基于响应面法结合熵权法多指标优选巴豆霜炮制工艺研究.pdf

26基于响应面法结合熵权法多指标优选巴豆霜炮制工艺研究*吴燕，唐晓龙2，陈国新，范玲，朱晓静！苏州市中西医结合医院1药剂科；2 肿瘤内科，苏州2 0 510 1摘要目的：利用多指标研究技术优化巴豆霜炮制工艺。方法：以巴豆霜中的有效成分巴豆苷和木兰花碱的含量作为评价指标，运用响应面法结合熵权法，考察不同烘制温度、不同烘制时间及不同压制时间对巴豆制霜炮制工艺的影响。结果：在16 2.8 下烘制12 min后以2 0 kg压力板压制11.5天，测得巴豆霜生物碱含量综合评分为9 8.2 5%。结论：基于响应面法结合熵权法的多指标评价方法可靠，为巴豆霜的质量评价标准和巴豆相关制剂的质量研究提供了依据。关键词巴豆霜；巴豆苔；木兰花碱；响应面法；熵权法中图分类号R283文献标志码马A文章编号1673-7806(2024)01-026-05巴豆始载于神农本草经，其性热，味辛，有大毒，须炮制减毒，多制霜人药。中国药典对巴豆霜的质量控制指标只有巴豆苷、脂肪油。现代炮制研究机理主要是巴豆苷、脂肪油、毒性蛋白等 2.3,现代药理研究发现，巴豆生物碱是巴豆霜发挥抗肿瘤作用的主要物质基础，具有诱导肿瘤细胞分化和促进细胞凋亡等多重作用 4。而木兰花碱也是巴豆霜发挥抗肿瘤作用的成分之一，木兰花碱对结直肠癌、乳腺癌等肿瘤细胞的增殖有诱导和干扰作用 5,但对其相关分析研究较少。中国药典单一成分的含量测定不能全面反映巴豆炮制前后的质量与临床疗效，对于巴豆抗肿瘤作用的定性定量分析研究巫需完善熵权法是一种客观的赋权法，其信息熵值越小，该指标对综合评价的影响（即权重）就越大，反之，则越小，利用熵权法这个工具计算出各个指标的权重系数，可以为多指标综合评价提供依据7.8 。本研究拟以巴豆苷和木兰花碱的含量为评价指标，在单因素研究的基础上，通过响应面法结合权法，分析得到巴豆霜炮制的最佳工艺并进行验证，优化巴豆霜炮制工艺，以期为巴豆（霜）的质量评价标准、巴豆相关制剂的研究及中医临床用药选择提供参考依据。*基金项目江苏省药学会-奥赛康医院药学科研项目（A202230)；江苏省卫生健康委科研项目(Z2022064)；苏州市科技发展计划项目（SKYXD2022073）作者简介吴燕，女，主管药师E-mail:*通信作者唐晓龙，男，副主任中医师币E-mail:收稿日期2023-08-16修回日期2023-11-091实验材料1.1仪器Agilent1260系列HPLC色谱仪（美国安捷伦公司）；FA2004型电子天平（上海舜宇恒平科学仪器有限公司）；液相用有机系过滤器（比克曼生物科技有限公司）；GM-0.33A型隔膜真空泵（天津市津腾实验设备有限公司）2.2药材与试剂巴豆，购于亳毫州地道中药材，经苏州卫生职业技术学院刘逊教授鉴定为大戟科植物巴豆干燥成熟的果实。A998-4乙（纯度9 9.9 5%，批号F22MB2201赛默飞世尔科技（中国）有限公司)；磷酸（纯度8 5%，批号130 40 9 10 47 5，南京化学试剂有限公司）；三乙胺（纯度9 9.5%，批号G1211016，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；石油醚（纯度30%6 0%，批号20221201，无锡市晶科化工有限公司）；7 5%乙醇（批号2 30 113410 2，安徽安特食品股份有限公司）；试验用超纯水为实验室自制超纯水。对照品巴豆苷（纯度9 9.0 7%，批号2 10 30 2 0 8），对照品木兰花碱（纯度9 9.0 9%，批号2 10 416 0 2）均购于成都普菲德生物技术有限公司。2实验方法与结果2.1巴豆霜的炮制将中药材巴豆剥壳去皮得到巴豆仁，将巴豆仁放人研磨机研磨成粉状，称取一定量的巴豆粉放到干燥箱，设置一定的温度，烘制一定的时间,取出后274.8率试验加样回收称取已知成分含量的同Pharmaceutical andClinical Research研约药学与临床研究平铺在粗纹草纸，用一定的压力压制一段时间，得到松散的粉末，过筛即为巴豆霜，待测2.2脂肪油含量测定称取“2.1”一定量的巴豆霜放人索氏提取器中，加石油醚8 0 mL，加热回流提取6 h，收集石油醚液，放置于蒸发皿中，在水浴锅上蒸干，后放置于100干燥箱中干燥1h,冷却，精密称定,计算。结果表明，每一批次含量均在19.1%2 0.0%，符合中国药典规定叫。而使用常温压制处理的巴豆霜脂肪油含量在30%左右，超过药典规定，说明烘制一定的时间和温度对脂肪油的含量有一定影响。2.3基于炳权法确定巴豆生物碱含量的综合评分根据课题组的前期研究，目前巴豆生物碱成分较多，研究较多的是巴豆苷，木兰花碱其次，因此采用熵权法对巴豆苷和木兰花碱进行权重系数确定。