小鼠染色体的制备、观察、染色.doc

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实验报告

姓名：柳伟雄 班级：2013级生科一班
学号：201300140062 同组者：曾玮璠

山东大学实验报告 2015年6月1日

姓名：柳伟雄 系年级：生科一班2013级 同组者：曾玮璠

科目：细胞生物学实验 题目： 小鼠染色体的制备、染色、观察

一、目的和要求

1.初步掌握小鼠睾丸细胞染色体标本的基本制作过程和Giemsa染色法，了解各操作步骤的原理。
2.了解常用实验动物染色体的数目及特点。
3.认识不同生物染色体的特征，学会做染色体组形图。

二、原理

凡处于活跃增殖状态的细胞，或者经过各种处理后，任何动物组织的细胞就可进入分裂，均可用于染色体分析。在正常动物体内，精巢和骨髓均为是活跃分裂的组织。给动物注射一定剂量的秋水仙素，即可使许多处于分裂的细胞停滞于中期，然后采用常规空气干燥法制备染色体，即可得到大量可分析的染色体标本。本方法简便、可靠，不需要经体外培养和无菌操作，易于推广。骨髓细胞是用于动物细胞遗传学研究很好的材料。但在取材方面，精巢又比骨髓要简易一些，故本实验选用小鼠的精巢为实验材料。
对于小鼠精巢染色体标本的制作，一般包括以下几个要点: 1. 用一定剂量的秋水仙素破坏纺锤丝的形成，使细胞分裂停滞在中期, 使中期染色体停留在赤道面处; 2. 用低渗法使细胞膨胀, 以至于在滴片时细胞被胀破, 使细胞的染色体铺展到载玻片上; 3. 空气干燥法可使细胞的染色体在载片上展平,经Giemsa染色后便可观察到染色体的显微图象。
Giemsa染色是最常用的染色方法之一，适用于多种细胞和染色体染色。主要用Giemsa染液可以将细胞核染成紫红色或蓝紫色，胞浆染成粉红色，在光镜下呈现出清晰的细胞及染色体图像。

三、试剂和器材
1.试剂：秋水仙素、生理盐水（0.9%的NaCl溶液）、0.3%KCl低渗溶液、固定液（甲醇：冰醋酸=3：1）、Giemsa染液

Giemsa染液的配制：
吉姆萨粉(Giemsa stain)
甘油(AR)
甲醇(AR)
将Giemsa粉放入研钵中，先加入少量甘油，研磨至无颗粒为止，然后再分批加入甘油，放56℃温箱中2h后，分批加入甲醇，将配制好的染液密封保存棕色瓶内(最好于0~4℃保存)。使用前，将母液用PBS稀释后使用。

2.器具：解剖盘、镊子、眼科剪、小烧杯（×2）、吸管、玻璃刻度离心管、离心机、铜网、预冷载玻片、记号笔、普通光学显微镜、玻璃等
3.材料：小白鼠

四、实验步骤

制片
1.取雄性小鼠以每克体重4μg注射秋水仙素，经14～16小时后，断头法杀死小鼠，取出睾丸用生理盐水（0.9%的NaCl溶液）洗去血污。
2.将睾丸放入装有1ml 0.3%KCl低渗溶液的小烧杯中剪碎至呈乳白色。
3.用铜网过滤到玻璃刻度离心管中，再加0.3%KCl缓冲溶液至4ml。
4.静置30min，进行低渗处理。
5.以800～1000r/min的转速离心8min。
6.取出离心管，弃去上清液，加入2ml固定液（甲醇：冰醋酸=3：1），并用吸管
至管底吹气，轻轻打散细胞，固定8min。
7.再以800～1000r/min转速离心8min。
8.弃上清，加入1ml固定液，再制成细胞悬液，固定5min。
9.取洁净的低温预冷载片，距载片10～15cm高度滴下2～3滴细胞悬液，从载片一边向另一边轻轻吹气，同时轻轻敲打载片，以使细胞均匀分布和促使染色体展开。
10.用滤纸擦去载片上多余液体，空气干燥或成文火干燥。
染色
11.用Giemsa染色20～30min，细水冲洗玻片背面，去多余染液，气干。
本实验染色采用倒置染色法，具体方法如下：
在玻璃板上用废旧载玻片作支架，使标本载玻片的标本面向下放置到支架上，在玻璃板和标本载玻片之间滴加Giemsa染液，目的一可以节省染料，二可以避免染液快速挥发，三可以防止染液颗粒沉淀，影响观察。在操作时应注意，多个样品同时染色应摆放紧密不要有间隙；滴染液时应尽量慢，不要有气泡，以免部分染色体不被着色。

12.镜检：低倍镜下寻找分散良好、染色适中的分裂相，高倍镜或油镜下观察染色体形态并计数。

五、实验结果

本实验采用的是小鼠的精巢，部分细胞处于减数第一次分裂中期，这样的细胞是二倍体，应有40条染色体；有些处于减数第二次分裂中期，这样的细胞是单倍体，应有20条染色体。还有一些细胞处于分裂期，但不是中期，这类细胞染色体的凝集程度不是很高。
经过仔细查找，最终找到处于减数分裂中期的染色体。如图，处于减数分裂中期的染色体染色质凝缩程度达到最大。小鼠的染色体多为端着丝粒染色体（17、18对染色体为亚端部），呈“V”字形或“U”字形。由于重叠较多，数目难以数清。

六、注意事项

1.断头法处死小鼠后，血液要冲洗干净，以免影响之后的实验的进行。
2.从开始加入0.3%KCl低渗溶液至37℃恒温水浴低渗处理结束，时间控制在50min以内。
3.两次离心的转速控制在800～1000转/分，不要太高，以免破碎细胞。
4.滴片时，使滴管与载玻片间的距离尽量远，这样细胞才能被“摔碎”，使眼睛、滴管、载玻片竖直成一条直线，保证细胞悬液能被滴在载玻片上。
5.滴完片之后，将载玻片的一端轻轻在试验台边缘敲打，使未破碎的细胞破碎。
6.多个样品同时进行染色时，载玻片应摆放紧密，不要有间隙；滴染液时应尽量慢，不要有气泡，以免部分染色体不被着色。

七、结果分析

实验中发现，细胞分散比较均匀，但是染色体展开并不完全，这说明低渗这一步骤可能没有做好，使得染色体不能完全展开。