圆盘电泳按改进.pptx

聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳 1 1、实验原理、实验原理 聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳是以丙烯酰胺与甲叉双丙烯酰胺，在催剂的作用下聚合而成的具有三维网壮结构的大分子凝胶作为支持介质的一种区带电泳。在这种电泳中由于采用了凝胶孔径，pH值，缓冲液成分和电位梯度的不连续系统，因此它具有高分辨率的三种效应，即：浓缩效应，分子筛效应和电荷效应。在凝胶中当对被分析的样品进行这种电泳时，样品中的各成分首先经过浓缩，然后再根据他们各自所带电荷，分子量的大小以及形状的差异，以不同的迁移率电泳分离而成带。因本实验是采用聚丙烯酰胺凝胶在垂直的小玻管中进行的，经电泳后分离的样品带形似圆盘，因此称之为垂直管型聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳（简称圆盘电泳）。2 2、目的与要求、目的与要求 用圆盘电泳的方法分离蛋白质样品，通过实验了解和熟悉应用聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳进行分析的方法和实验过程。3 3、仪器、器材与装置、仪器、器材与装置：3-1、实验仪器：、实验仪器：（1）、）、电电 泳泳 仪：仪：(a)(a)：EPS604EPS604稳压稳流电泳仪稳压稳流电泳仪 (南京科保仪器研究所)(b)(b)：DYY-6CDYY-6C和和DYY-7CDYY-7C型电泳仪型电泳仪 (北京市六一仪器厂)(c)(c)：DYY-6BDYY-6B稳压稳流电泳仪稳压稳流电泳仪 (南京大学（储平厂）（2 2）、）、圆盘电泳槽装置一套圆盘电泳槽装置一套 (南京大学（储平厂）（规格：12根玻管和6根玻管两种）；（3 3）、）、磁力搅拌器磁力搅拌器 (上海沪西分析仪器厂)90-1型恒温磁力搅拌器 （4 4）、）、混混 合合 器器 (上海沪西分析仪器厂)WH-3微型旋蜗混合仪（5 5）、）、天天 平平 （a a）：）：BL-2200H,电子天平，最大称量2200克，感量：0.01g SHIMADZU CORPORATION （b b）：）：BS110S,电子天平，最大称量110克，感量：0.1mg SartoriusSartorius北京赛多利斯天平有限公司3-23-2、实验器材、实验器材：（1）、可调自动取液器：a：微量取液器（10ul，20 ull）b：常量取液器（1000ul）（2）、微量注射器：（5ul；10ul；25ul）（3）、医用注射器：（10毫升或5 毫升二种）（4）、8#针头（5）、有机玻璃凝胶小玻管架：(12孔/2排)（6）、小玻管：（长：10cm，内直径：0.4cm和0.5cm）（7）、量 筒：（250毫升，100毫升 和10毫升）（8）、烧 杯 （9）、试 管 （10）、试管架 （11）、洗耳球（12）、玻 棒（13）、剪 刀（14）、胶布条（15）、吸水纸 图图1、圆盘电泳槽装置图、圆盘电泳槽装置图4、试剂与配制：4-1、实验试剂：、实验试剂：（1）、丙 烯 酰 胺 （Acr）（2）、甲叉双丙烯酰胺 （Bis）（3）、过 硫 酸 铵 （AP）（4）、四 甲基 乙二胺 （TEMED）（5）、三羟甲基氨基甲烷 （Tris）（6）、鸡蛋白蛋白测试品 （CEA）（7）、考马斯亮兰G-25（8）、三氯醋酸 （TCA）（9）、甘氨酸 （gly）（10）、溴酚兰（11）、蔗 糖 （12）、盐 酸4-24-2、试剂的配制、试剂的配制：（1 1）、蔗糖溶液）、蔗糖溶液(测试品溶解液测试品溶解液)的配制的配制:称取蔗糖2.0 g，加蒸馏水10.0 ml（200 mg/ml）溶解混匀即可。也可用5-1（2）步骤中“G”溶液（400 mg/ml）来配制测试品（2 2）、）、1%1%的溴酚兰溶液的配制：的溴酚兰溶液的配制：称取1.0g溴酚兰，加100.0ml蒸馏水，溶解混匀即可。