壳寡糖对鱼类肠道健康影响的研究进展.pdf

NO.202023153综述婚饲料研究FEEDRESEARCH壳寡糖对鱼类肠道健康影响的研究进展陈志龙黄垚施斐*秦真东林鑫（仲恺农业工程学院动物科技学院广东省水环境与水产品安全工程技术研究中心/广州市水产病害与水禽养殖重点实验室，广东广州510 2 2 5）摘要：壳寡糖是由N-乙酰-D-葡萄糖胺以-(1,4)糖苷键结合而成的带正电荷阳离子碱性低聚糖，是聚合度小于2 0%、分子量小于32 0 0 Da、水溶性好、易于吸收的小分子寡糖，可通过物理、化学和酶解法水解制备。与甲壳素和壳聚糖相比，壳寡糖具有更好的生物安全性、生物降解性和生物相容性。壳寡糖作为水产饲料添加剂和免疫刺激剂，具有增强水产动物生长性能、提高免疫功能、抑制肠道病原微生物、降低胆固醇等功能。文章从壳寡糖的制备方法、生物学活性、鱼类肠道健康等方面进行综述，以期为深入研究壳寡糖在水产养殖中的应用提供参考。关键词：壳寡糖；鱼类；肠道健康；制备方法；生物活性；免疫刺激中图分类号：S816.7文献标识码：A文章编号：10 0 2-2 8 13（2 0 2 3）2 0-0 153-0 6Doi:10.13557/ki.issn1002-2813.2023.20.030Research progress on effect of chitooligosaccharides in fish intestinal healthCHEN Zhi-longHUANG YaoSHI FeiQIN Zhen-dongLINLiAbstract:Chitooligosaccharides are positively charged cationic alkaline oligosaccharides composed of N-acetyl-D-glucosamine with-(1,4)-glycosidic linkages,which are small molecule oligosaccharides with a polymerization degreeof less than 20%,molecular weight less than 3 200 Da,good water solubility and easy absorption,and can be prepared byphysical,chemical and enzymatic hydrolysis.Compared to chitin and chitosan,chitooligosaccharides have betterbiosafety,biodegradability and biocompatibility.As a feed additive and immunostimulant for aquatic animals,chitooligosaccharides has the function of enhancing growth performance,improving immune function,inhibitingpathogenic microorganisms in the intestine and lowering cholesterol levels in aquatic animals.The paper reviews thepreparation methods,biological activities,gut health of fish and other aspects of chitooligosaccharides,to provide areference for further research on the application of chitooligosaccharides in aquaculture.Key words:chitooligosaccharide;fish;intestinal health;preparation method;bioactivity;immunostimulation甲壳素又名几丁质，属于多糖，主要源自虾、蟹等甲壳类动物和昆虫外壳。甲壳素具有无生物毒性、可降解吸收、来源广、价格低等优点，因为水溶性差和不溶于大多数有机溶剂的特性妨碍了对其的研究和应用。壳聚糖主要由甲壳素去乙酰化获得，比甲壳素更好吸收，具有生物降解性、抗菌、抗癌、处理废水等作用，因水溶性差和分子量越大黏度越大等特点，导致其应用受到限制。壳寡糖脱乙酰程度达到90%2 ，聚合度小于2 0%3,继承了壳聚糖的优点，具有更好的水溶性，便于生物吸收，黏度更低，具有抗氧化 4、抗癌症 5、抗炎 、抗微第一作者：陈志龙，硕士，研究方向为鱼类肠道菌群通信作者：施斐，博士，助理研究员。基金项目：国家自然科学基金（项目编号：42 10 0 6 10 2 4）：中国科学院热带海洋生物资源与生态重点实验室联合资助开放课题(项目编号：LMB20211004)收稿日期：2 0 2 3-0 3-11生物(7 、神经保护 8 等功效。