详细柱层析技巧.doc

. 详细柱层析技巧常说的过柱子应该叫柱层析分离，也叫柱色谱。我们常用的是以硅胶或氧化铝作固定相的吸附柱。由于柱分的经验成分太多，所以下面我就几年来过柱的体会写些心得，希望能有所帮助。 L hAIo VWhpYkt, 柱子可以分为：加压，常压，减压。 Lrf&g 压力可以增加淋洗剂的流动速度，减少产品收集的时间，但是会减低柱子的塔板数。所以其他条件相同的时候，常压柱是效率最高的，但是时间也最长，比如天然化合物的分离，一个柱子几个月也是有的。 ,!;qqNk Gww3D 减压柱能够减少硅胶的使用量，感觉能够节省一半甚至更多，但是由于大量的空气通过硅胶会使溶剂挥发（有时在柱子外面有水汽凝结），以及有些比较易分解的东西可能得不到，而且还必须同时使用水泵抽气（很大的噪音，而且时间长）。以前曾经大量的过减压柱，对它有比较深厚的感情，但是自从尝试了加压后，就几乎再也没动过减压的念头了。ET 加压柱是一种比较好的方法，与常压柱类似，只不过外加压力使淋洗剂走的快些。压力的提供可以是压缩空气，双连球或者小气泵（给鱼缸供气的就行）。特别是在容易分解的样品的分离中适用。压力不可过大，不然溶剂走的太快就会减低分离效果。个人觉得加压柱在普通的有机化合物的分离中是比较适用的。 fk/L+7 Rs (f)Uc 关于柱子的尺寸，应该是粗长的最好。 Enaz YB9TCv3bo 柱子长了，相应的塔板数就高。柱子粗了，上样后样品的原点就小（反映在柱子上就是样品层比较薄），这样相对的减小了分离的难度。试想如果柱子十厘米，而样品就有二厘米，那么分离的难度可想而知，恐怕要用很低极性的溶剂慢慢冲了。而如果样品层只有0.5厘米，那么各组分就比较容易得到完全分离了。当然采用粗大的柱子要牺牲比较多的硅胶和溶剂了，不过这些成本相对于产品来说也许就不算什么了（有些不环保的说，不过溶剂回收重蒸后也就减小了部分浪费）。 ts3#pr )2a/&L?*! 现在见到的柱子径高比一般在1：510，书中写硅胶量是样品量的3040倍，具体择要具体分析。如果所需组分和杂质分的比较开（是指在所需组分rf在0.20.4，杂质相差0.1以上），就可以少用硅胶，用小柱子（例如200毫克的样品，用2cm20cm的柱子）；如果相差不到0.1，就要加大柱子，我觉得可以增加柱子的直径，比如用3cm的，也可以减小淋洗剂的极性等等。 S)c$ _ K4W4?;I 关于无水无氧柱，适用于对氧，水敏感，易分解的产品。 E-XO1P NW,Hs$;u 可以湿柱，也可以干柱。不过在样品之前至少要用溶剂把柱子饱和一次，因为溶剂和硅胶饱和时放出的热量有可能是产品分解，毕竟要分离的是敏感的东东，小心不为过。也是因为分离的东西比较敏感，所以接收瓶一定要用可密封的，遵循schlenk操作。至于是加压、常压、减压，随需而定。因为是schlenk操作，所以点板是个问题，如果样品是显色的，恭喜了，不用点板，直接看柱子上的色带就行了。如果样品无色，只好准备几十个schlenk瓶，一瓶一瓶的点，不过几次之后就知道样品在哪，也就可以省些了。 CQXPux:p C5x4pB9 听说有个方法，就是用石英做柱子，然后用HF254做固定相，这样在柱子外面用紫外灯一照就知道产品在哪里了，没有验证过。哪位做过可以提出来大家参详参详。 Aida KRJSa 关于湿法、干法上样。 cbV kuJoIvp 湿法省事，一般用淋洗剂溶解样品，也可以用二氯甲烷、乙酸乙酯等，但溶剂越少越好，不然溶剂就成了淋洗剂了。 VafSf! 1G3!? 很多样品在上柱前是粘乎乎的，一般没关系。