5-血红素蛋白.pptx

第五章第五章 血红素蛋白及催化体系血红素蛋白及催化体系 在生物体内，除了含铁蛋白的氧载体之外，还有多种含铁蛋白，在生物体内起着传递电子、参与各种酶催化体系以及铁自身的吸收、储存、运送等。第一节 细胞色素：电子传递第二节 细胞色素 P450第三节 甲烷单加氧酶、双加氧酶第四节 过氧化物酶及过氧化氢酶第一节 细胞色素：电子传递 在生物体系中，电子传递反应是一系列重要生物过程的基本反应，所有的氧化还原反应都会涉及电子的转移。由于铁、铜等过渡金属离子有可变的化合价，通过其价态之间的变化，如Fe(III)/Fe(II)、Cu(II)/Cu(I)等，可以有效地进行电子传递。所以在生物体内形成了一些含有铁、铜等过渡金属离子的蛋白分子作为生物过程中的电子传递体。1、铁硫蛋白，该蛋白活性中心含有非血红素的铁硫簇合物；目前已知的电子传递蛋白主要有三类：2、活性中心含有铁血红素辅基的蛋白，即细胞色素类；3、活性中心含有铜的蓝铜蛋白。和血红蛋白、肌红蛋白一样，细胞色素类蛋白的活性中心也含有血红素铁，细胞色素类蛋白就是依靠血红素铁中铁的价态变化来进行电子传递，包括电子从一种蛋白质到另一种蛋白质的转移。细胞色素广泛存在于动物和植物组织中。在动物中细胞色素的含量，以心脏和其它活跃的运动肌(如鸟类和昆虫类的飞翔肌)较高，肝、脑和非横纹肌次之，皮肤和肺最低。故一般多从动物(如猪、牛)的心脏提取。1961年，国际生物化学学会把细胞色素定义为“一种血红素蛋白，它的基本生物功能是通过分子中血红素铁的价态的可逆变化在生物体中起电子及氢的传递作用”。目前已知的细胞色素有50种以上。在生物体内，根据所含血红素辅基结构的不同，将细胞色素分为：细胞色素a（包含血红素a辅基）、细胞色素b（包含血红素b辅基）、细胞色素c（包含血红素c辅基）等。不同的生物体采用了不同的细胞色素系列来适应它们自身的需要。细胞色素参与线粒体内膜上一整套电子传递链（生物氧化呼吸链）的最后几步氧化还原反应，将电子最终传递给氧分子，使氧分子还原成水分子。电子传递的顺序为：细胞色素b 细胞色素c1 细胞色素c 细胞色素氧化酶（细胞色素a 细胞色素a3）氧分子一、细胞色素c 细胞色素c是相对分子质量比较小且相对比较容易结晶的蛋白，它的分布非常广，存在于从细菌、酵母、植物、无脊椎动物、脊椎动物到高等动物和人等所有的原核生物和真核生物中。细胞色素c是少数几个被详细研究的含金属的生物大分子之一，现在已经确定了几十种不同来源的细胞色素c的氨基酸序列，每个细胞色素c分子含有一条蛋白链一条蛋白链 和一一个血红素个血红素c辅基辅基。马心的细胞色素c的分子质量为12400 Da，它由104个氨基酸残基组成。图5.1 金枪鱼细胞色素c（第一个测定结构的细胞色素c）用核磁共振（NMR）和X射线衍射单晶结构分析对细胞色素c的研究表明，血红素c中的铁离子具有六配位的八面体构型。铁离子分别和卟啉环中的四个吡咯氮原子以及一个蛋氨酸80的硫原子、一个组氨酸18的咪唑氮原子配位。蛋白链蛋白链血红素c辅基除了由两个轴向配体与蛋白链连接外，卟啉环2,4-位以共价键形式与蛋白链中的两个半胱氨酸连接。二、细胞色素c氧化酶 细胞色素a和细胞色素a3 细胞色素c氧化酶是细胞色素c的氧化剂，它是需氧生物呼吸链中的最后一步氧化还原反应，它将还原态的细胞色素c催化氧化到氧化态的细胞色素c，同时将一分子氧还原为两分子水，反应式为：4Fe(II)-cyt c+O2+4H+4Fe(III)-cyt c+2H2O 细胞色素c氧化酶存在于细胞的线粒体膜上，该酶在催化氧化还原反应的同时还伴随着质子通过膜的转移，即细胞色素c氧化酶同时具有电子转移和质子泵的双重功能。细胞色素c氧化酶是由多个亚基组成的复合蛋白，催化反应活性中心集中在I、II和III三个亚基中，活性中心由低氧化还原电位的细胞色素细胞色素a和高氧化还原电位的细胞色素细胞色素a3组成。其中细胞色素a是接受还原态细胞色素c提供电子的部位，而细胞色素a3则是还原氧分子到水分子的部位。