔1小时取样检测一次微生物量，微生物量随时间改变趋势图以下：小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定第33页四、试验结果及讨论0小时1小时2小时3小时4小时5小时6小时7小时8小时02468除菌除菌过滤过滤前前药药液液小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定第34页四、试验结果及讨论讨论：第0、1、2、3、4、5、6、7、8小时对0.22m微生物负载过滤器过滤后药液分别取样进行微生物程度检验，在第6小时后开始检出微生物，并随时间增加呈上升趋势。在生产即将结束时检测药液微生物量为7cfu/100ml，符合除菌过滤前药液小于10cfu/100ml微生物负荷要求。小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定第35页四、试验结果及讨论咱们经过检测除菌过滤前药液在生产过程不一样时段微生物数量，8小时能够作为除菌过滤前药液污染控制程度时间点，能够将7小时作为预留安全时间作为内部控制时限要求。小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定第36页四、试验结果及讨论样品3：灌装后药品，即除菌过滤后药液，自灌装开始至灌装结束，每隔1小时取样检测一次微生物量，微生物量随时间改变趋势图以下：小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定第37页四、试验结果及讨论0小时1小时2小时3小时4小时5小时6小时7小时8小时0102030405060灌装灌装药药液液小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定第38页四、试验结果及讨论讨论：第0、1、2、3、4、5、6、7、8小时灌装药液分别取样进行微生物程度检验，在第7小时后开始检出微生物，并随时间增加呈上升趋势。在生产即将结束时检测药液微生物数为50cfu/100ml，药品载菌量为2cfu/支。符合100 cfu/100ml灭菌前药液微生物数量。小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定第39页四、试验结果及讨论咱们经过检测灌装药液在生产过程不一样时段微生物数量，8小时能够作为灌装药液污染控制程度时间点，能够将6小时作为预留安全时间作为内部控制时限要求。小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定第40页四、试验结果及讨论样品4：灭菌前药液，即灭菌前放置时间最长药液，第一锅灭菌前药液微生物数量为0，第六锅灭菌前药液微生物数量为37 cfu/100ml，符合100 cfu/100ml灭菌前药液微生物数量。小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定第41页四、试验结果及讨论样品5：待灭菌药液放置1小时后，取第一锅和最终一锅待灭菌时间最长药液，灭菌程序开启后再放置一小时后检测微生物量，第一锅待灭菌放置1小时后微生物数量为3 cfu/100ml，第六锅待灭菌放置1小时后微生物数量为118 cfu/100ml，已经超出100 cfu/100ml灭菌前药液微生物数量。小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定第42页四、试验结果及讨论咱们经过检测灭菌前药液和待灭菌药液放置1小时后药液微生物数量，9小时能够作为稀配至灭菌污染控制程度时间点，能够将7小时作为预留安全时间作为内部控制时限要求。小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定第43页四、试验结果及讨论污染控制程度时间点和内部控制时限汇总表小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定第44页四、试验结果及讨论确定微生物污染内部控制内部时限：稀配定容至灌装结束时限为6小时，灌装开始至灭菌结束时限为7小时，每次最长待灭菌时限为3小时。小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定第45页四、试验结果及讨论（二）其它检测结果生产当日注射用水微生物程度检验结果0，标准10 cfu/100ml，符合要求。灌装间生产环境：温度、湿度、尘埃粒子（生产前、生产过程、生产结束）、风速（生产前、生产结束）沉降菌（生产全过程），人员5指手套，接触碟表面微生物（生产结束）结果均符合要求。小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定第46页四、试验结果及讨论（三）最终成品检验情况成品按照灭菌柜次检验无菌和热原，结果均符合要求。小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定第47页五、污染菌判定微生物判定程序（参见当代医药工业微生物试验室质量管理与验证技术P205）（一）标准微生物判别应遵照逐步缩小范围标准，用细菌分类学知识和操作步骤，一步一步将未知微生物逐步落实到科、属，然后选择对应数码判定系统将未知微生物判定到种。小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定第48页五、污染菌判定判定包含以下几个步骤：1、菌株采集；2、菌株纯化；3、菌落形态学观察如形状、大小、色泽；4、细胞形态观察如球状、杆状、螺旋状、弧状、丝状及其排列方式；5、革兰染色反应，阳性或阴性；6、氧化与发酵试验；7、接触酶与氧化酶试验；8、鞭毛与动力等等。小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定第49页五、污染菌判定经过上述基础试验结果再结合细菌判定检索表从而确定微生物所属范围，并选择适当数值分类判别试验条（API试验条）将微生物判定到种。