河南科技学院常景玲.pptx

6.1 微生物发酵与制药6.2 微生物生长与生产的关系6.3 制药微生物生产菌种建立6.4 培养基制备6.5 灭菌工艺6.6 发酵培养技术6.7 发酵工艺过程的控制6.8 青霉素的生产工艺第六章微生物发酵制药工艺l青霉素的概述l生产菌的生物学特性l发酵工艺过程l提炼工艺过程6.8 青霉素的生产工艺l1929:Fleming在葡萄球菌培养皿中，污染的霉菌周围出现透明的抑菌圈。l杀菌物质，断言太不稳定，无法分离并用作药物。l1939：牛津病理家Howard Florey化学家Ernst Chain,Norman Heatley。发酵瓶培养霉菌，培养里提取，测活性，青霉素结晶。6.8.1 概述发现（1）l1940:8只鼠注射链球菌，提取物对4只治疗。未经治疗鼠在24小时内死亡，治疗鼠存活数天至数周。l1941年2月开始治疗第一批人类病人。l1943：威斯康辛大学小组，取得突破l生产菌表面培养：几十个单位。l深层培养产黄青霉：100U/ml。lX、UV诱变育种：10001500U/ml。l不产色素变种：6600070000U/mll目前：85000U/ml。l细胞壁合成中的肽多糖合成的第三阶段l肽多糖的D-丙氨酰-D-丙氨酸二肽类似物l竞争性与转肽酶结合，使转肽酶不能催化多肽链之间的交联。l生长中的细胞有效，静止细胞无效l高效、安全的抗细菌感染药物6.8.1 概述作用机理（2）（1）临床抗感染治疗：大多数革兰氏阳性菌和某些革兰氏阴性细菌及螺旋体等。毒性小，但需要皮试。（2）各种半合成抗生素的原料：氨苄青霉素，磺苄青霉素，乙氧萘青霉素头孢菌素母核。6.8.1 概述应用（3）l6-氨基青霉烷酸（6-aminopenicillanic 6APA）苯乙酰衍生物。l侧链基团不同，形成不同的青霉素lG：苄基青霉素，C6H5CH2-CO-，为主l双氢霉素F：戊青霉素lX：对羟苄基青霉素lF：2-戊烯基青霉素lK：庚青霉素lV：苯氧甲基青霉素l产品：钠、钾、普鲁卡因、二苄基乙二胺6.8.1概述分子结构及衍生物（4）l产黄青霉：Penicilliumchrosogenum孢子:绿色和黄色l菌落：平坦或皱褶，圆形。l青霉穗:分生孢子链状深层培养菌丝：球状和丝状两种。6.8.2 青霉素生产菌的生物学特性l第1期：分生孢子萌发，具有小泡。l第2期：菌丝繁殖，嗜碱性，类脂肪小颗粒。l第3期：脂肪包涵体，贮藏物，嗜碱性很强。l第4期：空泡，嗜碱性减弱，开始产生抗生素。l第5期：大空泡，中性染色大颗粒，脂肪包涵体消失，青霉素产量最高。l第6期：个别细胞自溶，胞内无颗粒，释放氨，pH上升。l第7期：菌丝完全自溶，仅有空细胞壁。发酵培养下的生长过程及细胞学变化l规定时间取样，显微镜观察7个时期的态变化，控制发酵。l14期为菌丝生长期，3期的菌体适宜种子。l45期为生产期，生产能力最强，通过工程措施，延长此期，获得高产。l第6期到来之前结束发酵。镜检控制青霉素生产流程框图l斜面种子：砂土孢子用甘油、葡萄糖、蛋白胨组成的固体培养基进行培养l米孢子：移植到小米或大米固体培养基上，生长7天，25l注意：每批孢子必需进行严格摇瓶试验，测定效价及杂菌情况。6.8.3 发酵工艺过程l一级种子发酵：发芽罐，孢子萌发，形成菌丝。培养基：葡萄糖，玉米浆，碳酸钙，玉米油，消沫剂等。空气流量1：3（体积比）；300-350rpm；pH自然，温度271,40hl二级种子罐：繁殖罐，大量繁殖。接种量10培养基：葡萄糖、玉米浆，玉米油，消沫剂等。1:1-1.5；250-280rpm；pH自然，251。10-14hl质量：菌丝致密，菌丝粗壮，III期，倍增期6-8h2、种子罐培养工艺l三级罐：生产罐；接种量20l培养基：花生饼粉，葡萄糖，尿素，硝酸铵，硫代硫酸钠，苯乙酰胺，CaCO3,玉米油,硅油.l参数条件：通气量1：0.8-1.2；150-200r/min；前60小时:pH6.4-6.6，26；60小时后:pH6.7,24。3、生产罐培养工艺l操作方式：反复分批式发酵l发酵罐：100M3，装料80M3.l带放:6-10次，带放量10，间隔24h。l发酵周期：180-220h4、发酵培养与过程控制青霉素的生产周期发酵动力学l前40小时：培养基中的主要营养物l40小时后：低速连续补加葡萄糖、氮源和苯乙酸等，维持一定的最适浓度。