基于氧化石墨烯纳米微片的荧光生物传感器用于DNA单碱基错配的研究本科毕业论文.doc

DNA Single-Base Mismatch Study Using Graphene Oxide Nanosheets-Based Fluorometric Biosensors基于氧化石墨烯纳米微片的荧光生物传感器用于DNA单碱基错配的研究ABSTRACT:Single nucleotide polymorphisms (SNPs) are frequently associated with various gene-related human diseases, whose determination has attracted great interest.Herein, we report a graphene oxide (GO) nanosheets-based fluorometric DNA biosensor to study the type and location of the single-base mismatch, as well as the influence of the length of the strands.The results indicated that both short and long targets led to much lower fluorescence signals than the perfectly complementary target, while the type of mismatched base had negligible influence on the results.Furthermore, targets with mismatch location near the 5 end led to higher fluorescence intensity than those near the 3 end when the dye was tagged at the 5 end of the probe.摘要：单核苷酸多态性 (SNPs) 经常与人类疾病的各种基因密切相关，有关于其的测定方法引起了科研工作者的极大兴趣。在此我们报道了一个基于氧化石墨烯纳米微片的荧光DNA生物传感器，为了研究单碱基错配的类型和位置以及链长度的影响。结果表明,无论是短的还是长的靶标与完全互补的靶标相比，前者能引发较为低的荧光信号，而不匹配的类型基本对结果的影响可以忽略不计。此外，当染料被标记在探针的5末端时，靠近5末端碱基错配位置的靶标比那些靠近3末端的碱基引发的荧光强度更强。随着新颖DNA生物传感器的发展，超灵敏的DNA生物传感器在不同领域应用已经得到了广泛的关注,如食品工业、环境、制药学、疾病诊断等。由于碱基突变的存在常常与人类疾病的基因密切相关，因此检测单碱基错配显得尤为重要1,2。各种技术用于基因分型单核苷酸多态性 (SNPs)，这是一个给定的单碱基变异和定义基因位置,近年来已报道了许多，其中还包括DNA测序3和其他DNA生物传感器的方法如表面等离子体共振4,5，电化学检测6,7，石英晶体微量天平8,9，声表面波10，等等。然而，所有这些技术都有其特定的优点和缺点3,11。例如，经典的方法中的核酸测序具有较高的特异性，可以检测未知的单核苷酸多态性SNPs，但由于复杂的过程和漫长时间操作的限制。生物传感技术的吞吐量不能实现大规模的基因分型以及通常需要的样本预处理。因此，开发一个灵敏，快速，易于使用，和具有成本效益的方法来识别单核苷酸多态性仍然是一个挑战。 在过去的几年中，许多纳米材料包括纳米金12,13，碳纳米管14,15，氧化石墨烯1618，和MOS 2 1921由于它们具有较高的淬灭效率和良好的生物相容性，所以在各种荧光生物传感器一直作为“纳米猝灭剂”。DNA序列中的单碱基突变的识别，换句话说，单碱基错配与它的互补脱氧核糖核酸是单核苷酸多态性基因分型的基础。例如，氧化石墨烯（GO）已被用于开发一种具有高灵敏的荧光法用于DNA的检测与优良的SNP识别22。 值得注意的是，这些方法一般采用短的染料标记的DNA探针(20-mer)，在完全互补DNA的SNP序列之间具有低的荧光比值。理想上的，对于短的探针序列，无论是未杂交探针的荧光在靶DNA的缺失的情况下，还是在单碱基错配的靶DNA存在条件下都可以通过氧化石墨烯进行有效地淬灭，尽管杂交双链DNA（dsDNA）与互补的靶DNA导致的荧光产生。然而，在DNA检测的实际应用中，靶序列通常是更长的。同时长的单链DNA（ssDNA）的GO淬灭效率低于短的ssDNA。GO淬灭效率 23。因此，在本研究中，我们使用一个长度适中的序列（40个）作为DNA探针检测单核苷酸多态性，而其互补的目标是大肠杆菌O157：H7 eaeA基因的部分序列。