生物大分子识别分离和检测省公共课一等奖全国赛课获奖课件.pptx

生物大分子生物大分子识别、分离和检测识别、分离和检测第1页生物大分子生物大分子生物大分子生物大分子:指分子量大于10,000，有复杂空间结构，含有生物活性物质；如多肽、蛋白质、酶等。特征：特征：含有特定生化结构（组成，序列和构象）分子量大，分子极性强 对温度、pH值、剪切力、有机溶剂等非常敏感第2页生物大分子识别生物大分子识别“看清看清”生物大分子生物大分子“是谁是谁”；“看清看清”生物大分子生物大分子“是什么样子是什么样子”。第3页 质谱测定分析质谱测定分析 一个识别生物大分子方法一个识别生物大分子方法 质谱测定分析法是经过测定样品中物质质量来识别物质类别。质谱测定分析法是经过测定样品中物质质量来识别物质类别。传统质谱分析方法是：传统质谱分析方法是：首先将成团蛋白质分子拆分成各自独立单个分子，将其电离首先将成团蛋白质分子拆分成各自独立单个分子，将其电离并使之悬浮在真空中，然后让它们在电场作用下运动。并使之悬浮在真空中，然后让它们在电场作用下运动。这种方法缺点在于生物大分子比较脆弱，在拆分和电离成团这种方法缺点在于生物大分子比较脆弱，在拆分和电离成团生物大分子过程中它们结构和成份很轻易被破坏。生物大分子过程中它们结构和成份很轻易被破坏。第4页美国科学家约翰芬恩，获诺贝尔化学奖日本科学家田中耕一，获诺贝尔化学奖对成团生物大分对成团生物大分子施加强电场子施加强电场用软激光轰击成用软激光轰击成团生物大分子团生物大分子使生物大分子相互完整地分离，同时也被电离使生物大分子相互完整地分离，同时也被电离。第5页芬恩电喷雾质谱技术（芬恩电喷雾质谱技术（ESIESI）原理图）原理图田中耕一软激光解吸附质谱技术（田中耕一软激光解吸附质谱技术（RLD）原理图）原理图质谱测定方法处理了质谱测定方法处理了“看清看清”生物大分子生物大分子“是谁是谁”问题问题第6页电喷雾电喷雾质谱质谱法法electron spray mass spectrometry ESMSelectron spray mass spectrometry ESMS 样品溶液经很细进样管进入电喷雾室，在强电场作用下，样品溶液经很细进样管进入电喷雾室，在强电场作用下，样品溶液在出口处因电荷分离和静电引力而破碎成许多细样品溶液在出口处因电荷分离和静电引力而破碎成许多细小带有电荷液滴，当液滴蒸发到某一程度，液滴表面库仑小带有电荷液滴，当液滴蒸发到某一程度，液滴表面库仑斥力使液滴爆炸。产生小带电液滴继续此过程。伴随液滴斥力使液滴爆炸。产生小带电液滴继续此过程。伴随液滴水分子逐步蒸发，就可取得自由徘徊质子化和去质子化蛋水分子逐步蒸发，就可取得自由徘徊质子化和去质子化蛋白分子。白分子。第7页电喷雾液相色谱质谱联用仪电喷雾液相色谱质谱联用仪第8页 样品分子离子和裂片离子经一系列分离器和静电透镜进入样品分子离子和裂片离子经一系列分离器和静电透镜进入质量分析器进行质谱分析。质量分析器进行质谱分析。这种电喷雾质谱法含有很高灵敏度，且电离分子能够带有这种电喷雾质谱法含有很高灵敏度，且电离分子能够带有多电荷，这种多电荷离子产生大大扩展了普通质谱仪能分多电荷，这种多电荷离子产生大大扩展了普通质谱仪能分析质量范围，使质谱仪能够分析分子量为几十万质量单位析质量范围，使质谱仪能够分析分子量为几十万质量单位蛋白质分子。准确度到达蛋白质分子。准确度到达99.99%99.99%。