首先对原始评价指标矩阵(X)进行归一化处理，得到概率矩阵(P),再根据公式(1)计算巴豆苷和木兰花碱的信息熵(E)分别为0.9 146、0.9 2 0 6。根据公式(2）将信息熵转化后得到巴豆苷和木兰花碱的权重(W)分别为0.518 3、0.48 17,再根据W，计算综合评分Ml9,M=巴豆苷含量/巴豆苷含量最大值0.518 3+木兰花碱含量/木兰花碱含量最大值0.48 17。1E;=-kZ,PlnP;(k(1)InnW;=1-E(2)2.4生物碱的含量测定2.4.1色谱条件采用AgilentEC-Cis色谱柱(4.6mm150mm,4m）;流动相：乙腈（A)-0.1%磷酸-0.1%三乙胺水溶液(B);洗脱梯度（A:B):0min(5:95)8 min(5:95)20 min(14:86)29min(14:86)30min(5:95),流速：0.4mLmin*;柱温：30;进样量：10 L；检测波长：2 6 8 nm。色谱图见图1。2.4.2对照品溶液的制备耳取巴豆苷对照品、木兰花碱对照品适量，精密称定，加7 5%的乙醇混匀，制成每1mL分别含0.46 7 5mg巴豆和0.4450 mg木兰花碱的母溶液。2.4.3供试品溶液的制备称取约0.2 5g的巴豆霜，精密称定后置于索氏提取器中，加人石油醚8 0 mL，加热回流6 h,弃去石油醚液，挥干溶剂，将药渣连同滤纸一起放人圆底烧瓶中，加人8 0 mL的乙醇，再次加热回流8 h，收集提取的乙醇液，定容至50 mL，过0.22m微孔滤膜，待测。2.4.4标准曲线制备精密吸取“2.4.2”巴豆苷母液8、5、3、2、1mL，分别用7 5%乙醇定容至10 mL，1130002500(nvu)a2000-21500-C1000-1B500-2OA010203040A(min)图1HPLC色谱图(A、B)对照品溶液;(C)供试品溶液;1.巴豆苷;2.木兰花碱。稀释成浓度分别为0.37 40、0.2 338、0.140 2、0.0 9 35和0.0 46 7 mg?mL-的系列标准溶液，按“2.4.1 项下的色谱方法测定峰面积，以所测峰面积(Y)为纵坐标，溶液浓度(X,mgmL-)为横坐标,进行线性回归。结果表明，巴豆苷峰面积响应在0.0 5 0.47 mgmL-浓度范围呈良好的线性关系,其线性回归方程为 Y=2.10104X+8.21102(R2=0.999 1)。精密吸取“2.4.2 木兰花碱母液5、3、2、1、0.2 mL，分别用7 5%乙醇定容至10 mL，稀释成浓度分别为0.2225.0.1335、0.0 8 9 0.0.0 445和0.0 0 8 9 mgmL-的系列标准溶液，按“2.4.1 项下的色谱方法测定峰面积。结果表明，木兰花碱峰面积相应在0.0 1 0.45mgmL-1浓度范围呈良好的线性关系,其线性回归方程为 Y=1.69 104X-1.45 102(R=0.9991),2.4.5精密度试验精密吸取巴豆苷、木兰花碱对照品溶液并连续进样测定6 次，按“2.4.1 项下的色谱方法测定，记录所得的峰面积，计算得到巴豆苷和木兰花碱的RSD分别为0.9 2%、0.9 7%（n=6)，表明仪器的精密度良好。2.4.6稳定性试验精密吸取“2.4.3”某一供试品溶液，分别于0、2、4、8、16、2 4h进行分析，按“2.4.1”项下的色谱方法测定，分别记录所得巴豆苷峰面积和木兰花碱峰面积，计算得到巴豆苷和木兰花碱的RSD分别为0.9 1%、0.59%（n=6），说明供试品在2 4h内的稳定性良好，2.4.7重复性试验称取同一批巴豆霜供试品6份，按“2.4.3 项下的方法平行制备6 份供试品溶液，按“2.4.1”项下的方法测定，分别计算得到巴豆苷和木兰花碱的含量平均值分别为0.8 8%、0.33%，RSD分别为0.7 8%、1.11%（n=6),表明该方法的重复性良好。一批巴豆霜的供试品6 份，每份各约0.1g，精密称定后分别加人一定量的巴豆苷和木兰花碱的对照品溶液，按“2.4.3”项下的方法制备供试品溶液，并测定，结果见表1。计算得到巴豆苷和木兰花碱的平28Feb;32(1)贝达喹啉治疗药物浓度监测方法的建立与应用2024均加样回收率分别为9 8.9 0%、9 9.47%,RSD分别为0.67%,0.36%(n=6)2.5单因素考察称取巴豆霜粉末约10 g，于玻璃皿中铺平，放置于干燥箱中，分别于不同温度烘制不同时间取出后给予不同压力压制一定时间。按“2.4.3 项下方法制备供试品，测定巴豆苷和木兰花碱的含量，计算巴豆生物碱含量综合评分M，确定合适的烘制温度烘时、压时、压力具体条件见表2，结果见图2。