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微生物大小及数量的测定
一、 实验目的：
1、学习并掌握使用显微镜测微尺测定微生物大小的方法
2、 掌握对不同形态细菌细胞大小测定的分类学基本要求，增强对微生物细胞大小的感性认识
3、 学习并掌握使用血细胞计数板测定微生物细胞或孢子数量的方法
二、 实验器材
1、菌种：
枯草芽孢杆菌、酿酒酵母
2、溶液和试剂
香柏油、二甲苯、美兰染液
3、仪器和其他用品
目镜测微尺、镜台测微尺、普通光学显微镜、擦镜纸、软布、血细胞计数板、凹载玻片、盖玻片、接种环、酒精灯、试管、吸管、移液枪
三、 实验原理
1、测微尺：
微生物大小的测定，需要借助于特殊的测量工具——显微测微尺，它包括目镜测微尺和镜台测微尺两个互相配合使用的部件。
镜台测微尺是一个在特制载玻片中央封固的标准刻尺，其尺度总长为1mm，精确分为10个大格，每个大格又分为是10个小格，共100个小格，每个小格长度为0.01mm，即10μm。刻线外有一直径为φ3，粗线为0.1mm的圆，以便调焦时寻找线条。刻线上还覆盖有厚度为0.17mm的盖玻片，可保护刻线久用而不受损伤。。镜台测微尺并不直接用来测量细胞的大小，而是用于校正目镜测微尺每一格的相对长度。
目镜测微尺是一块可放入接目镜内的圆形小玻片，其中央有精确的等分刻度，一般有等分为50个小格和100个小格两种。测量时，需将其放在接目镜中的隔板上，用以测量经显微镜放大后的细胞物象。由于不同显微镜或不同的目镜和物镜组合放大倍数不一样，目镜测微尺每小格在不同条件下所代表的实际长度也不一样。因此，用目镜测微尺测量微生物大小时，必须先用镜台测微尺进行校正，以求出该显微镜在一定放大倍数的目镜和物镜下，目镜测微尺每小格所代表的相对长度。然后根据微生物细胞相当于目镜测微尺的格数，即可计算出细胞的实际大小。
球菌用直径表示大小，杆菌用长和宽来表示大小

2、显微镜计数：
显微镜计数是将少量待测样品的悬浮液置于一种特定的具有确定容积的载玻片上（又称计菌器），于显微镜下直接观察、计数的方法。目前国内外常用的计菌器有：血细胞计数板、Peteroff-Hauser计菌器以及Hawksley计菌器等，它们可用于各种微生物单细胞（孢子）悬液的计数，基本原理相同。其中血细胞计数板较厚，不能用油镜，常用于个体相对较大的酵母细胞、霉菌孢子等的计数，而后两种计数器浇薄，可拥油镜对细菌等较小的细胞进行观察和计数。除了使用上述这些计菌器外，还有用已知颗粒浓度的样品如血液与未知浓度的微生物细胞样品混合后根据比例推算后者浓度的比例计数法。显微镜计数法的优点是直观、快速、操作简单，缺点则是所测得的结果通常是死菌体和活菌体的总和，且难以对运动性强的活菌进行计数。目前已有一些方法可以克服这些缺点，如结合活菌染色、微室培养以及加细胞分裂抑制剂等方法来达到只计数活菌体的目的，或用染色处理等杀死细胞以计数运动性细菌等。本实验以常用的血细胞计数板为例对显微计数法的具体操作的具体操作进行介绍。
血细胞计数板是一块特制的载玻片，其上由4条槽构成3个平台。中央较宽的平台又被一短槽横隔成两半，每一边的平台上各刻有一个方格网，每个方格网共分成9个大方格，中间的大方格即为计数室。计数室的刻度一般有两种规格，一种是一个大方格分为25个中方格，而每个中方格又分为16个小方格；另一种是一个大方格分为16个中方格，而每个中方格又分为25个小方格，但无论哪一种规格的计数板，每一个大方格中的小方格数都是400个。每一个大方格边长为1mm，则每一个大方格的面积为1mm²，盖上盖玻片后，盖玻片与载玻片之间的高度为0.1mm，所以计数室的容积为0.1mm³。