可是有的上样后在硅胶上又会析出，这一般都是比较大量的样品才会出现，是因为硅胶对样品的吸附饱和，而样品本身又是比较好的固体才会发生，这就应该先重结晶，得到大部分的产品后再柱分，如果不能重结晶那就不管它了，直接过就是了，样品随着淋洗剂流动会溶解的。 e(8hd 溶剂的选择。O 当然是最便宜，最安全，最环保的了。所以大多选用石油醚，乙酸乙酯。文献中有写用正己烷的，太贵了，除非特别需要不要用不然银子哗哗的，流的比淋洗剂还快，不过因为极性很小，有时还是非它不可。乙醚也可以用，但是就是容易睡觉，注意保持清醒别让溶剂流干了，那样柱子也就不爽了。二氯甲烷也有用的，但是要知道，它和硅胶的吸附是一个放热过程，所以夏天的时候经常会在柱子里产生气泡，天气冷的时候会好一些。甲醇，据说能溶解部分的硅胶，所以产品如果想过元素分析的话要留神，应该经过后继处理，比如说重结晶等。其他的溶剂用的相对较少，要依个人的不同需要选择了 3m|I。 v(K%y&n 由于某些原因，用到的淋洗剂多是大包装的（便宜嘛），我们这里是用10升或25升的塑料桶装的，就要注意这些工业品的纯度是较低的。经常能够从送来的大桶底部看见有色的杂质，其他的杂质就可想而知了，所以在比较严格的柱分时就要对溶剂重蒸。当然过原料时就可以免去这一步了，反正下面还有提纯的方法。 ?:NkX3 另外溶剂在过柱子后最好也回收使用，一方面环保，另一方面也能节省部分经费，缺点是要消耗一定的人工。这里要注意的是，一般在过柱同时进行的是减压旋蒸，石油醚和乙酸乙酯的比例由于挥发度的不同会导致极性的变化，一般会使得极性变大，在梯度淋洗时比较合适，正好极性越来越大了。在过完柱子后，溶剂最后回收要采用常压，因为在减压旋蒸时会有部分低沸点的杂质一起出来，常压时就会减少这种现象，如果杂质和你下面要过的样品有反应那就惨了。 lIt WL#p 关于操作问题。 uy/! %B arXT)ABW 1 装柱。 +z,o:h 5 柱子下面的活塞一定不要涂润滑剂，会被淋洗剂带到产品中的，可以采用四氟节门的。干法和湿法装柱觉得没什么区别，只要能把柱子装实就行。装完的柱子应该要适度的紧密（太密了淋洗剂走的太慢），一定要均匀（不然样品就会从一侧斜着下来）。书中写的都是不能见到气泡，我觉得在大多数情况下有些小气泡没太大的影响，一加压气泡就全下来了。当然如果你装的柱子总是有气泡就说明需要多练习了。但是柱子更忌讳的是开裂，甭管竖的还是横的，都会影响分离效果，甚至作废！ (Rds% 2 加样。 RDsd K 用少量的溶剂溶样品加样，加完后将下面的活塞打开，待溶剂层下降至石英砂面时，再加少量的低极性溶剂，然后再打开活塞，如此两三次，一般石英砂就基本是白色的了。 gG 6%K 6%PL$V 加入淋洗剂，一开始不要加压，等溶样品的溶剂和样品层有一段距离（24cm就够了），再加压，这样避免了溶剂（如二氯甲烷等）夹带样品快速下行。 pO8cvg:)L j eU&/Xut 3 淋洗剂的选择。 (+ZQ.p 感觉上要使所需点在rf0.20.3左右的比较好。不要认为在板上爬高了分的比较开，过柱子就用那种极性，如果rf在0.6，即使相差0.2也不容易在柱子上分开，因为柱子是一个多次爬板的状态，可以通过公式的比较：0.6/0.8一次的分离度，肯定不如（0.2/0.3）的三次方或四次方大。 wi,$2AA BU%k6pd. 4 样品的收集。 L N; _2 用硅胶作固定相过柱子的原理是一个吸附与解吸的平衡。所以如果样品与硅胶的吸附比较强的话，就不容易流出。这样就会发生，后面的点先出，而前面的点后出。