靶DNA的长度对荧光传感的影响进行了研究。为了发展更灵敏，简单，高选择性，和具有成本效益的生物传感器，结合一种以前开发的微流体通道装置，从体积非常小的样品中，以获取和处理测量的效率和速度20。我们首次使用基于GO的荧光DNA生物传感器在不同的位置上研究了不匹配的链和突变的类型。实验部分 化学药品和仪器。DNA寡核苷酸的合成和纯化通过 Integrated DNA Technologies Pte, Ltd，其他化学品从SigmaAldrich Pte, Ltd购买，在所有实验中使用的去离子水使用使用微孔过滤系统净化，在所有的实验中使用纯化的拉曼光谱测定 荧光光谱通过拉曼光谱(WITecalpha300 R)测定。所有测量均在室温下的1磷酸盐缓冲溶液（PBS，pH 7.4）进行。 氧化石墨烯纳米微片的制备。氧化石墨烯纳米微片采用改进的Hummer法制得。 24简单的说，石墨粉（5 g）在热溶液(80 C)包含有浓H2SO4 (39 mL) ，K2S2O8 (2.5 g) 和P2O5 (2.5 g)氧化，用超过6h的时间缓慢冷却至室温。然后将混合物稀释，过滤，洗涤，干燥8 h在60C. 这些预氧化石墨粉(2 g) 和 NaNO3 (1.5 g) 加入到46 mL H2SO4中，为了让KMnO4（4 g）在不断搅拌的冰浴下逐步被引入。 得到的溶液在 35 C下继续搅拌 2 h ，接着加入蒸馏水(92 mL, 70 C) 。 获得棕色的分散系再离心和洗涤几次。 DNA荧光的检测。荧光测量方法与我们先前的工作一样。20 PDMS装置与锯齿状的微通道被设计用来是各种样品的得到均匀混合,以及拉曼光谱被用来在微通道的末端测量荧光光谱。结果是在激发波长为532 nm处记录。在一个典型的DNA分析中,荧光探针P1在 1 PBS (pH 7.4) 与目标物杂交用了30min,获得的溶液使用微流体设备与GO (0.1 mg/ mL)混合。在下面的测量中所提到的所有浓度是混合物的最终浓度。结果和讨论 如图1所示，一个TAMRA标记的DNA探针（ P1）被用于检测。所有的DNA寡核苷酸的序列如表1所示。氧化石墨烯纳米微片（SEM图像如图1的插图所示，在碱基和氧化石墨烯纳米微片基面之间能通过范德华力吸附染料标记的ssDNA（P1），然后猝灭它的荧光。Figure 1.Schematic illustration of the GO-based fluorometric DNA sensing assay.Inset shows an SEM image of the GO nanosheets.图1.基于氧化石墨烯荧光DNA传感分析示意图，插图为氧化石墨烯纳米微片的SEM图。当P1与其完全互补的靶DNA（T1）杂交时，形成dsDNA，因为GO/dsDNA的弱结合性，所以它的荧光在加上GO后会被很好的保持，因此,P1的荧光强度可能会提供一个T1的定量性指标。同样,因为DNA的长度 (40- mer)，单碱基错配的序列（远离碱基错配）能够部分与DNA探针杂交形成不完全配对的dsDNA。因此，单碱基错配的目标为P1也可以用这个方法检测。与此相反，P1不能与其不互补的DNA形成的双链DNA（N1），由于GO表面的吸附作用导致它的荧光猝灭。 荧光测量方法是我们先前的工作一样20。 PDMS装置与锯齿形的微管道是专为各种样品混合均匀。 用荧光分光光度计荧光测量，通常至少几百微升样品是必要的。 利用微流控装置，DNA溶液在微管道内的有效容积仅为0.2L，这意味着，对于同一浓度传感，这个平台可以检测较少量的DNA样本。 所有荧光信号使用拉曼光谱记录，由至少六组数据进行误差线。 类似于先前的研究报道17,22，当P1与其互补靶目标T1杂交时形成一dsDNA，GO上仍然存在部分荧光，随着靶目标浓度的增加，其荧光强度是增强的，在050 nM的线性范围内，其检测限为1 nM（图2A）。 最重要的是，因为DNA溶液在微管道内的有效容量，这种微流控生物传感器可以检测到靶DNA的浓度低至0.2 fmol，这比以前基于氧化石墨烯荧光方法检测低得多17。然后我们考查了的探针和靶标在不同长度(20-mer versus 60-mer)时杂交。 如图2B和2C所示，在相同浓度下，无论是短的还是长的靶标导致的荧光信号都小于T1，T1的长度与P1相同。 此外，我们还观察到 T3 (60-mer)的荧光信号比T2(20-mer)强。 这种差异可以归因于靶标DNA长度以及染料位置和它们与氧化石墨烯的相互作用。 如图2D所示，由于P1的长度长与T2而短于T3，它们杂交后分别形成ssDNA和dsDNA的混合物。因此，TAMRA有一种吸附在GO表面的趋势，因为单链（ss）序列同时存在P1/T2 和P1/T3中。 但由于TAMRA标记在P1的5末端，与T2杂交发生后，它位于ssDNA序列的末端；相反，对于T3来说，它是位于ssDNA和dsDNA序列的接口处。 