计数时，通常数5个中方格的总菌数，然后求得每个中方格的平均值，再乘以25或16，就得出一个大方格中的总菌数，然后再换算成1ml菌液中的总菌数。
以25个中方格的计数板为例，设5个中方格中的总菌数为A，菌液稀释倍数为B，则：
1ml菌液中的总菌数=A÷5×25×10^4×B
血球计数板的构造
血球计数板网的分区与分隔
3．菌种的选取：
微生物细胞的大小是微生物基本的形态特征，也是分类鉴定的依据之一。从分类角度来说，对不同形态微生物细胞大小的测量有不同的要求。例如，球菌是用直径范围表示其大小，杆菌和螺菌则是用细胞的直径和长度的范围来表示，但杆菌测量的是细胞的直接长度，而螺菌测量的是菌体两端的距离而非细胞实际长度。一般来说，同种不同个体的细菌细胞直径的变化范围较小，分类学指标价值更大，而长度相对来说变化范围较大。
显微镜直接计数法适宜对能在液体中均匀分散的微生物细胞或孢子的数量进行直接计数。通常使用的血细胞计数板不适合使用油镜，因此采用个体较大的酵母细胞及霉菌孢子作为实验材料，以保证实验的观察效果。
四、 实验步骤：
（1）菌体大小的测定：
1、目镜测微尺的安装：
取出目镜测微尺，把目镜上的透镜旋下，将目镜测微尺刻度朝下放在目镜筒内的隔板上，然后旋上目镜透镜，再将目镜插回镜筒内。
双目显微镜的左目镜通常配有屈光度调节环，不能被取下，因此使用双目显微镜时目镜微测尺一班都安装在右目镜中。
2、校正目镜测微尺：
将镜台测微尺刻度面朝上放在显微镜载物台上。先用低倍镜观察，将镜台测微尺有刻度的部分移至视野中央，调节焦距，当清晰地看到镜台测微尺的刻度后，转动目镜使目镜测微尺的刻度与镜台测微尺的刻度平行。利用推进器移动镜台测微尺，使两尺在某一区域内两线完全重合，然后分别数出两重合线之间镜台测微尺和目镜测微尺所占的格数。
用同样的方法换成高倍显微镜和油镜进行校正，分别测出再高倍镜和油镜下，两重合线之间两尺分别所占的格数。
由于已知镜台测微尺每格长10μm，根据下列公示即可分别计算出在不同放大倍数下，目镜测微尺每格所代表的的长度。
目镜测微尺每格长度（μm)=两重合线间镜台测微尺格数×10／两重合线间镜台测微尺格数
3、菌体大小测定：
目镜测微尺校正完毕后，取下镜台测微尺，换上细菌染色制片。先用低倍镜和高倍镜找到标本后，换油镜测定酿酒酵母的直径和枯草芽孢杆菌的宽度和长度。测定时，通过转动目镜测微尺和移动载玻片，测出细菌直径或宽和长所占目镜测微尺的格数。最后将所测得的格数乘以目镜测微尺每格所代表的的长度，即为该菌的实际大小。
值得注意的是，和动植物一样，同一种群中的不同细菌细胞之间也存在个体差异，因此在测定每一种细菌细胞的大小时应至少随机选择10个细胞进行测量，然后计算平均值。
4、测定完毕：
测量完毕后取出目镜测微尺，将接目镜放回镜筒，再将目镜测微尺和镜台测微尺分别用擦镜纸擦干净，放回盒内保存。
（2） 显微镜计数
1、菌悬液稀释：
按照实验所需倍数稀释菌悬液，本实验将酿酒酵母稀释了20倍，得到的适合计数的菌悬液。
2、检查血细胞计数板：
在加样前，应先对血细胞计数板的计数室进行镜检。若有污物，可用自来水冲洗，再用95%的乙醇棉球轻轻擦洗，然后用吸水纸吸干或用电吹风吹干。
计数板上的计数室的刻度非常精细，清洗时切勿使用刷子等硬物，也不可用酒精灯火焰烘烤计数板。
3、加样品：
将清洁干燥的血细胞计数板盖上盖玻片，再用无菌的毛细滴管将摇匀的酿酒酵母菌悬液由盖玻片边缘滴一小滴，让菌液沿缝隙靠毛细渗透作用自动进入计数室，再用镊子轻压盖玻片，以免因菌液过多将盖玻片顶起而改变了计数室的容积。加样后静置5min，使细胞或孢子自然沉降。取样时先要摇匀菌液，加样时计数室不可有气泡产生。