在160的条件下烘制10 min后给予2 0 kg压力板压制10 天，巴豆霜生物碱含量最高。2.6巴豆霜炮制工艺的优选2.6.1响应面法试验设计及结果根据单因素实验的结果，采用Design-Expert.13软件，选取烘制温度(A）、烘制时间(B)及压制时间(C)3个影响因素为自表1巴豆霜中巴豆苷和木兰花碱HPLC测定的加样回收率（n=6）取样量样品中量加入量测得量回收率平均值RSD值成分(g)(mg)(mg)(mg)(%）（%）（%）0.10011.20331.122 0 2.276797.910.103 41.21621.12202.318399.150.10061.20731.12202.313799.33巴豆苷98.900.670.104 11.22551.12202.342399.780.10091.20471.12202.298 198.770.10171.20591.12202.291 898.450.10220.48030.445 00.920 099.420.10320.48500.44500.929799.960.101 40.476 60.44500.918999.71木兰花碱99.470.360.10670.50150.445 00.942 699.590.10590.497 70.44500.934799.150.10180.47850.44500.914098.981001A100B100C100D80908080(%）号装8060-60-6070404040-6020-5020-2004000-80120 16020005101520051015200102030烘制温度()烘制时间（min）压制时间(d)压制压力(kg)图2单因素考察（A)烘制温度、（B)烘制时间、(C)压制时间、(D)压制压力对巴豆霜生物碱含量的影响(n=3)表2单因素试验设计表因素组别烘制温度（）炒烘制时间（min）压制时间（d）压力(kg)180101020210010102031201010204140101020516010102061801010207160310208160510209160101020101601510201116010120121601032013160105201416010102015160101520161601010517160101010181601010151916010102020160101025变量，压力对含量的影响不突出，因此选定2 0 kg为定量。以巴豆苷和木兰花碱含量的综合评分M为响应值，运用Box-Behnken模型设计出3个因素、3个水平、17 组的实验，再根据响应面法试验结果，分析3个影响因素与综合评分M之间的关系。试验因素见表3,Box-Behnken试验设计与结果见表4。表3Box-Behnken试验因素水平设计因素水平A烘制温度（）B炮制时间(min)c压制时间(d)-11405501601010118015152.6.2模型方程的建立与方差分析通过Design-Expert.13软件对表4数据进行多元拟合分析，进一步预测最佳炮制工艺参数。得到二元回归方程式：M=92.41-2.21A+3.94B+2.75C-3.03AB+2.03A C+2.45BC-22.15A-5.3B2-1.91C。表5方差分析所示：本研究模型的F=101.15,P0.05，不显著，表明该模型真实可靠，具有可信度及合理性。比较表5中F值可知,3个因素对巴豆生物碱的影响程度为：B(烘制时间）C(压制时间）A（烘制温度）。一次项表明3个因素对巴豆生物碱的含量均具有显著性，而二次项中A、B有显著影响，C对巴豆生物碱含量影响不显著。29PharmaceuticalandClinicalResearch药学与临床研究表4Box-Behnken试验设计与结果序号烘制温度()烘制时间(min）压制时间(d)M(%)116051582.782160101092.013160101091.96414010569.8551605580.98614051060.19718051060.648160101090.04916015582.7310160151594.3411180101570.9412160101093.9913160101094.0614140101570.0915140151075.361618010562.5617180151063.682.6.3响应面的交互作用分析图3为交互作用的响应面图，曲面越陡峭,则该因素对所测得含量的影响越大0 ,由图3A可知，巴豆生物碱含量随烘制温度升高呈现急速增加后有所下降，而在烘制时表5方差分析参数平方和自由度均方FP模型2.592.599288.07101.150.0001A-烘制温度39.03139.0313.70.007 6B-烘制时间124.191124.1943.610.000 3C-压制时间60.67160.6721.30.002 4AB36.78136.7812.920.008 8AC16.56116.565.820.046 7BC24.06124.068.450.022.8A22.065.0312.065.03725.10.0001B2118.211118.2141.510.0004C15.3115.35.370.053 6残差19.9472.85失拟项8.7432.911.040.465 4纯误差11.242.8101.15总误差2612.5316间为11min后趋于平缓，图3B、C 显示压制时间和烘制时间对巴豆生物碱的含量影响不小。等高线图呈椭圆形，说明两自变量间有良好的交互作用，等高线图呈圆形，则交互作用较弱。图3显示烘制温度(A)与烘制时间(B)、压制时间(C)之间有较强的交互作用，而B与C之间的交互作用不显著。ABC1001001009090908807070706060601518015180151513170131701313111111119160916099715015077烘制时间(min)5140温度()压制时间(d)5140温度()压制时间(d)55烘制时间(min)图3两因素交互作用对巴豆生物碱含量的三维图2.（.4最佳工艺的确定与验证通过 Design-Ex-pert.13软件最优分析，根据模型拟合预测巴豆霜炮制的最佳工艺并结合实验的可操作性，对预测的最佳工艺微调为：16 2.8 下烘制12 min，以2 0 kg压力板再压制11.5天，此条件下平行炮制3次并回流提取，测得巴豆霜生物碱含量的综合评分与模型预测值基本吻合，表明优化的炮制工艺稳定可行。见表6。表6最佳炮制工艺验证结果批次巴豆苷含量（%）木兰花碱含量（%）综合评分（%）11.310.4796.4921.330.4999.2331.350.4899.02平均值1.330.4898.25RSD(%)1.502.081.553讨论与总结3.1提取工艺的选择中国药典叫中对巴豆霜脱脂的处理使用的是乙醚，在现代研究中发现石油醚脱脂效果无明显差异。木兰花碱微溶于水，因此在提取方式上选择了索氏提取，可以更充分地提取木兰花碱。在回流溶剂的选择上，本研究考察了纯水、7 5%乙醇、9 5%乙醇，同时还考察了回流时间，发现纯水和9 5%乙醇提取的峰型都较差，纯水的杂质峰较多，而7 5%的乙醇杂质峰较少，巴豆苷和木兰花碱的出峰时间与对照品基本一致，峰形也较好，回流6 h后的峰面积几乎没有增加，因此本研究选定7 5%乙醇回流提取6h。30贝达喹啉治疗药物浓度监测方法的建立与应用3.2色谱条件的选择前期预实验中，考察选择不同的流动相（甲醇-水、甲醇-磷酸水、乙腈-水、乙腈-磷酸水）、不用的流速（0.4、0.5、0.6、0.8、1.0 mLmin*）、不同的波长（2 35、2 6 8、2 9 2 n m），发现使用乙腈-0.1%磷酸-0.1%三乙胺水，流速0.4mLmin,在波长2 6 8 nm下，两物质峰分离均较好，巴豆苷出峰时间保持在5min左右，木兰花碱在2 9 min左右出峰，加入0.1%的三乙胺减少了木兰花碱的拖尾现象。3.3含量综合评分的确定中国药典中仅以巴豆苷为质量评价指标，但研究叫发现木兰花碱也是巴豆霜发挥抗肿瘤作用的成分，因此有必要在巴豆（霜）的质量评价指标中加人木兰花碱。本研究选择同时检测巴豆苷和木兰花碱的含量，使用多指标的综合评分法可以避免单一指标的片面性，全面地分析多种指标的影响因素，使分析结果更加合理客观。对于多指标的权重比，本研究利用熵权法确定了各指标的权重值，与传统的赋权法相比，可避免人为因素导致的干扰，使实验结果精确度高、客观性更强 12 综上，本研究先以单因素考察筛选变量，再结合响应面法，采用现代工艺研究方法优化了巴豆霜的炮制工艺，在一定的烘制温度和时间以及压制时间下，巴豆霜有效成分的含量得到了最大保留。优化后的工艺稳定可行，为巴豆相关制剂研究、巴豆霜质量标准提优及中医临床用药选择提供数据支持。参考文献1国家药典委员会中华人民共和国药典：一部 S北京：中国医药科技出版社，2 0 2 0.2 陈彦琳，金峰，杜杰，等。不同制霜方法制备巴豆霜饮片质量比较 中国现代中药，2 0 15，17(11):1201-3,1232.3刘敬，赵斌，曹晖，等.巴豆霜炮制工艺研究及脂肪油GC测定 J中药材，2 0 2 0,43(5):1111-4.4武晓，刘凤娟，孙荣丽，等。