生物样品分析方法的基本要求省公共课一等奖全国赛课获奖课件.pptx

第四节 生物样品分析方法基本要求 在测定生物样品中药品及其代谢物时，普通要在测定前进行样品前处理，即进行分离、纯化、浓集。第1页一、惯用具种种类、采集和贮藏 生物样品包含各种体液和组织，惯用是血液（血浆、血清、全血）、尿液、唾液。第2页（一）血样 血浆（plasma)和血清（serum)是最惯用生物样品。测定血中药品浓度通常是指测定血浆或血清中药品浓度，而不是指含有血细胞全血中药品浓度。普通认为，当药品在体内到达稳定状态时，血浆中药品浓度与药品在作用点浓度紧密相关，即血浆中药品浓度反应了药品在体内（靶器官）情况，因而血浆浓度可作为作用部位药品浓度可靠指标。第3页 1.取样：供测定血样应能代表整个血药浓度，因而应待药品在血液中分布均匀后取样。动物试验时，可直接从动脉或心脏取血。对于病人，通常采取静脉血，有时依据血药浓度和分析方法灵敏度。也可用毛细管采血。第4页 2.制备：血浆制备 将采取血液置含有抗凝剂（如：肝素、草酸盐等）试管中，混合后，离心，分离血细胞，上清液即为血浆。肝素是一个含硫酸盐粘多糖，惯用其钠盐、钾盐，它能阻止凝血酶原转化为凝血酶，从而抑制纤维蛋白原形成纤维蛋白。普通lml全血需加0.10.2mg肝素，加入血样后马上轻轻旋摇，但勿太猛烈，以免造成血细胞破裂。第5页 血清制备 血清是由血液中纤维蛋白原等影响下，引发血液凝结而析出澄清黄色液体，经离心其量约为全血量30一50。在室温高时，血凝过程进行得很快，宜在血凝后半小时内分离血清。当室温低时，血凝过程较慢，可将血液置37温度下加速血清析出。血浆及血清中药品浓度测定值通常是相同。第6页 全血也应加入抗凝剂混匀，预防凝血。对大多数药品来说血浆浓度与红细胞中浓度成正比，所以测定全血也不能提供更多数据。因为全血净化较血浆和血清麻烦，尤其是溶血后，血色素等可能会给测定带来影响。第7页3.特点：血样采取量受到限制、间隔时间，采集方法：普通取1ml2m1。用注射器、毛细管或微量采血管采取。血样采血时间间隔应随测定目标不一样而异。采取血样后，应及时分离血浆或血清，并马上进行分析。如不能马上测定时，应完全密塞后保留，短期冷藏（4），长久冷冻（-20）保留。第8页（二）唾液 唾液采集应尽可能在刺激少平静状态下进行。普通在漱口后15min搜集。采集后马上测量其除去泡沫部分体积。放置后分为泡沫部分、透明部分及灰乳白色沉淀部分三层。分层后离心分离，取上清液作为药品浓度测定样品。可集中、单一部位采集。第9页 唾液中含有粘蛋白，为阻止粘蛋白生成，应将唾液在4以下保留，解冻后搅匀后再用，不然会产生误差。优点：能够不受时间和地点限制，很轻易地重复采集，采集时无痛苦无危险；有些唾液中药品浓度能够反应血浆中游离型药品浓度。第10页缺点：唾液是各腺体分泌混合液体，其组成发生经时变动；所以，唾液中药品浓度与血浆中游离型药品浓度相比就轻易变动；唾液中药品浓度与血浆中药品浓度比值(S/P)只有少数药品是恒定值；有些与蛋白结合率较高药品，药品在唾液中浓度比血浆浓度低得多，需要高灵敏度分析方法才能检测；对有些患者（如癫痛二昏迷）不能采集唾液样品。第11页（三）尿液 尿药测定主要用于药品剂量回收研究、尿去除率、生物利用度研究。体内药品去除主要是经过尿液排出，药品能够原型（母体药品）或代谢物及其缀合物（conjugates）等形式排出。尿液主要成份是水、含氮化合物（其中大部分是尿素）及盐类。第12页 尿液中药品浓度较高，搜集量能够很大，也方便，但尿液浓度通常改变较大，应测定一定时间内排入尿中药品总量，这就需要测定在要求时间内尿液体积及尿药浓度，时间尿以外尿不可能推断全尿中药品排泄浓度和药品总量。第13页 测定尿中药品总量时，将一定时间内（如8h;12h或24h等）排泄尿液全部储存起来，并统计其体积，取其一部分测定药品浓度，然后乘以尿量求得排泄总量。采集尿液时，需用量筒准确地测量储尿量，并做好统计。第14页 缺点：尿液中药品浓度与血药浓度相关性差；受试者肾功效正常是否直接影响药品排泄，因而肾功效不良者不宜采集尿样；婴儿排尿时间难于掌握；尿液不易采集完全并不易保留。采集尿样应马上侧定。