第9页 激光解吸附电离飞行时间质谱激光解吸附电离飞行时间质谱 Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight Mass Spectrometry（MALDI-TOF MS）MALDI-TOF MALDI-TOF MSMS原理是：当用一定强度激光照射样品与基质形成共结晶薄原理是：当用一定强度激光照射样品与基质形成共结晶薄膜，基质从激光中吸收能量，样品解吸附，基质膜，基质从激光中吸收能量，样品解吸附，基质-样品之间发生电荷转移使得样品分子电离，电离样品在电场样品之间发生电荷转移使得样品分子电离，电离样品在电场作用下加速飞过飞行管道，依据抵达检测器飞行时间不一样作用下加速飞过飞行管道，依据抵达检测器飞行时间不一样而被检测，即测定离子质量电荷之比（而被检测，即测定离子质量电荷之比（M/ZM/Z）与离子飞行时间）与离子飞行时间成正比来检测离子。成正比来检测离子。MALDI-TOF-MALDI-TOF-MSMS中心技术就是依据样品质荷比（中心技术就是依据样品质荷比（m/zm/z）不一样来进行检测，）不一样来进行检测，并测得样品分子分子量。并测得样品分子分子量。第10页 MALDI-TOF MALDI-TOF MSMS含有灵敏度高、准确度高、分辨含有灵敏度高、准确度高、分辨率高、图谱简明、质量范围广及速率高、图谱简明、质量范围广及速度快等特点，在操作上制样简便、度快等特点，在操作上制样简便、可微量化、大规模、并行化和高度可微量化、大规模、并行化和高度自动化处理待检生物样品，而且在自动化处理待检生物样品，而且在测定生物大分子和合成高聚物应用测定生物大分子和合成高聚物应用方面有特殊优越性。近年来已成为方面有特殊优越性。近年来已成为检测和判定多肽、蛋白质、多糖、检测和判定多肽、蛋白质、多糖、核苷酸、糖蛋白、高聚物以及各种核苷酸、糖蛋白、高聚物以及各种合成聚合物强有力工具。合成聚合物强有力工具。激光解吸附电离质谱仪激光解吸附电离质谱仪第11页 在核磁共振技术出现以前，在核磁共振技术出现以前，X X射线晶体分析技术是惟一能够射线晶体分析技术是惟一能够研究蛋白质三维结构方法。该法是依据蛋白质结晶对研究蛋白质三维结构方法。该法是依据蛋白质结晶对X X射线射线衍射作用实现。但该法不能对溶液进行分析。衍射作用实现。但该法不能对溶液进行分析。核磁共振技术填补了核磁共振技术填补了X X射线晶体分析技术不足，能够对溶液射线晶体分析技术不足，能够对溶液中蛋白质进行分析，即在蛋白质最自然生存环境下对它们进中蛋白质进行分析，即在蛋白质最自然生存环境下对它们进行研究，进而得到行研究，进而得到“活活”蛋白质结构。蛋白质结构。核磁共振一种揭示生物大分子真面目方法第12页 在结晶状态下蛋白质分子是紧紧地积压在一起，而在溶液中在结晶状态下蛋白质分子是紧紧地积压在一起，而在溶液中它们则处于最自然生理状态下。它们则处于最自然生理状态下。朊病毒蛋白质分子中肽朊病毒蛋白质分子中肽链有二分之一（链有二分之一（23-23-120120）在水溶液中是展现）在水溶液中是展现无规则、涣散、灵活多无规则、涣散、灵活多变状态。变状态。应用核磁共振技术测定朊应用核磁共振技术测定朊病毒蛋白质分子结构图病毒蛋白质分子结构图 核磁共振法独到之处是测定溶液中蛋白质，是在最靠近分子自然生理状核磁共振法独到之处是测定溶液中蛋白质，是在最靠近分子自然生理状态条件下进行测定。态条件下进行测定。第13页 维特里希设计了一套将核磁共振信号与生物大分子中质维特里希设计了一套将核磁共振信号与生物大分子中质子相对应系统分析方法。子相对应系统分析方法。他他深入说明这些质子间距离怎深入说明这些质子间距离怎样确定，再结合距离几何学数学方法就可取得大分子清样确定，再结合距离几何学数学方法就可取得大分子清楚三维结构图。楚三维结构图。瑞士科学家库尔特维特里希，获诺贝尔化学奖第14页 假如确定了一座建筑物全部工程数据，就能够快速而准确地假如确定了一座建筑物全部工程数据，就能够快速而准确地绘出该建筑物三维结构图。绘出该建筑物三维结构图。核磁共振技术方法处理了核磁共振技术方法处理了“看清看清”生物大分子生物大分子“是什么样是什么样子子”问题。