巴豆生物碱药动学研究及体内抗肺癌作用初步评价 中华肿瘤防治杂志，2017,24(22):1557-62.5仲美儒，金颖，周宪春木兰花碱对乳腺癌细胞BT474增殖和干性的影响 J.时珍国医国药，2 0 2 0，31(6):1315-7.6 胡静，王艳，宋丽丽，等.HPLC测定中药巴豆中巴豆苷和木兰花碱的含量 J.中国实验方剂学杂志，2 0 15,21(8):39-42.7夏提古丽塔西买买提，赵媛，刘艺，等嫡权法-层次分析法结合Box-Behnken响应面法优化雪莲益肾方的提取工艺 J中国药房，2 0 2 3，34(15)：18 58-6 2.8 ZHAO X,ZHU M,REN X,et al.A new techniquefor determining micronutrient nutritional quality in fruitsand vegetables based on the entropy weight method andfuzzy recognition methodJ.Foods,2022,11(23):3844.9 范玲，唐佳蒙，王鑫，等.正交试验法与Box-Behnken响应面法优选白残花-乌梅药对提取工艺比较J.中国药业，2 0 2 2,31(15)：38-43.10 李华妮，郑连营，葛文静，等。正交试验、响应面法优化加味三根汤的提取工艺比较 中国现代中药，2019,21(8):1089-93.11 唐晓龙，金庆江，王瑞平，等。基于反向分子对接和网络药理学预测木兰花碱抗肿瘤的潜在作用机制 世界科学技术-中医药现代化，2 0 2 1,2 3(4)：110 8-18.12 李芳，李东坪基于嫡权法的组合评价模型 J信息技术与信息化，2 0 2 1(9)：148-50.Optimization of Croton Powder Processing with Multiple Indicators Basedon Response Surface and EntropyWeight Methods*WU Yan,TANG Xiaolong,CHEN Guoxin,FAN Ling,ZHU XiaojingPharmacy Department;Department of Oncology,Suzhou Hospital of Integrated Traditional Chinese andWestern Medicine,Suzhou 205101,ChinaABSTRACTObjective:To optimize the processing of croton powder using multi indicators.Methods:Using the effective components crotonic and magnolian alkaloids in croton powder as evaluation indicators,methods of response surface combined with entropy weight were used to investigate the effects of differentbaking temperatures,baking times,and pressing times on the processing of croton powder.Results:Afterbaking at 162.8C for 12 minutes and pressing with a 20kg pressure plate for 11.5 days,the comprehen-sive score of the alkaloid contents in croton cream was 98.25%.Conclusion:The multi indicator evalua-tion method based on response surface combined with entropy weight is reliable,which provides a basis forthe quality evaluation standards of croton powder and the quality research of croton related preparations.KEY WORDSCroton powder;Croton glycoside;Magnolia alkaloid;Response surface method;Entropyweight method