随着对壳寡糖的研究不断深入，壳寡糖逐渐应用于多个领域，如在医疗领域作为可降解的药物载体辅助药物释放9；在食品领域可制备成保鲜包装替代塑料包装；在饲料领域可作为添加剂；农业方面作为生物刺激剂促进植物生长2 。Qin等 3 发现，壳寡糖可改善杂交罗非鱼（Oreochromisniloticus早Oreochromis aureus含）肠道健康和肠道微生物结构，降低促炎因子表达。Li等 4在橄榄比目鱼饲料中添加壳寡糖，发现其可以增强鱼体的非特异性免疫，提高爱德华氏菌感染后橄榄比目鱼的存活率。壳寡糖在治疗养殖鱼疾病方面具有潜在的研究价值，在饲料中的应用效果良好，在水产领域具有研究潜力。本文结合近年来相关的研究报道，阐述壳寡糖在水产动物方面的研究进展，为今后壳寡糖的相关研究和应用提供参考。1壳寡糖的制备方法壳寡糖是由N-乙酰-D-葡萄糖胺和双葡萄糖胺的共低聚物组成的线性多糖。壳寡糖通过甲壳素的水解和去七16 七ONO.202023饲料研究FEEDRESEARCH154小综述乙酰化制备5。甲壳素制备壳寡糖的过程见图1，该水解反应主要通过化学试剂、酶解反应和物理方法进行催亻OHOHOHOHOH水解去乙酰化NHHHCHNHNH,HONHNH.CH,nn甲壳素壳聚糖壳寡糖图1甲壳素制备壳寡糖的过程1.1化学法壳寡糖的化学制备法包括酸化法和氧化法。酸化法中，盐酸、亚硝酸、硫酸和磷酸等酸性溶液中的氢离子通过和壳聚糖中的游离氨基结合，使壳聚糖长链中的分子间氢键断裂，形成聚合度更低的壳寡糖。氧化法中，利用过氧化氢、臭氧和过硫酸盐等氧化还原剂攻击壳聚糖的糖苷键，使之断裂形成不同分子量的壳寡糖。化学法操作简单、生产成本低，可用于大规模生产壳寡糖。但化学法使用的化学药品可能对环境造成污染，还可能产生副产物，需要对反应后产品进一步分离提纯1.2酶解法酶解法通过仪器能够更好地控制酶的浓度、温度和反应时间，得到所需的反应产物。壳聚糖水解可使用专一性酶，如壳聚糖酶和几丁质酶，但价格昂贵。非特异性酶价格便宜，如果胶酶、纤维素酶、淀粉酶、脂肪酶等。酶解法反应温和、高效、无污染、操作简单，但设备价格昂贵，常用于小规模生产。1.3物理法物理法通过高能冲击（超声波、电磁波和微波）破坏壳聚糖内的糖苷键7 。物理法会使糖苷键随机断裂，诱导副反应，难以准确得到所需分子量的壳寡糖 8 。物理法虽然难以精确控制水解壳寡糖的分子量，但与化学法和酶解法相比，其对环境的损害更小，产品更纯粹，不含各种化学和酶等相关试剂。物理法生产效率低，机械设备成本大。因此，此方法常与其他方法结合应用。2壳寡糖的生物活性2.1促生长作用使用安全的饲料添加剂提高养殖鱼类的产量是水产养殖行业的重要研究方向。壳寡糖作为新兴的饲料添加剂，其对鱼类的促生长作用是研究人员关心的问题之一。刘含亮等 9研究发现，壳寡糖能够改善虹鳟的生长性能，提高其特定生长率和增重率，适宜添加量为2 0 0 mg/kg。Nguyen等 2 0 研究发现，在条纹鲶鱼（Pangasianodonhypophthalmus）饲料中添加10 0 2 0 0 mg/kg壳寡糖时，鱼体生长性能明显提升，死亡率明显降低。Nurmalasari等 2 1 研究表明，饲料中添加壳寡糖能够增加尼罗罗非鱼（O r e o c h r o m i s n i l o t i c u s）的生长率和增重率，壳寡糖可作为益生元增强尼罗罗非鱼的先天免疫。Meng等 2 2 使用不同分子量的壳寡糖投喂尼罗罗非鱼（O.niloticus），结果发现，壳寡糖补充量为0.4、0.8 g/kg时，鱼的生长比率、饲料效率和蛋白质效率比显著增加，且推荐壳寡糖补充量为0.4g/kg。Su 等 2 3 研究不同日粮壳寡糖添加水平对红鳍东方（Takifugurubripes）消化酶活性和生长性能的影响，发现其可改善虎豚泷河豚的生长性能和肠道消化酶活性，调节肠道细菌菌群。综上所述，壳寡糖能够改善肠道绒毛形态和肠壁厚度，增加食物在肠道内的接触面积，提高肠道内消化酶活性，促进肠道对营养物质的吸收和利用，改善饲料风味，从而鱼的生长率和增重率，降低饲料系数2.2免疫刺激作用免疫系统包括先天免疫和后天免疫，先天免疫在鱼类免疫系统中起重要作用。壳寡糖可能通过影响免疫细胞释放和血液中免疫酶活性增强鱼体的免疫功能 2 4。水产动物血液中的免疫酶活性和吞噬活性是其免疫活性的重要指标。Luo等 2 5 研究发现，日粮中添加壳寡糖能够改善虹鳟（O.mykiss）的吞噬活性、呼吸爆发活性，降低血清皮质醇水平。Lin等 2 0 研究发现，壳寡糖提高了锦鲤（C y p r i n u s c a r p i o k o i）的白细胞总数，增强了头肾巨噬细胞的呼吸爆发能力、吞噬活性以及血清溶菌酶和超氧化物歧化酶（SOD）活性，对免疫能力具有增强作用。