此外，细胞色素c氧化酶中还含有锌离子锌离子和镁离子镁离子。进一步研究发现细胞色素a和细胞色素a3都含有两个金属离子。细胞色素a不仅含有一个以血红素a为辅基的铁血红素中心，还含有一个铜中心（CuA）；而细胞色素a3不仅含有一个以血红素a3为辅基的铁血红素中心，还含有一个铜中心（CuB）。通过各种化学方法的研究，表征了细胞色素c氧化酶活性中心的结构，尤其是金属离子周围的结构。拉曼光谱、ESR等谱学研究表明，血红素a中的铁无论是氧化态还是还原态都处于六配位低自旋状态。铁离子除了与血红素平面的四个氮原子配位之外，轴向两个位置分别被来自于蛋白链中组氨酸侧链上的咪唑氮原子占据。1、细胞色素a细胞色素c氧化酶中血红素a铁的配位结构 CuA中心的结构由EXAFS、ESR以及利用同位素标记的氨基酸研究结果，并最终根据X射线衍射晶体结构结果确定为双核结构。双核铜通过蛋白链中两个半胱氨酸侧链上的硫原子桥连，一个铜离子还与一个组氨酸和一个蛋氨酸配位，另一个铜离子还与一个组氨酸和一个主链上的羰基氧原子配位。细胞色素c氧化酶中CuA中心的配位结构半胱氨酸组氨酸蛋氨酸 磁性、ESR等研究发现氧化型细胞色素a3中的Fe和Cu之间存在较强的相互作用，推测Fe和Cu之间可能有某种桥连基团存在。这两个非常接近的Fe和Cu氧化还原中心对氧分子的四电子还原过程氧分子的四电子还原过程的顺利完成非常有利。2、细胞色素a3 血红素a3中的铁在还原态时为高自旋的五配位构型，除了血红素平面四个氮原子与铁配位外，一个轴向配体是组氨酸的咪唑氮原子，另一个轴向位置为空，因此很容易与CO、CN等配体结合。谱学及晶体结构研究推测，CuB中心的配位环境中有组氨酸的咪唑氮原子参与配位，在还原态时可能也有一个空位。三、细胞色素b5 细胞色素b是一类含有原卟啉的电子传递蛋白，主要存在于线粒体内膜。还原型细胞色素b的、和特征吸收带分别在555563 nm、523533 nm和420430 nm。细胞色素b5是b类细胞色素中研究最多、了解最清楚的一种蛋白，多见于真核细胞，特别是动物的肝细胞中。细胞色素b5的蛋白链由133个氨基酸残基组成，分子质量约16000 Da。细胞色素b5与血红蛋白、肌红蛋白有一定的相似之处，也有明显的不同。在细胞色素b5中，谱学测试、晶体结构、溶液结构研究证实铁离子为配位饱和的六配位构型，因此细胞色素b5难以自动氧化，不易与CO、CN、N3等外来配体结合。细胞色素b5中铁无论是氧化态还是还原态都处于低自旋态。细胞色素b5中铁离子除了与卟啉环平面的四个氮原子配位之外，轴向位置被两个组氨酸侧链上的咪唑氮原子占据。X射线衍射晶体结构表明，细胞色素b5中的血红素位于疏水袋中，原卟啉的两个丙酸基指向蛋白表面，处在与水可接触的区域。血红素周围有四个螺旋链存在，其底部有折叠片存在，这样就构成了一个桶状疏水空腔，血红素辅基正好位于其中。小 结：细胞色素a、细胞色素b、细胞色素c是包含血红素辅基的一类金属蛋白，它们依靠血红素铁的价态变化来进行电子传递。在线粒体内膜上电子传递的顺序为：细胞色素b 细胞色素c1 细胞色素c 细胞色素氧化酶（细胞色素a 细胞色素a3）氧分子第二节 细胞色素 P450 细胞色素P450是于1958年在鼠肝微粒体中发现的一种以血红素b为辅基的蛋白，它也是b类细胞色素中的一种。与细胞色素c、细胞色素b5等不同的是，细胞色素P450在生物体系中不是电子传递蛋白，而是一种金属酶，它催化某些有机底物分子的加氧反加氧反应应。这种b类细胞色素之所以被称之为细胞色素P450，或简称P450，是因为其在还原态下的一氧化碳（CO）加合物的Soret特征吸收带出现在450 nm处，其中P代表色素。细胞色素P450的作用（功能）、结构和作用机理 在生物体系中，氧分子在酶的催化作用下氧化加合到有机底物分子中去的反应叫做加氧反应加氧反应，催化该类反应的酶称为加加氧酶氧酶。