问题。第15页生物大分子分离与检测生物大分子分离与检测 生物大分子通常来自天然产物或发酵液中，并以混合物、生物大分子通常来自天然产物或发酵液中，并以混合物、低浓度状态存在。低浓度状态存在。除了分子量大，还含有结构复杂（具三级或四级结构）除了分子量大，还含有结构复杂（具三级或四级结构），含有生物活性，一旦条件不适合就丧失活性，所以在，含有生物活性，一旦条件不适合就丧失活性，所以在分离技术上与普通小分子有机物分离有差异。分离技术上与普通小分子有机物分离有差异。质谱质谱色谱色谱第16页色谱法色谱法 由液相色谱、气相色谱和毛细管电泳等所组成色谱学是当代分由液相色谱、气相色谱和毛细管电泳等所组成色谱学是当代分离、分析主要组成部分。离、分析主要组成部分。液相色谱与毛细管电泳技术是当前已知两种最有效分离生物大液相色谱与毛细管电泳技术是当前已知两种最有效分离生物大分子方法。分子方法。毛细管电泳处理量小，在分离过程中会破坏生物大分子构象、毛细管电泳处理量小，在分离过程中会破坏生物大分子构象、降低其生物活性。降低其生物活性。液相色谱普通在室温下进行，所用流动相为液体，固定相表面液相色谱普通在室温下进行，所用流动相为液体，固定相表面经过各种化学修饰，能为生物大分子分离提供经过各种化学修饰，能为生物大分子分离提供“软接触软接触”温和温和相互作用，所以成为分离生物大分子强有力伎俩。相互作用，所以成为分离生物大分子强有力伎俩。第17页膜色谱技术膜色谱技术 膜色谱技术是液相色谱与膜分离相结合一个新技术，融合了二膜色谱技术是液相色谱与膜分离相结合一个新技术，融合了二者之长，含有快速、高效、高选择性、易于放大等特点，能满者之长，含有快速、高效、高选择性、易于放大等特点，能满足生物大分子高效分离与纯化需要。足生物大分子高效分离与纯化需要。膜色谱采取含有一定孔径膜作为介质膜色谱采取含有一定孔径膜作为介质,连接配基连接配基,利用膜配基与利用膜配基与生物大分子之间相互作用进行分离纯化。生物大分子之间相互作用进行分离纯化。当料液以一定流速流过膜时，目标分子与膜介质表面或膜孔内当料液以一定流速流过膜时，目标分子与膜介质表面或膜孔内基团特异性结合，而杂质则透过膜孔流出，待处理结束后再经基团特异性结合，而杂质则透过膜孔流出，待处理结束后再经过洗脱液将目标分子洗脱下来，其纯化倍数可达数百乃至上千过洗脱液将目标分子洗脱下来，其纯化倍数可达数百乃至上千倍。倍。第18页膜色谱特点为膜色谱特点为:优点：优点：(1)(1)生物大分子在膜介质中以对流传质为主，分离速度快，生物大分子在膜介质中以对流传质为主，分离速度快，尤其适合用于生物大分子快速分离尤其适合用于生物大分子快速分离 (2)(2)柱压低柱压低 (3)(3)易于放大，只要简单增加柱长就能够到达目标易于放大，只要简单增加柱长就能够到达目标 (4)(4)可直接处理复杂生物样品，几乎不需要与处理可直接处理复杂生物样品，几乎不需要与处理 (5)(5)膜基质生物兼容性好膜基质生物兼容性好缺点：缺点：(1)(1)柱效低柱效低 (2)(2)耐压性差耐压性差第19页当代分离制备技术课程论文备选题当代分离制备技术课程论文备选题1 1.物质分离技术叙述物质分离技术叙述 2.2.天然产物分离提取原理及方法天然产物分离提取原理及方法 3.3.天然产物粗提物纯化原理及方法天然产物粗提物纯化原理及方法 4.4.天然产物定性、定量分析原理及方法天然产物定性、定量分析原理及方法 5.5.天然产物结构分析原理及方法天然产物结构分析原理及方法 6.6.物质定性、定量分析方法适应性物质定性、定量分析方法适应性要求：标注出参考文件。要求：标注出参考文件。论文提交时间：即日起至论文提交时间：即日起至3 3月月3131日止。日止。第20页