4、显微镜计数：
将加有样品的血细胞计数板置于显微镜载物台上，先用低倍镜找到计数室所在位置，然后换成高倍镜进行计数。若发现菌液太浓或太稀，需重新调节稀释度后再计数。一般样品稀释度要求每小格内有5-10个菌体为宜。每个计数室选5个中格（可选4个角和中央的1个中格）中的菌体进行计数。位于格线上的菌体一般只数上方或右边线上的。如遇酵母出芽，芽体大小达到母细胞的一半时，即作为两个菌体计数。计数一个样品要从两个计数室中计得的平均数值来计算样品的含菌量。
5、清洗：
使用完毕后，将血细胞计数板及盖玻片按前面介绍的程序进行清洗、干燥，放回盒中，以备下次使用。
五、 实验结果：
1、目镜测微尺的标定结果：
物镜
物镜倍数
目镜测微尺格数
镜台测微尺格数
目镜测微尺每格代表的长度/μm
低倍镜
10
5
5
10
高倍镜
40
45
11
2.4
油镜
100
11
1
0.9
2、 微生物大小的测定
酵母菌大小的测定
组别
1
2
3
平均值
长度（μm）
3.6
3.12
3.12
3.28
枯草芽孢杆菌大小测定
组别
1
2
3
平均值
宽度(μm)
0.8
0.8
0.7
0.77
长度(μm)
2.25
2.16
1.95
2.12
3、 酵母菌数量的测定
稀释20倍，计数板25中格*16小格
实验次数
各中格中菌数
总菌数
稀释倍数
平均值
菌数(个/mL)
1
4
5
2
3
1

六、 实验小结：
实验成功应注意的事项有：
1、微生物大小测定时，观察时光线不宜过强，否则难以找到镜台测微尺的刻度；换高倍镜和油镜校正时，务必十分细心，防止接物镜压坏镜台测微尺和损坏镜头。
2、使用镜台测微尺进行校正时，若一时无法直接找到测微尺，可先对刻尺外的圆圈线进行准焦后再通过移动标本推进器进行寻找。
3、细菌个体微小，在进行细胞大小测定时一班应尽量使用油镜，以减少误差。
4、细菌在不同的生长时期细胞大小有时会有较大变化，若需自己制样进行细胞大小测定时，应注意选择处于对数生长期的菌体细胞材料。
5、活细胞是透明的，因此在进行显微计数或悬滴法观察时均应适当减低视野宽度，以增大反差。
6、进行显微技术时应先在低倍镜下寻找大方格的位置，找到计数室后将其移至视野中央，再换高倍镜观察和计数。
七、 思考题：
1．为什么更换不同放大倍数的目镜或物镜时，必须用镜台测微尺重新对目镜测微尺进行校正？
答：由于不同目镜、物镜组合的放大倍数不相同，目镜测微尺每格实际表示的长度也不一样，因此目镜测微尺测量微生物大小时须先用置于镜台上的镜台测微尺校正，以求出在一定放大倍数下，目镜测微尺每小格所代表的相对长度。
2．在不改变目镜和目镜测微尺，而改用不同放大倍数的物镜来测定同一细菌的大小时，其测定结果是否相同？为什么？
答：不相同，不同放大倍数下测量的精度不同。
3．结合你的实验体会，总结哪些因素会造成血球计数板的计数误差？应如何避免？
答：（1）悬菌液未摇匀时取样，摇匀悬菌液。
（2）悬菌液浓度过高或过低，应适当梯度稀释。
（3）菌液滴到盖玻片上，重复计数使结果偏大，滴加菌液时缓慢谨慎，使菌液全部流入计数室内。
（4）计数室的选择不具有代表性看，不选相邻的计数室计数，可以选4个角和中间的任意小室计数。
（5）一会儿数芽体一会儿不数芽体，标准从一而终，数芽体或者不数。
（6）漏数了边线或多数了边线，一般选择上和左边线计数，即“计上不计下，计左不计右”。
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