小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定第50页五、污染菌判定小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定第51页五、污染菌判定细菌判定检索表包含细菌判定时所包括基础定向生化判别试验，依据这些定向生化试验能为大个别未知菌判定选择适当API试纸条。小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定第52页五、污染菌判定怎样依据这张判定表来选择所使用方法步骤：1、纯化、分离待判定菌无菌操作用接种环挑取待判定菌落或少许含菌溶液到对应培养基上（如：TSA）划线分离，以纯化至单菌落。2、挑取纯化后单菌落做革兰染色、镜检，以确定待判定菌革兰属性。小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定第53页五、污染菌判定3、如镜检结果为革兰阴性杆菌，则先进行发酵试验。如发酵试验结果为阴性，则选取API20NE试剂条进行判定；如发酵试验结果为阳性，则在经过细胞色素氧化酶试验后选取API20E试剂条进行判定。4、如镜检结果为革兰阳性球菌，则先进行过氧化氢酶试验。如试验结果为阴性则选取API Strep试剂条进行判定，如试验结果为阳性则选取API Staph试剂条进行判定。小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定第54页五、污染菌判定5、假如镜检结果为革兰阳性杆菌而且有内生芽胞，则选取API 50CHB试剂条进行判定；不然，依据运动性试验和过氧化氢酶试验结果选取API Coryne或其它试剂条进行判定。6、表中未列出其它试剂条API 20A试剂条可用于判定厌氧菌。API 20C AUX试剂条可用于判定酵母菌。小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定第55页五、污染菌判定7、选定正确试剂条后，依据不一样API试剂条标准操作规程准备接种物，进行接种、培养等操作并将结果形成数码，用API判定软件判定或查询待检菌名称均可。判定结果应统计，必要时，给出对应解释。小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定第56页五、污染菌判定（三）革兰染色试验在细菌判定过程中，需要最先完成一些试验称为基础定向生化试验。介绍革兰染色试验原理、操作步骤和试剂配制内容。小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定第57页五、污染菌判定1、原理因为革兰阳性细菌细胞壁较厚，细胞壁中肽聚糖含量高且网格结构紧密，含脂量又低，当用结晶紫复合溶液染色细胞后用脱色剂脱色时，引发了细胞壁肽聚糖层网状结构孔径缩小以致关闭，从而阻止了结晶紫-碘复合物逸出，故而菌体展现深紫色；小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定第58页五、污染菌判定而革兰阴性细菌细胞壁中肽聚糖含量低，含脂量又高，当用酒精脱色时，脂类物物质被溶解，细胞壁通透性增大，结晶紫-碘复合物被抽提出来，从而使菌体展现复染液红色。小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定第59页五、污染菌判定2、染色液配制2.1结晶紫染液将A液（结晶紫2.0g溶于20ml95%乙醇中）与B液（草酸铵0.8g溶于80ml蒸馏水）混合，静置48小时后过滤。小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定第60页五、污染菌判定2.2卢戈碘液取碘化钾2.0g溶于5ml蒸馏水中，再加入碘片1.0g，待碘全部溶解后，加蒸馏水至300ml即成。也可只加蒸馏水至100ml，配制母液储存，用时加两倍蒸馏水。2.3脱色液95%乙醇溶液。小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定第61页五、污染菌判定2.4复染液（0.25%沙黄液）取沙黄0.25g溶于95%乙醇10ml中，待完全溶解后再加蒸馏水至100ml。3制片、染色操作在洁净载玻片上滴一滴蒸馏水或生理盐水，用接种环挑取少许菌龄为18-24小时菌苔与水滴充分涂抹混匀成1cmX1cm大小区域菌膜，自然烘干或在酒精灯火焰上方微热烘干，并在火焰上经过几次，以固定涂片。小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定第62页五、污染菌判定滴加结晶紫液，初染1分钟，用自来水冲去结晶紫液。滴加卢戈碘液冲去残水并媒染约1分钟，再用自来水冲去卢戈碘液，将玻片上水甩干。滴加95%乙醇脱色约20-30秒，并马上用水冲净。滴加沙黄液染1-2分钟后，用水洗净沙黄液，晾干供镜检。小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定第63页五、污染菌判定4阳性-阴性对照控制取金黄色葡萄球菌和大肠杆菌悬浮液，制成细菌涂片；或是使用已知革兰阳性细菌和阴性细菌制成涂片，分别染色操作后作为阳性和阴性对照控制。5镜检观察在载玻片菌膜上滴一滴香柏油，用显微镜油镜观察标本，菌体呈红色为革兰阴性菌；菌体呈蓝紫色为革兰阳性菌。小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定第64页六、注意事项1、小容量注射剂5ml生产线处于正常生产状态。2、因为是工艺试验批次，生产结束后应马上进行彻底清场，必要时进行清洁灭菌后效果确认。小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定第65页