l半饥饿状态：延长合成期，提高产量。l碳源占成本12以上，采用糖化液流加,降低成本。l糖与6APA结合形成糖基-6APA，影响青霉素产量。（1）过程控制补料分批操作控制基质浓度l根据残糖、pH、尾气中CO2和O2含量。l葡萄糖的波动范围较窄，浓度过低使抗生素合成速度减慢或停止，过高则导致呼吸活性下降，甚至引起自溶。l残糖0.3-0.6左右，pH开始升高时流加糖。l浓度：500kg/M3，流速:1.0-2.5kg/M3.h流加碳源控制l玉米浆:最好，含有多种氨基酸及其前体苯乙酸和衍生物。l补加无机氮源：硫酸铵、氨水、尿素l氨基氮浓度：0.01-0.05%。流加氮源控制l无机盐硫、磷、镁、钾等。l铁对青霉素合成有毒，30-40 ug/ml以下。l罐壁涂环氧树脂保护层。盐离子控制l时期：合成阶段l种类：苯乙酸及其衍生物，苯乙酰胺、苯乙胺、苯乙酰甘氨酸l毒性：抑制细胞生长和青霉素合成。l策略：低浓度流加l浓度：苯乙酸0.1%，苯乙酰胺0.05-0.08%l控制：保持供应速率略大于生物合成需要。（2）添加青霉素侧链前体l表面活性剂：新洁尔灭、聚氧乙烯、山梨糖醇酐、单油酸酯、单月桂酸酯、三油酸酯l可溶性高分子化合物：聚乙烯醇、聚丙烯酸钠、聚乙二胺、聚乙烯吡咯烷醇l其他：剪切保护剂；分散剂提高产量的其他物质流加l适宜菌丝生长温度30，分泌青霉素20。l20青霉素破坏少，周期很长。l变温控制，不同阶段不同温度。l生长阶段:较高温度，缩短生长时间；生产阶段适当降低温度，以利于青霉素合成。l前期控制26左右，后期降温控制24（3）温度控制合成适宜pH6.46.6左右，避免超过7.0直接加酸或碱：自动控制流加葡萄糖：恒速；变速，依赖pH变化快慢。pH下降：补加CaCO3、通氨、尿素或提高通气量pH上升：补加糖、生理酸性物质（硫酸铵、油脂）（4）pH控制30饱和度，产率急剧下降；10，造成不可逆的损害。临界溶氧浓度：30。通气比：1：0.81.5。适宜的搅拌速度:保证气液混合，提高溶氧调整搅拌转速:各阶段的生长和耗氧量不同。（5）溶氧控制天然油脂：玉米油；化学消沫剂：泡敌策略：少量多次。注意：前期不宜多加入，影响呼吸代谢。（6）消沫青霉素不稳定，遇酸、碱、热分解失活水溶液中不稳定，非极性溶剂中稳定易溶于有机溶剂，水中溶解度很小青霉素盐很稳定；降解产物具有致敏性防止降解，条件温和、快速。2.8.4 提炼工艺过程青霉素的存在部位：发酵液浓度较低：1030Kg/M3含有大量杂质：菌体细胞、核酸、杂蛋白质、细胞壁多糖等、残留的培养基、色素、盐离子、代谢产物等目的：浓缩目的产物，去除大部分杂质，改变发酵液的流变学特征，利于后续的分离纯化过程。预处理:发酵液加少量絮凝剂沉淀蛋白1、预处理鼓式真空过滤机过滤：一次滤液：pH6.2-7.2，略浑，棕黄或绿色，蛋白质含量0.52.0%。板框式过滤机过滤：硫酸调节pH4.5-5.0，加入0.07%溴代十五烷吡啶，0.07%硅藻土为助虑剂。二次滤液：澄清透明，用于提取（收率90）2、过滤原理：青霉素游离酸易溶于有机溶剂，而霉素盐易溶于水。萃取剂：青霉素分配系数高的有机溶剂。工业上通常用：醋酸丁酯和醋酸戊酯。除去蛋白质：加0.05-0.1%乳化剂PPB。萃取：23次。3、溶剂萃取正相萃取：酸化pH1.8-2.0，滤液：醋酸丁酯1：0.3，碟片式离心机分离（浓缩1.5-2.1）反相萃取：pH6.8-7.4（磷酸盐、碳酸盐缓冲液）。把青霉素从丁酯中提取到缓冲液中。反复萃取23次，达到结晶要求。萃取条件：10下。萃取罐冷冻盐水冷却。逆流萃取过程萃取液中添加活性炭，除去色素过滤，除去活性炭。4、脱色加醋酸钠乙醇溶液反应：得到结晶钠盐。加醋酸钾乙醇溶液：得到青霉素钾盐。5、结晶直接结晶萃取液，再用0.5 M NaOH萃取pH6.4-6.8下得到钠盐水浓缩液。加3-4倍体积丁醇，16-26，真空0.67-1.3KPa）下蒸馏。水和丁醇形成共沸物而蒸出。钠盐结晶析出。结晶经过洗涤、干燥（60真空16h），磨粉，装桶，得到青霉素产品。5、结晶共沸蒸馏结晶青霉素的概述生产菌特性发酵工艺过程提炼工艺过程小结（1）青霉素发酵工艺的建立对抗生素工业有何意义？（2）如何根据青霉素生产菌特性进行发酵过程控制？（3）青霉素发酵过程的控制原理及其关键点是什么？（4）青霉素提炼工艺中采用了哪些单元操作，为什么？思考题