因此，在P1/T3的情况下，TAMRA更可能是从 GO表面部分脱离。 从前面的检测中，我们注意到，使用荧光检测的方法来检测长的靶标与非常短的DNA探针，这是不现实。 正如我们提到的，用这个方法研究探针的性能有一定的重要性和必要性。Figure 2.(A) Fluorescence intensity of P1 (100 nM) with different concentrations (0, 1, 2, 5, 10, 25, 50, 75, 100, and 150 nM) of T1 in the presence of GO.Inset shows the amplification of the linear range (050 nM) of the calibration curve.(B) Typical fluorescence spectra and (C) fluorescence intensity of P1 (100 nM) with different lengths of target DNA T1, T2, and T3 (100 nM) in the presence of GO.(D) Scheme for P1 in the presence of short target DNA (T2) and long target DNA (T3).图2. (A)在GO存在的条件下，P1(100 nM)与T1在不同浓度(0, 1, 2, 5, 10, 25, 50, 75, 100, and 150 nM)下的荧光强度。 插图显示的是校准曲线的放大线性范围(050 nM)。 （B）典型的荧光光谱和(C)在GO存在的条件下，P1(100 nM)与不同长度的靶标DNAT1，T2和T3(100 nM)的荧光强度。 (D)P1在短靶标DNA(T2)和长靶标DNA(T3)存在时的方案。 对于短的DNA探针，基于氧化石墨烯荧光DNA检测具有很高的序列特异性，容易区分单碱基错配，并提供机会允许SNPs进行分析。 然而，因为单碱基错配的靶标也可能与探针DNA发生部分杂交形成ssDNA和dsDNA的混合物，所以对于更长的序列来说，结果可能不同。由于碱基错配位置和其与氧化石墨烯键的相互作用，位置效应也会对荧光强度产生影响。在这种情况下，单碱基替换位于 5th, 10th, 15th, 20th, 25th, 30th, and 35th 的靶标的位置（从5末端），它们的靶标链分别确定为M1、M2、M3、M4、M5、M6和M7。 为了评估碱基类型的对荧光强度的影响，我们把M4为例，在CG键分别改为 CA (M4A), CC (M4C), and CT (M4T)。 如图3所示，在氧化石墨烯存在的条件下，P1M4与不同的碱基错配的荧光其强度相似，表明碱基差异的影响在这个DNA的检测是非常小的，所以可以在下面的实验中忽略。Figure 3.Fluorescence intensity of P1/M4 with different mismatched bases (A, C, and T) in the presence of GO.图3. 在GO存在下，P1/M4与不同的碱基错配(A、C、T)杂交时的荧光强度。 如图4所示，在氧化石墨烯存在的条件下，靶标在不同的错配位置时分别与P1杂交被检测。 在典型的测量中，对于那些单碱基错配的靶标的荧光信号，浓度与P1是一样的，被记录在图4A中。 我们可以观察到从M1 到M7的荧光信号依次减少，这意味着错配的位置靠近的5末端的靶标比那些靠近3末端的靶标导致更高的荧光强度。 特别是M6和M7的差异尤为的明显，而M1M5的差异较小（ 图4B）。如图4C所示，P1和单碱基错配的靶标杂交后可以形成ssDNA和dsDNA的混合物，而靠近碱基错配的区域可能是单链。 因为 TAMRA 被标记在P1的5末端，当错配的位置是靠近靶标DNA的3末端时（例如，M6，M7），杂交之后染料是位于ss区域的附近，更容易被吸附在GO的表面上；因此，荧光淬灭。相反，当错配的位置是靠近靶标DNA的5末端时，因此，当ssDNA区域吸附在GO表面时，染料还是远离GO，使荧光不能完全熄灭。 我们认为，对于M1M5，存在信号下降的趋势，是因为TAMRA到ss区域的距离增加。 然而，由于大多数标记染料不能被GO猝灭，彼此之间的信号差异就没有那么大。 在不同浓度下观察到的信号区别（图4D），然而，当浓度很低时(25 nM)，这个差异是难以区分的。 根据微管道内的有效样本容量，不同位置的SNPs可以识别到低至5 fmol。Figure 4.