（3 3）、测试蛋白质样品溶液）、测试蛋白质样品溶液(1.0mg/ml)(1.0mg/ml)的配制：的配制：称取CEA样品1.0 mg于小塑料离心管内，加蔗糖溶液1.0 ml和溴酚兰溶液4-6 滴，溶解后放在冰箱中备用（无须加热）。（4 4）、）、10%10%的考马斯亮兰溶液的配制：的考马斯亮兰溶液的配制：称取1.0g考马斯亮兰G-250，加10.0ml蒸馏水溶解混匀即可。（5 5）、染色固定液的配制：）、染色固定液的配制：称取三氯醋酸15.0g，加蒸馏水100.0 ml（200 mg/ml），再加10%考马斯亮兰 G250溶液0.5ml（也可根据实际效果增加或减少）溶解混匀即可。（5 5）、四甲基乙二胺（）、四甲基乙二胺（TEMEDTEMED）溶液的配制：）溶液的配制：该试剂为液体溶液，直接取原液，无须配制。（6 6）、）、1.0 mol/L HCL1.0 mol/L HCL溶液的配制：溶液的配制：取1.0 ml 浓HCL（浓HCL-12 N），加11.0ml蒸馏水混匀即可。（7 7）、电极）、电极BufferBuffer的配制：的配制：分别称取Tris：0.6g，Gly：2.88g于烧杯中，先用少量蒸馏水溶解，然后用 蒸馏水定容至500毫升混匀（pH8.3）即可。5 5、凝胶的聚合、凝胶的聚合 5-1 5-1、凝胶贮液的配制：、凝胶贮液的配制：（1 1）、分离胶）、分离胶7.5%7.5%贮液的配制：贮液的配制：A：称取：称取Tris.3.7 g；加；加1.0 mol/L HCL 4.8 ml；最后加蒸馏水至；最后加蒸馏水至 10ml，pH8.9即可。即可。B：分别称取：分别称取Acr 3.0 g；Bis 0.08 g；加蒸馏水至；加蒸馏水至10.0 ml溶解混匀即可。溶解混匀即可。C：称取过硫酸铵：称取过硫酸铵(AP)0.028 g；加蒸馏水至；加蒸馏水至10.0 ml溶解、混匀即可。溶解、混匀即可。D：蒸馏水：蒸馏水 分别取：分别取：A：B：C：D =1.0ml：2.0ml：4.0ml：1.0ml（8.0 ml）按上述比例加完后，再另外单独加按上述比例加完后，再另外单独加 TEMED 20-25ul（2 2）、浓缩胶）、浓缩胶2.5%2.5%贮液的配制贮液的配制：E E：称取称取Tris.0.598 gTris.0.598 g；加；加1.0 mol/L HCL 4.8 ml1.0 mol/L HCL 4.8 ml；最后加蒸馏水；最后加蒸馏水10ml,10ml,pH6.9 pH6.9即可。即可。F F：分别称取分别称取Acr 1.0 gAcr 1.0 g；Bis 0.25 gBis 0.25 g；加蒸馏水至；加蒸馏水至10.0 ml10.0 ml溶解、混匀即可。溶解、混匀即可。G G称取蔗糖称取蔗糖4.0 g4.0 g；加蒸馏水至；加蒸馏水至10.0 ml10.0 ml溶解、混匀即可。溶解、混匀即可。H H：称取过硫酸铵称取过硫酸铵(AP)0.028 g(AP)0.028 g；加蒸馏水至；加蒸馏水至10.0 ml10.0 ml溶解混匀即可。溶解混匀即可。分别取：分别取：E E：F F：G G：H =0.5 ml H =0.5 ml：1.0 ml 1.0 ml：0.5ml 0.5ml：2.0ml 2.0ml（4.0 4.0 mlml）按上述比例加完后，再另外单独加按上述比例加完后，再另外单独加TEMEDTEMED 30-40 ul 30-40 ul5-35-3、分离胶的制备、分离胶的制备：（1 1）、将清洁、无破碎干燥的小玻管一端，用胶布贴封后，朝下垂直放入有机玻璃）、将清洁、无破碎干燥的小玻管一端，用胶布贴封后，朝下垂直放入有机玻璃 凝胶玻管架的孔中，并在小玻管的凝胶玻管架的孔中，并在小玻管的7.5 cm处作一记号。处作一记号。（2 2）、用）、用自动取液器（自动取液器（1000 ul1000 ul）或注射器吸取上述配好的分离凝胶贮液或注射器吸取上述配好的分离凝胶贮液 沿着小玻管内壁小心准确加入沿着小玻管内壁小心准确加入7.5 cm高。