自然界存在两种加氧酶：一种是单加氧酶，即将氧分子中两个氧原子中的一个氧原子催化加合到底物分子中，而另一个氧原子被转换为水分子；另一种是双加氧酶，即将氧分子中的两个氧原子都加合到底物分子中。细胞色素P450属于单加氧酶，催化单加氧反应。反应式为：SH+O2+2H+2e SOH+H2O其中SH为底物分子。细胞色素P450催化的反应是在底物分子中引入一个羟基羟基，即底物分子进行羟基化反应，这种羟基化反应对各种有机分子在生物体系中的代谢具有重要作用。细胞色素P450显示出非常广泛的底物分子特异性，底物分子可以包括脂肪环、脂肪链类碳氢化合物以及它们的衍生物、芳香族碳氢化合物及其衍生物等。细胞色素P450催化的主要反应类型 某些有机化合物由于不溶于水，使其在体内难以代谢，而在细胞色素P450单加氧酶作用下，使这些难代谢物进行羟基化，将其转化成水溶性化合物。然后进一步与其他水溶性物质结合，代谢后排出体外，这一代谢过程对哺乳动物十分重要。例如，在肝微粒体中已经发现多种细胞色素P450，可将外来有毒化合物、污染物等催化氧化成水溶性物种排出体外，从而起到保护机体不受伤害的作用。但是，也有一些本来没有毒性或毒性较小的化合物经过细胞色素P450催化引入羟基之后反而变成毒性更大的化合物。生物体系中，在许多重要的代谢和生物合成中，细胞色素P450起了非常重要的作用。例如，在肾上腺皮质中，细胞色素P450参与脂的代谢、胆甾醇的氧化等重要过程。这些反应中的氢供体主要有还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）、还原型烟酰胺腺嘌呤核苷酸磷酸盐（NADPH）、还原型黄素蛋白、维生素C等。1、细菌单加氧酶细菌单加氧酶，代表性的是茨酮-5-单氧酶；根据来源的不同，可将细胞色素P450分为三类：2、肾上腺皮质线粒体单加氧酶肾上腺皮质线粒体单加氧酶，催化的底物分子主要有孕甾酮和11-脱氧皮质甾酮；3、肝线粒体单加氧酶肝线粒体单加氧酶，催化的底物分子种类较多，包括脂肪族化合物、药物分子的羟化等。在细胞色素P450参与的各种催化羟化反应中，研究最多、了解最清楚的是茨酮-5-单氧酶，反应式为：在黄素蛋白、铁硫蛋白和细胞色素P450的共同作用下，由烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）作为氢供体，在樟脑（2-茨酮）分子的5-位上进行立体选择性羟基化反应，催化该反应的细胞色素P450简称为P450cam。通过ESR、EXAFS等谱学表征，细胞色素P450的活性中心含有铁和原卟啉，还原型的细胞色素P450中铁为高自旋，易与O2、CO、CN等分子或离子结合，并转变为低自旋，这一现象与肌红蛋白类似。X射线衍射晶体结构证明，血红素铁的轴向第五个配体来自于蛋白链上半胱氨酸残基侧链的硫原子。氧化型细胞色素P450中在没有底物分子存在的条件下，第六配体为水分子，而且在配位水分子附近聚集了数个水分子形成一个水分子簇和物。当有底物分子进入之后，水分子簇和物即被破坏，血红素上方的空间被底物分子所占据。图5.7 未结合底物分子的细胞色素P450 血红素活性中心的结构图5.7 结合樟脑底物分子的细胞色素P450 血红素活性中心的结构小 结：细胞色素P450是以血红素b为辅基的一类金属蛋白，它是一种金属单加氧酶，可以催化某些有机底物分子的加氧反应，使有机底物分子发生羟基化反应。该酶对于生物体系的代谢具有重要作用。第三节 甲烷单加氧酶、双加氧酶 自然界存在两种加氧酶：一种是单加氧酶，即将氧分子中两个氧原子中的一个氧原子催化加合到底物分子中，而另一个氧原子被转换为水分子；另一种是双加氧酶，即将氧分子中的两个氧原子都加合到底物分子中。一、甲烷单加氧酶 细胞色素P450能够高效、特异性地催化许多有机化合物的羟基化反应，但是不能催化最简单的碳氢化合物甲烷到甲醇的反应。催化氧化甲烷到甲醇的酶称为甲烷单加氧酶。自然界中存在一类以甲烷为营养源的细菌，称为甲烷营养细菌。