若搜集24h尿液不能马上测定时，应加入防腐剂置冰箱中保留。惯用防腐剂有：甲苯等，短时冷藏；长时冷冻。第15页二 生物样品分析其前处理技术 主要应考虑生物样品种类，被测定药品性质和测定方法三个方面问题。样品分离、纯化技术应该依据生物样品类型。比如，血浆或血清需除蛋白，使药品从蛋白结合物中释出；唾液样品则主要采取离心沉淀除去粘蛋白；尿液样品常采取酸或酶水解使药品从缀合物中释出。第16页 依据被测定药品结构、理化性质及药理性质、存在形式、浓度范围等，采取对应前处理方法。87页图4-4大致反应了检测方法与样品前处理要求相互关系。第17页（一）去除蛋白质目标：可使结合型药品释放出来，方便测定药品总浓度；去除蛋白质也可预防提取过程中蛋白质发泡，降低乳化形成，以及能够保护仪器性能，延长使用期限。第18页去除蛋白质方法：1.加入与水相混溶有机溶剂 加入水溶性有机溶剂，可使蛋白质分子内及分子间氢键发生改变而使蛋白质凝聚，使与蛋白质结合药品释放出来。惯用水溶性有机溶剂有：乙睛、甲醇等。含药品血浆或血清与水溶性有机溶剂体积比为1:（1-3)时，就能够将90%以上蛋白质除去，采取超速离心机（10000r/min)离心便可将析出蛋白质完全沉淀。第19页 2.加入中性盐 使溶液离子强度发生改变。中性盐能将与蛋白质水合水置换出来，从而使蛋白质脱水而沉淀。惯用中性盐：饱和硫酸胺等。盐析方法与有机溶剂提取法常并用，药品回收率高。第20页 3.加入强酸 当pH低于蛋白质等电点时，蛋白质以阳离子形式存在，加入强酸，可与蛋白质阳离子形成不溶性盐而沉淀。惯用强酸有：10%三氯醋酸等。含药品血清与强酸百分比为1:0.6混合，高速离心,就可除去蛋白质，取上清液作为样品。在酸性下分解药品不宜用本法除蛋白。第21页 4.加入含锌盐及铜盐沉淀剂当pH高于蛋白质等电点时，金属阳离子与蛋白质分子中带阴电荷羧基形成不溶性盐而沉淀。惯用沉淀剂有：CUS04-Na2W04,ZnS04-NaOH等。含药品血清与沉淀剂百分比为1:2混合，高速离心、分离后得上清液。第22页5.酶解法 在测定一些酸不稳定及蛋白结合牢药品时，常需用酶解法。最惯用酶是蛋白水解酶中枯草菌溶素。第23页（二）缀合物水解 尿中药品多数呈缀合状态。含羟基、羧基、氨基和巯基药品。可与内源性物质葡萄糖醛酸形成葡萄糖醛酸苷缀合物；含酚羟基、芳胺及醇类药品与内源性物质硫酸形成硫酸酯缀合物。因为缀合物较原型药品含有较大极性，不易被有机溶剂提取，惯用酸水解或酶水解方法。第24页 酸水解时，可加入适量盐酸液。对于遇酸及受热不稳定药品，能够用酶水解法。惯用葡萄糖醛酸苷酶或硫酸酯酶或葡萄糖醛酸苷酶一硫酸酯酶混合酶。第25页（三）分离、纯化与浓集 1.液液提取法（liquid-liquid extraction;LLE)多数药品是亲脂性，在适当有机溶剂中溶解度大于在水相中溶解度，而血样或尿样中含有大多数内源性杂质是强极性水溶性物质。因而用有机溶剂提取一次即可除去大部分杂质。第26页 应用本法时要考虑所选有机溶剂特征、有机溶剂相和水相体积及水相pH值等。对所选取有机溶剂，要求对被测组分溶解度大：沸点低，易于浓集、挥散；与水不相混溶以及无毒、化学稳定、不易乳化等。最惯用溶剂是乙醚和氯仿等。提取时所用有机溶剂要适量。普通有机相与水相（体液样品）容积比为1：1或2:1。第27页 生物样品普通多在碱性下提取，多数药品是亲脂性碱性物质，生物样品中内源性物质多是酸性。当碱性药品在碱性pH不稳定时，则在近中性pH处用氯仿和异丙醇提取。第28页 提取时于水相（体液样品）中加入有机溶剂后，普通只提取一次。如有必要还须将第一次提取分离出含药品有机相再用一定pH水溶液反提取（back extraction），然后再从水相将药品提取到有机相。液-液提取法优点在于它选择性，这是依赖于有机溶剂选择。极性大药品使用离子对试剂（ion pair reagent）离子对提取法（ion pair extraction method）。第29页2.液-固提取法（liquid-solid extraction，LSE）也为一个柱色谱法。将含有吸附、分配及离子交换性质、表面积大担体作为萃取剂填入小柱，以溶剂淋洗后，将生物样品经过，使其药品或杂质保留在担体上，用适当溶剂洗去杂质，再用适当溶剂将药品洗脱下来。