(A) Typical fluorescence spectra and (B) fluorescence intensity of P1 (100 nM) with different single-base mismatched DNA M1, M2, M3, M4, M5, M6, and M7 (100 nM) in the presence of GO.(C) Scheme for DNA detection with single mismatched base of different location in the presence of GO.(D) Fluorescence intensity of P1 in the presence of different concentrations of single-base mismatched DNA (M1, M2, M3, M4, M5, M6, and M7).图4. (A)典型的荧光光谱图, (B) P1(100 nM)的荧光强度与分别在氧化石墨烯存在时的单碱基错配DNA M1, M2, M3, M4, M5, M6, and M7 (100 nM)。 (C)在氧化石墨烯不同的位置存在时与单基地不同位置单碱基错配时DNA检测的方案。 (D)P1在不同浓度下的DNA单碱基错配的荧光强度(M1, M2, M3, M4, M5, M6, and M7)。 我们也比较了不同浓度（0，1，2，5，10，25，50，75，100，和150 nM）的DNA检测的校准曲线。 如图5，所示M1、M4和M7作为典型的单碱基错配靶标，这是导致位置影响的一个明显区别。 单碱基错配靶标的所有信号均低于完全完全互补的靶标T1，这可能是由于在氧化石墨烯/探针吸附和探针/靶标杂交之间的竞争，所以氧化石墨烯可能具有不稳定的错配双链。 同时随机非互补的DNA（N1）不能诱导一个独特的荧光增强，即使是在非常高的浓度。Figure 5.(A) Fluorescence intensity of P1 (100 nM) with different concentrations (0, 1, 2, 5, 10, 25, 50, 75, 100, and 150 nM) of T1, M1, M4, M7, and N1 in the presence of GO.(B) Amplification of the linear range (050 nM) of the calibration curve.图5. (A) P1（100 nM）分别与GO存在下的 T1, M1, M4, M7, 和N1 的不同浓度(0,1,2,5,10,25,50,75,100,和150 nM)杂交时的荧光强度，(B)放大的线性范围(050 nM)的校准曲线。总结 总之，这是我们首次发现了一个基于氧化石墨烯的的微流控生物传感器用于DNA单碱基错配的研究。 单碱基错配的类型和位置，以及链的长度对荧光强度的影响进行了研究。 运用40-mer 的探针DNA（P1），以及导致短的 (20-mer) 和长的(60-mer) 靶目标比其长度与P1相同的互补靶目标T1有更为低的荧光信号。错配碱基类型对结果的影响可以忽略不计。 此外，我们在七组错配链的不同的位置分别进行了研究，结果表明， 当染料被标记在探针的5末端时，靶标与碱基错配位置靠近5末端时的比那些靠近3末端的会导致更高的荧光强度。对于靶标与碱基错配非常的靠近3末端是，信号差异尤为明显。可以在很宽的间隔观察到浓度的信号区别。 虽然在这个实验中目标DNA错配的确切位置仍不能使用该法确定，但是我们的研究可以为提高DNA生物传感器的性能提供一定的见解，特别是SNP基因分型。引用文献(1) McCarthy, J. J.; Hilfiker, R. Nat. Biotechnol. 2000, 18, 505508.(2) Stoneking, M. Nature 2001, 409, 821822.(3) Syvanen, A. C. Nat. Rev. Genet. 2001, 2, 930942.(4) Li, Y. A.; Wark, A. W.; Lee, H. J.; Corn, R. M. Anal. Chem. 2006, 78, 31583164.(5) Okumura, S.; Kuroda, R.; Inouye, K. Appl. Biochem. Biotechnol. 2014, 174, 494505.(6) Liu, G.; Lin, Y. J. Am. Chem. Soc. 2007, 129, 1039410401.(7) Yang, A. H. J.; Hsieh, K.; Patterson, A. S.; Ferguson, B. S.; Eisenstein, M.; Plaxco, K. W.; Soh, H. 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