这类细菌能够氧化甲烷，将其转化为生物体系可利用的碳源，在自然界碳元素的循环过程中具有重要的作用。甲烷的这一转化过程还可以限制并减少甲烷气体排入大气层，从而减小由甲烷气体引起的温室效应。甲烷氧化转化过程的第一步是在甲烷单加氧酶作用下的催化反应，将甲烷转换为甲醇，反应式为：CH4+NADH+H+O2 CH3OH+NAD+H2O目前已知的甲烷单加氧酶主要是可溶性的，含有一个双核铁活性中心。甲烷单加氧酶的底物分子不仅仅是甲烷，还有许多其他的碳氢化合物也能被甲烷单加氧酶催化。因此这类催化反应不仅在自然界有重要作用，而且具有许多重要的应用前景。例如，将土壤中非水溶性的碳氢化合物（污染物）等进行羟基化反应后变为水溶性物质，从而达到改良土壤的目的；将天然气转换为甲醇，将会彻底改善天然气运输困难的问题。甲烷单加氧酶是由多种蛋白组成的复合蛋白酶，它至少由三种蛋白组成：羟化羟化酶酶、还原酶还原酶、结合蛋白结合蛋白。其中羟化酶含有一个双核铁活性中心，是发生催化反应的地方，而还原酶的作用是将由NADH提供的电子传递给羟化酶中的双铁活性中心。甲烷单加氧酶中的羟化酶、还原酶、结合蛋白示意图 晶体结构解析显示，羟化酶的活性中心含有一个双铁中心。二、双加氧酶 双加氧酶可以将氧分子中的两个氧原子同时加入到底物分子中，催化反应式为：SH+O2 SO2H其中SH为底物分子。典型的双加氧酶有邻苯二酚氧酶、原儿茶酸根3,4-双加氧酶等，均为非血红素铁酶，催化反应式为：其中O2*表示用同位素标记的氧原子，表明氧分子中两个氧原子全加入到底物分子中。双加氧酶的天然状态为红色，在450 nm有宽吸收峰，研究表明这是由酪氨酸根配体到中心三价铁的电荷转移峰，并有ESR信号。原儿茶酸根3,4-双加氧酶的晶体结构显示，其活性中心为单核铁，其中有两个组氨酸的咪唑氮原子、两个酪氨酸侧链上的氧原子参与和中心铁的配位，另外一个配位原子是水分子或羟基。图5.12 原儿茶酸根3,4-双加氧酶的活性中心结构 动力学研究等结果表明，底物分子与中心铁离子结合形成一种催化反应中间体，该活性中间体中Fe(III)和配位的儿茶酚基团之间存在从配体到Fe(III)的电荷转移，形成半醌类自由基的Fe(II)物种，从而有利于双氧的亲电进攻，最后形成氧化产物。图5.12 原儿茶酸根3,4-双加氧酶催化反应中间体的结构半醌 细胞色素P450、甲烷单加氧酶和双加氧酶中，不论是将氧分子中的一个氧原子加入到底物分子，另一个氧原子被转换为水分子，还是将氧分子中的两个氧原子都加入到底物分子，其特点都是氧分子被四电子还原到氧负离子(O2-)状态。从化学的角度看氧分子被彻底还原了，对生物体系来讲这种氧的代谢属于正常代谢，不产生对生物有害的氧物种。第四节 过氧化物酶及过氧化氢酶 在生物体系中，氧分子有时会发生不正常的代谢，没有被彻底还原，如被单电子还原到超氧负离子(O2-)，或是被双电子还原到过氧负离子(O22-)，这些物种对生物体是有害的，必须及时、有效地予以清除，从而保护生物体不受伤害。自然界在长期的生物进化过程中产生了超氧化物歧化酶用以清除超氧负离子，过氧化物酶和过氧化氢酶用于清除过氧负离子。这些酶对于生物体都是保护性的金属酶。过氧化物酶和过氧化氢酶广泛存在于动物和植物中，其中过氧化物酶还存在于许多细菌中，它们的功能是催化以下反应：ROOH+2H+2e ROH+H2O 2H2O2 2H2O+O2过氧化物酶将过氧化物ROOH还原到ROH和水，而过氧化氢酶通过歧化反应将过氧化氢转化为水和氧分子。常见的过氧化物酶有：细胞色素c过氧化物酶、辣根过氧化物酶、氯过氧化物酶等。其中细胞色素c过氧化物酶催化一分子过氧化氢，氧化两分子的还原型细胞色素c。本章小结：通过对各种含铁金属蛋白的学习，熟悉细胞色素的结构及在电子传递中的作用，了解细胞色素P450、甲烷单加氧酶、双加氧酶的结构和加氧反应机理，简单了解过氧化物酶的结构和作用。其中细胞色素、细胞色素P450、过氧化物酶中都含有血红素铁辅基，而甲烷单加氧酶和双加氧酶中分别含有双铁活性中心和单核铁活性中心。