第30页 LSE含有优点：LSE较少引入杂质；消除了LLE主要缺点乳化现象；提取效率高，可用少许生物样品进行分析；柱为可弃型，废弃物易从试验室移走；在最终洗脱中多数采取以水为主溶剂系统，大大增加了安全性；最大优点为处理样品速度快，并在室温下操作，尤其适于处理挥发性及对热不稳定药品。第31页惯用于填充柱担体大致分为两类：1.亲水性硅藻土，有机溶剂冲洗药品 2.疏水活性炭、聚苯乙烯或C18化学键合硅胶，吸附亲酯性药品，然后用有机溶剂分离药品。第32页3.被测组分浓集方法：末次提取时加入提取液尽可能少，然后直接测定。氮气流吹干 减压法挥去溶剂第33页（四）化学衍生化 分离前将药品进行化学衍生化目标是：使药品变成含有能被分离性质提升检测灵敏度增强药品稳定性；提升对光学异构体分离能力等。药品分子中含有活泼H者均可被化学衍生化，如含一COOH、-OH、-NH2、-NH-、-SH等官能团药品都可被衍生化。第34页 1.GC中化学衍生化法 药品化学衍生化前处理对GC十分必要，衍生化可使药品分子中极性基团，如羟基、氨基、羧基等变成无极性、易于挥发药品，从而使GC温度无须很高即可适合GC分析要求，主要衍生化反应有烷基化（alkylations）、酰化（acylations）、硅烷化（silylations）等。其中以硅烷化用得最广泛。第35页 惯用烷基化试剂：碘庚烷、叠氮甲烷、氢氧化三甲基苯胺（TMAH）等；惯用酰化试剂：乙酸酐、丙酸酐等；硅烷化试剂：三甲基氯硅烷（咖CS）、双-三甲基硅烷乙酰胺（BSA）、双-三甲基硅烷三氟乙酰胺（BSTFA）、三甲基硅烷咪唑（IMTS）等。第36页 含有光学异构体药品分离也可采取不对称试剂，使其生成非对映异构体衍生物，然后用GC法或HPLC法进行分析测定。惯用不对称试剂有：（S）-N-三氟乙酰脯氨酰氯、（S）-N-五氟乙酰脯氨酰氯等。第37页2.HPLC中化学衍生化法 衍生化目标是为了提升药品检测灵敏度。化学衍生化包含柱前衍生化和柱后衍生化两种方法。第38页 柱前衍生化分析前尽可能将药品进行精制后再衍生化。柱后衍生化是药品经色谱柱分离之后进行，所以可形成对检测器含有高灵敏度衍生物，从而提升了选择性。HPLC法惯用衍生化试剂有邻苯二醛、丹酰氯、荧胺等。第39页三、生物样品定量分析方法验证（一）特异性 证实所测定物质是原形药品或特定活性代谢物（二）标准曲线与线性范围 回归方程相关系数r0.9900。在线性范围内浓度测定结果应到达试验要求精密度和准确度。第40页（三）精密度与准确度（三）精密度与准确度 药典附录药典附录药品制剂人体生物利药品制剂人体生物利用度和生物等效性试验指导标准用度和生物等效性试验指导标准要要求考查求考查3 3个浓度精密度和准确度。个浓度精密度和准确度。普通普通RSDRSD应小于应小于15%15%，在，在LOQLOQ附近附近RSDRSD应小于应小于20%20%。第41页 批内精密度：是同一次测定精批内精密度：是同一次测定精密度。所得密度。所得RSD应争取到达应争取到达5以以内，但不能超内，但不能超10。批间精密度：是不一样次测定批间精密度：是不一样次测定精密度。所得精密度。所得RSD应控制在应控制在15以以内。内。回收率普通应在回收率普通应在85%115%范围内，在范围内，在LOD附近应在附近应在80%一一120范围内。范围内。第42页（四）最低定量限 最低定量限LOQ最少能满足测定3-5个半衰期时样品中药品浓度或Cmax1/10一1/20时药品浓度。（五）样品稳定性 在室温、冰冻和冻融条件下以及不一样存放时间进行稳定性考查，以确定生物样品存放条件和时间。第43页（六）提取回收率 绝对回收率 考查高、中、低3个浓度提取回收率，它是预处理（提取）过程回收率，反应出样品预处理过程中组分丢失情况，是评价萃取方案优劣指标之一，普通低于100%，不过重现性要好。第44页（七）质控样品 质控样品系将已知量待测药品加入到生物介质中配制样品，用于质量控制。（八）质量控制 分析方法确证后开始测试未知样品。每批生物样品测定时应建立新标准曲线，并平行测定高、中、低3个浓度质控样品。质控样品测定结果偏差普通应小于20%。第45页