丙二醛含量测定.doc

植物组织中丙二醛含量测定

方法一：
一、目的
通过实验，掌握植物体内丙二醛含量测定的原理及方法。
二、原理
丙二醛（MDA）是由于植物官衰老或在逆境条件下受伤害，其组织或器官膜脂质发生过氧化反应而产生的。它的含量与植物衰老及逆境伤害有密切关系。测定植物体内丙二醛含量，通常利用硫代巴比妥酸(TBA)在酸性条件下加热与组织中的丙二醛产生显色反应，生成红棕色的三甲川（3、5、5－三甲基恶唑2、4－二酮），三甲川最大的吸收波长在532nm。但是测定植物组织中MDA时受多种物质的干扰，其中最主要的是可溶性糖，糖与硫代巴比妥酸显色反应产物的最大吸收波长在450nm处，在532nm处也有吸收。植物遭受干旱、高温、低温等逆境胁迫时可溶性糖增加，因此测定植物组织中丙二醛与硫代巴比妥酸反应产物含量时一定要排除可溶性糖的干扰。此外在532nm波长处尚有非特异的背景吸收的影响也要加以排除。低浓度的铁离子能显著增加硫代巴比妥酸与蔗糖或丙二醛显色反应物在532、450nm处的吸光度值，所以在蔗糖、丙二醛与硫代巴比妥酸显色反应中需要有一定的铁离子，通常植物组织中铁离子的含量为100－300μg·g－1Dw，根据植物样品量和提取液的体积，加入Fe3＋的终浓度为0.5nmol· L－1。在532nm、600nm和450nm波长处测定吸光度值，即可计算出丙二醛含量。

三、材料、仪器设备及试剂

1. 材料：植物叶片。
2. 仪器设备：离心机，分光光度计；电子分析天平；恒温水浴；研钵；试管；移液管（1ml、5ml）、试管架；移液管架；洗耳球；剪刀。
3. 试剂：10％三氯乙酸；0.6％硫代巴比妥酸（TBA）溶液：石英砂。

四、实验步骤
1. 丙二醛的提取
称取受干旱、高温、低温等逆境胁迫的植物叶片1g，加入少量石英砂和10％三氯乙酸2ml，研磨至匀浆，再加8ml10％三氯乙酸进一步研磨，匀浆以4000r/min离心10min，其上清液为丙二醛提取液。
2. 显色反应及测定
取4支干净试管，编号，3支为样品管（三个重复），各加入提取液2ml，对照管加蒸馏水2ml，然后各管再加入2ml 0.6％硫代巴比妥酸溶液。摇匀，混合液在沸水浴中反应15min，迅速冷却后再离心。取上清液分别在532、600和450nm波长下测定吸光度（A）值。
五、丙二醛含量计算：
由于蔗糖－TBA反应产物的最大吸收波长为450nm，毫摩尔吸收系数为85.4×10－3，MDA－TBA反应产物在532nm的毫摩尔吸收系数分别是7.4×10－3和155×10－3。532nm非特异性吸光值可以600nm波长处的吸光值代表。
按双组分分光光度法原理，建立方程组，解此方程组即可求出MDA及可溶性糖浓度。
方程组：
A450=（85.4×10－3）·C糖

（A532－A600155×10－3）·CMDA+（7.4×10－3）·C糖
解得：
A450
C糖= —————— = 11.71A450（mmol·L－1）
85.4×10－3

CMDA= 6.45（A532－A600）－0.56A450-（μmol·L－1）

公式中：A450—在450nm波长下测得的吸光度值
A532—在532nm波长下测得的吸光度值
A600—在600nm波长下测得的吸光度值
﹡ —1.55×105为摩尔比吸收系数
C糖、CMDA分别是反应混合液中可溶性糖、MDA的浓度。

1.      按下式计算提取液中MDA浓度

反应液体积（ml）
CMDA × —————————
1000
提取液中MDA浓度（μmol·ml－1）= ———————————————
测定时提取液用量（ml）