高。（3 3）、凝胶溶液加毕后，）、凝胶溶液加毕后，随即随即用用自动取液器自动取液器或或注射器注射器吸取吸取蒸馏水蒸馏水，轻轻，轻轻 加至管中的加至管中的凝胶表面凝胶表面，使其，使其表面覆盖表面覆盖1.0cm 高高水层水层。在灌胶和封水。在灌胶和封水 的过程中，操作要轻，以避免产生气泡。的过程中，操作要轻，以避免产生气泡。（4 4）、将加注好的凝胶管于室温下静置，以进行聚合反应，在正常情况下大约）、将加注好的凝胶管于室温下静置，以进行聚合反应，在正常情况下大约40分钟分钟 后，待界面出现明显分层现象时，表明胶已聚合完毕，即可加浓缩胶。后，待界面出现明显分层现象时，表明胶已聚合完毕，即可加浓缩胶。5-45-4、浓缩胶的制备、浓缩胶的制备：（1 1）、轻轻）、轻轻倒掉倒掉分离胶玻管上端的分离胶玻管上端的蒸馏水蒸馏水，并用吸水纸吸去未倒净，并用吸水纸吸去未倒净 的蒸馏水（但不能触及胶面）然后再小心加入该的蒸馏水（但不能触及胶面）然后再小心加入该浓缩胶浓缩胶贮液至贮液至 1.0cm高。高。（2 2）、随后同样）、随后同样加加1.0cm高高的的蒸馏水层蒸馏水层覆盖胶表面。于室温下静置，覆盖胶表面。于室温下静置，以进行聚合反应，正常情况下大约也在以进行聚合反应，正常情况下大约也在40分钟左右分钟左右后，待浓缩后，待浓缩 胶出现乳白色时，表明胶已聚合完毕，结束聚合，同时将每一根凝胶出现乳白色时，表明胶已聚合完毕，结束聚合，同时将每一根凝 胶玻管用吸水纸轻轻吸去浓缩胶表面上的蒸馏水层，此时凝胶已制胶玻管用吸水纸轻轻吸去浓缩胶表面上的蒸馏水层，此时凝胶已制 备完成，即可进行点样、电泳。备完成，即可进行点样、电泳。6 6、电、电 泳：泳：6-16-1、加样：（、加样：（下面下面2 2种种加样方法加样方法，任选其中一种任选其中一种）（1 1）、直接用直接用20ul自动取液器取自动取液器取10ul测试样品测试样品溶液，轻轻加入到凝胶溶液，轻轻加入到凝胶 玻管上端浓缩胶表面，然后再轻轻加入适量的电极玻管上端浓缩胶表面，然后再轻轻加入适量的电极BufferBuffer溶液。溶液。圆盘电泳建议用第一种加样方法圆盘电泳建议用第一种加样方法 （2）、先用注射器加入适量的电极先用注射器加入适量的电极BufferBuffer溶液到凝胶玻管上端浓缩胶表溶液到凝胶玻管上端浓缩胶表 面，然后用微量注射器取面，然后用微量注射器取10ul测试样品测试样品溶液，并将微量注射器针溶液，并将微量注射器针 头通过电极头通过电极BufferBuffer溶液插入到浓缩胶表面，并轻轻加入之，加入溶液插入到浓缩胶表面，并轻轻加入之，加入 完毕，轻轻取出微量注射器（此法，避免了样品的扩散，对新手完毕，轻轻取出微量注射器（此法，避免了样品的扩散，对新手 特别有利）即可。特别有利）即可。垂直平板电泳建议用第二种加样方法垂直平板电泳建议用第二种加样方法 6-2 6-2、装置凝胶管：、装置凝胶管：将加好样品的凝胶管加样端（上端），分别插入到上电泳槽孔中的各将加好样品的凝胶管加样端（上端），分别插入到上电泳槽孔中的各乳胶管孔内，然后将已插满凝胶管的上电泳槽下端放入加有电极溶液乳胶管孔内，然后将已插满凝胶管的上电泳槽下端放入加有电极溶液的下电泳槽内。此时凝胶玻管下端管口易产生气泡，可通过轻轻摆动的下电泳槽内。此时凝胶玻管下端管口易产生气泡，可通过轻轻摆动凝胶玻管以去除气泡。插入上电泳槽的玻管上端，用注射器轻轻滴满凝胶玻管以去除气泡。插入上电泳槽的玻管上端，用注射器轻轻滴满电极溶液，以免产生气泡，最后将上电泳槽装满电极液。电极溶液，以免产生气泡，最后将上电泳槽装满电极液。6-36-3、接通电源：、接通电源：接通电泳槽的两端电极与电泳仪的电源，接通电泳槽的两端电极与电泳仪的电源，上上槽槽电极接电极接负极负极，下下槽槽电电极极接接正极正极，以，以稳压稳压300 V （1212管）开始进行电泳，直至指示剂前管）开始进行电泳，直至指示剂前沿到达凝胶管底部约沿到达凝胶管底部约0.5 cm处处，停止电泳停止电泳（约（约2 2小时左右）。