这时可以采用氧化铝作固定相。 FiITyrv-Y 53)g OZcH 另外，收集的试管大小要以样品量而定，特别是小量样品，如果用大试管，可能一根就收到了三个样品，wuwu。如果都用小试管那工作量又太大。 M)OUj( gIHO$1 5 最后的处理。 P=#5I) 柱分后的产品，由于使用了大量的溶剂，其中的杂质也会累积到产品中，所以如果想送分析，最好用少量的溶剂洗涤一下，因为大部分的杂质是溶在溶剂里的，一洗基本了，必要时进行重结晶。 ?1T+3f J?7 , g;? 补充 T ncEOR! OKJXsS. 自然沉降法制备常压色谱柱 m#WmCV Mhq 常压柱色谱，又称柱层析，是色谱法中最常见的一种。它的突出优点是，分离效率比经典的化学分离方法高的多，与其他色谱法相比，不需要昂贵的仪器设备，更换流动相和吸附剂方便，消耗材料少，成本低，适合分离取样量从克到微克级范围很宽的各种样品，因此在化学实验室中至今仍被广泛应用。 9z4kwpy5f UD6dlgp 为了保证色谱柱良好的分离效果，色谱柱应装填得尽可能紧密和均匀，在柱中没有气泡、裂缝或沟槽，也不发生柱的径向或轴向固定相的粒度不均匀分布。传统常压色谱柱的填装分为干法装柱和湿法装柱（也称浆法装柱）两种，这两种方法均存在操作不易掌握、易出现气泡和裂缝，装柱时间长等不足之处。本文提出的新的装柱方法介入干装法和湿装法之间，称之为自然沉降法。 K6x+ oP6z0M /L 1、柱层析也有一个Rf值。对上面的柱层析技术，该Rf值=薄层层板(TLC）的Rf值。 WwF1 根据我的经验，该假设成立 URRf2 |1kklk&p 现在要把上述两个点分开。请问x什么时候出来，用什么样的接收瓶能保证把两个点分开。 eBa)_(6 l/GbX /M 解答： 0l*NmqXR# hx=x点出现在柱下方的时候，洗脱剂总共流过的高度 $V4W:+ hy=y点出现在柱下方的时候，洗脱剂总共流过的高度 F1 I:0v 设硅胶部分含溶剂体积为V,V肯定小于h*s +QO3iJ!ZIr 8*Z x4 当洗脱剂从柱上方流到柱下方的时候，x点到达h*Rf1处，y点到达h*Rf2处。 gf4)Izrc 要让x点到达柱下方，其实就是解下列方程 ?af75Q:0 h/hx=(h*Rf1)/h=Rf1 m B%wY 即：hx=h/Rf1 B!euV+9e2 同理，y点到达柱下方，洗脱剂需流经hy高度,hy=h/Rf2 Wk/qRZ(= x,y点相差距离为hy-hx，考虑到他们都有扩散，设其扩散半径相同，都为R =U|&o 对于快速柱，扩散效应都不厉害，设其值为，R=（hy-hx）/4，即假设他们中间夹着一个同样大小的中间点 FVJZu M 则x,y点实际相差距离为hy-hx-2R=（hy-hx）/2 4:Rg1 54m8CE$ 所以，当接受瓶总共接受到hx*s+V=h/Rf1+V体积的时候，hx开始出现，Vh*s。 HjTqlt 如果接受瓶的体积小于(h/rf2-h/rf1)*s/2的时候，可足够保证分开x和y点， DQ +I CK7 5、硅胶高度越长，则浪费的溶剂也越多，不过，接收瓶容量可以更大一些。 0%I 6、硅胶高度越短，接受瓶容量应该小一些。C4Pk 7、硅胶的高度，比TLC的高度高一些即可，没有必要装的很高。 9+7qp 0 i&7o 一般为了得到更好的分离，通常是要把样品的Rf值调到0.2-0.3之间，不过，许多情况下，如果接受瓶小一些，即使Rf值在0.5，0.6，也同样可以把紧挨着的点分开，似乎可以验证该文结论。5 / 5