2.      按下式计算样品中MDA含量

提取液中MDA浓度（μmol·ml－1）×提取液总量（ml）
MDA含量（μmol·g－1 Fw）= ————————————————————————
植物组织鲜重（g）

方法二:
一、原理
n 丙二醛(MDA)是常用的膜脂过氧化指标，在酸性和高温度条件下，可以与硫代巴比妥酸(TBA)反应生成红棕色的三甲川(3，5，5-三甲基恶唑-2，4。二酮)，其最大吸收波长在532nm。
n 测定植物组织中MDA时受多种物质的干扰，其中最主要的是可溶性糖，糖与TBA显色反应产物的最大吸收波长在450nm，但532nm处也有吸收。植物遭受干旱、高温、低温等逆境胁迫时可溶性糖增加，因此测定植物组织中MDA-TBA反应物质含量时一定要排除可溶性糖的干扰。

二、材料、仪器设备及试剂
（一）材料：植物叶片
（二）仪器设备：
紫外可见分光光度计1台；离心机1台；电子天平1台；
10ml离心管4支；研钵2套；试管4支；刻度吸管：
10ml1支，2ml1支；剪刀1把。
（三）试剂：
10％三氯乙酸(TCA)；
0．6％硫代巴比妥酸：先加少量的氢氧化钠(1mol·L-1)溶解，再用10％的三氯乙酸定容；

三、实验步骤
1．实验材料 受干旱、高温、低温等逆境胁迫的植物叶片或衰老的植物器官。
2．MDA的提取 称取剪碎的试材1g，加入2mll0％TCA和少量石英砂，研磨至匀浆， 再加8mlTCA进一步研磨，匀浆在4000r·min-1离心10min，上清液为样品提取液。
3．显色反应和测定 吸取离心的上清液2ml(对照加2ml蒸馏水)，加入2ml 0．6％TBA溶液，混匀物于沸水浴上反应15min，迅速冷却后再离心。取上清液测定532、600和450nm波长下的消光度。
4．计算含量
(1)直线方程法
MDA与TBA显色反应产物在450nm波长下的消光度值为零。不同浓度的蔗糖(0-25mmol·L-1)与TBA显色反应产物在450nm的消光度值与532nm和600nm处的消光度值之差成正相关，配制一系列浓度的蔗糖与TBA显色反应后，测定上述三个波长的消光度值，求其直线方程，可求算糖分在532nm处的消光度值。
UV-120型紫外可见分光光度计的直线方程为：
Y532＝-0．O0l98十0．088D450 （1）
(2)双组分分光光度法
据朗伯一比尔定律：D＝kCL，当液层厚度为1cm时，kD／C， k称为该物质的比吸收系数。当某一溶液中有数种吸光物质时，某一波长下的消光度值等于此混合液在该波长下各显色物质消光度之和。
已知蔗糖与TBA显色反应产物在450nm和532nm波长下的比吸收系数分别为85．40、 7．40。MDA在450nm波长下无吸收，故该波长的比吸收系数为0，532nm波长下的比吸 系数为155，根据双组分分光度计法建立方程组，求解方
程得计算公式： 式中
C1＝11．71D450 （2）
C2＝6．45(D532-D600)--0.56D450 （3）
C1--可溶性糖的浓度(mmol·L-1)，
C2----MDA的浓度（umol·L-1），
D450、0532、D600分别代表450、532和600nm波长下的消光度值。
以直线方程法计算时，按公式（1）求出样品中糖分在532nm处的消光度值Y532，用实测532nm的消光度值减去6nm非特异吸收的消光度值再减去Y532，其差值为测定样品中MDA-TBA反应产物在532nm的消光度值。按MDA在532nm处的毫摩尔消光系数为155换算求出提取液中MDA浓度。
以双组分分光光度法计算时，按公式（3）可直接求得植物样品提取液中MDA的浓度。
用上述任一方法求得MDA的浓度，根据植物组织的重量计算测定样品中MDA的含量：
MDA含量(umol·g-1)＝MDA浓度(umol·L-1)x提取液体积(ml)／植物组织鲜重(g)