电压小时左右）。电压应由小逐步加大至额定值。确定电泳结束时间，以不应将考马斯亮兰应由小逐步加大至额定值。确定电泳结束时间，以不应将考马斯亮兰跑出凝胶管为止，原因是防止最小分子量蛋白质跑出凝胶管。跑出凝胶管为止，原因是防止最小分子量蛋白质跑出凝胶管。6-4 6-4、取出玻管内的凝胶：、取出玻管内的凝胶：准备电泳结束时首先关闭电源。取出小玻管，然后将一支带有准备电泳结束时，首先关闭电源。取出小玻管，然后将一支带有8#8#针针头的注射器吸有适量水（蒸馏水或自来水），把针头慢慢插入玻管内头的注射器吸有适量水（蒸馏水或自来水），把针头慢慢插入玻管内壁和凝胶柱表面之间，一边开始压水，一边同时使针头慢慢贴紧管壁壁和凝胶柱表面之间，一边开始压水，一边同时使针头慢慢贴紧管壁呈螺旋式前进，如果一端不行，再在管的另一端按同样的方法剥离，呈螺旋式前进，如果一端不行，再在管的另一端按同样的方法剥离，这样依靠水流的压力和滑润力，使玻管内壁与凝胶分离，最后用这样依靠水流的压力和滑润力，使玻管内壁与凝胶分离，最后用洗耳洗耳球球在管的一端轻轻挤压，另一端对着一干净的试管（在管的一端轻轻挤压，另一端对着一干净的试管（15CM15CM长）内，此长）内，此时可以将凝胶柱压出玻管进入试管内。时可以将凝胶柱压出玻管进入试管内。6-56-5、凝胶固定与染色、凝胶固定与染色：在含有凝胶柱的试管内，加入适量染色液，放置在含有凝胶柱的试管内，加入适量染色液，放置染色染色30分钟分钟（凝胶中蛋白质区带亦被固定），完毕，弃去试管内的染色液，再用凝胶中蛋白质区带亦被固定），完毕，弃去试管内的染色液，再用自来水洗试管内凝胶柱数遍，完后，浸泡在自来水中。自来水洗试管内凝胶柱数遍，完后，浸泡在自来水中。6-66-6、凝胶脱色、凝胶脱色（以以自来水自来水作作脱色剂脱色剂）：间隔一定时间后，弃去试管内浸泡凝胶柱的废自来水，再用新鲜间隔一定时间后，弃去试管内浸泡凝胶柱的废自来水，再用新鲜自来水洗试管内凝胶柱数遍，完后，再浸泡在自来水中，如此反复多自来水洗试管内凝胶柱数遍，完后，再浸泡在自来水中，如此反复多次，直至色带完全清晰为止。次，直至色带完全清晰为止。7-7-实验结果实验结果:(1)-(1)-绘制凝胶图绘制凝胶图 (2)-(2)-书面文字结果书面文字结果 思考题思考题简述聚丙烯酰胺凝胶聚合的原理，如何调节凝胶的孔径简述聚丙烯酰胺凝胶聚合的原理，如何调节凝胶的孔径?2.2.各管加完凝胶后，为什么要及时加蒸馏水封闭？各管加完凝胶后，为什么要及时加蒸馏水封闭？3.3.为什么在样品中加含有少许溴酚蓝的为什么在样品中加含有少许溴酚蓝的4040蔗糖溶液？蔗糖蔗糖溶液？蔗糖及溴酚蓝各有何用途？及溴酚蓝各有何用途？4.4.上下两槽电泳缓冲液电泳后，能否混合存放？为什么？上下两槽电泳缓冲液电泳后，能否混合存放？为什么？（1 1）、分离胶）、分离胶7.5%7.5%贮液的配制：贮液的配制：分别取：分别取：A A：B B：C C：D =1.0ml D =1.0ml：2.0ml 2.0ml：4.0ml 4.0ml：1.0ml 1.0ml（8.0 ml8.0 ml）按上述比例加完后，再另外单独加按上述比例加完后，再另外单独加 TEMED 15-20ulTEMED 15-20ul （2 2）、浓缩胶）、浓缩胶2.5%2.5%贮液的配制：贮液的配制：分别取：分别取：E E：F F：G G：H =0.5 ml H =0.5 ml：1.0 ml 1.0 ml：0.5ml 0.5ml：2.0ml 2.0ml（4.0 ml4.0 ml）按上述比例加完后，再另外单独加按上述比例加完后，再另外单独加TEMED 20-30 ulTEMED 20-30 ul(3)-(3)-相关条件提示相关条件提示:分分 离离 胶胶:7.5 CM:7.5 CM 浓浓 缩缩 胶胶:1.0 CM:1.0 CM 上上 样样 量量:10 ul:10 ul 稳稳 压压:300 V:300 V 电泳时间电泳时间:2:00:2:00 分钟分钟 染色时间染色时间:30:30 分钟分钟