Zhang等2 7 给珍珠龙胆石斑鱼（Epinephelus fuscoguttatus 早Epinephelus lanceolatu含）腹腔注射壳寡糖溶液，结果发现，鱼体过氧化氢酶（CAT）、溶菌酶（LZM）、SO D 活性和血清总蛋白含量显著提高。黄鑫玮等 2 8 研究发现，壳寡糖可增强幼建鲤（Cyprinus carpiovarJian）的生长性能和非特异性免疫功能，调节脂肪代谢。炎症是机体对外界刺激产生的防御反应，涉及多种免疫细胞和非免疫细胞。炎症性肠病是水产养殖中常见的炎症之一 2-30 。壳寡糖具有抗炎作用，能够抑制肿瘤坏死因子-（T NF-）、白细胞介素-6（IL-6）、诱导型一氧化氮合酶每（iNOS）、环氧合酶-2（COX-2）等促炎因子的释放 31。(Gu等 32 利用含有豆粕的日粮喂养幼大菱鲆（Scophthalmus maximus），发现大菱鲆激活蛋白1（A P-1）、核因子kB（NF-k B）含量以及丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）、应激活化蛋白激酶（JNK1/2）和细胞外调节激酶活性下调，表明壳寡糖增强了肠道免疫，可能通过下调NF-kB、A P-1或MAPK途径减轻炎症细胞因子的过度表达作用，壳寡糖激活AMPK通路、TLR4/NF-kBNO.202023饲料研究FEEDRESEARCH1.55综述养和MAPK信号通路的路径见图2。MAKP由3个介质丝裂原活化蛋白激酶p38MAKP、细胞外信号调节酶（ERK1/2）、JNK 1/2 组成。Li等 33 提出壳寡糖抑制脂多糖（LPS)诱导的NF-kB活化的机制，通过减少NF-kB糖基化抑制LPS诱导的炎症反应（见图2）。壳寡糖可能通过钙敏感受体（CaSR）激活、腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）激活和NF-kB抑制等机制抑制肠道炎症反应 34壳寡糖LPSLPSTLR4CAS受体TLR4AMPKMKK促炎因子pleJNKCa2ERKIPONF-KBP381/21/2MAPKAPER图2壳寡糖激活AMPK通路、TLR4/NF-KB和MAPK信号通路的路径2.3抗菌活性壳寡糖作为壳聚糖水解产物，具有和壳聚糖相似的抗菌特性，通过破坏细菌细胞膜损害其生理活动 35。壳寡糖具有带正电荷的游离氨基，能够与细菌表面带负电荷的蛋白聚糖结合、相互作用，导致扭曲和渗漏，之后渗透休克导致细菌死亡，或与带负电荷的其他抗原结合，导致营养物质流动的堵塞和细菌死亡 30 。壳寡糖的抗菌活性和浓度、分子量、脱乙酰度有关，高分子量壳寡糖拥有更好的抑菌效果137 。Siminek等 38 研究发现，壳寡糖可抑制包括普通拟杆菌在内的7 种非致病性厌氧细菌的生长速率，且其抗菌作用随着壳寡糖分子量增加而增强。Xu等 39研究壳寡糖对9种植物病原体的抗真菌活性，结果表明，壳寡糖会影响菌丝体生长和游动孢子释放，破坏内膜系统并影响孢子破裂。研究表明，卵形（T r a c h i n o t u s o v a t u s）受到哈维弧菌侵染时，与对照组相比，膳食补充壳寡糖组卵形的累积症状发生率有所下降，表明膳食中补充壳寡糖可以增强鱼类的免疫反应，提高其对哈维弧菌感染的抵抗力 38 。综上所述，壳寡糖会影响致病菌株在肠道的定植，影响肠道菌群的多样性和肠道健康，且对肠道中的正常菌群和病原体均表现出抗菌活性。2.4抗肿瘤作用壳寡糖对部分癌症和肿瘤因子具有抑制作用，如乳腺癌 40 、前列腺癌 2 、肝癌(41、肺癌 42 、宫颈癌 43 等。壳寡糖主要通过抑制癌症细胞生长和转移抑制癌症的进展。体外试验表明，壳寡糖会抑制人结肠癌细胞（HT29）中鸟氨酸脱羧酶（ODC）活性，从而抑制癌细胞增殖。壳寡糖还会抑制人结肠癌细胞中12-0-十四烷酰佛波-13-乙酸酯（12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate）、C O X-2蛋白的水平，这些结果表明，壳寡糖能够增加奎宁还原酶（QR）、谷胱甘肽-S-转移酶（GST）活性和谷胱甘肽（G SH）水平，抑制ODC活性和COX-2在体外表达，具有预防结肠癌化学活性 44。Zhao等 45 发现，壳寡糖的抗肿瘤机制与氧化应激以及内在线粒体细胞凋亡和自噬信号的激活相关。壳寡糖可能通过调节机体的免疫能力抑制癌症 40 。Wu等 47 发现，壳寡糖可通过降低COX-2、IL-6、T NF-、IL-1的mRNA水平降低结直肠癌对小鼠的影响，还可通过改变肠道菌群的组成影响小鼠结直肠癌细胞的生长。3壳寡糖对鱼类肠道健康的影响肠道健康是鱼类健康成长的重要需求，在机体免疫和代谢调节中具有重要作用。近年来，关于壳寡糖在鱼类肠道中的应用研究越来越多，壳寡糖可抑制炎症反应，改善电解质代谢，预防肠道屏障损伤，调节肠道菌群在门、科、属水平的丰度，改善部分肠道代谢产物（包括胆汁酸、短链脂肪酸和色氨酸分解代谢产物）的平衡 48 3.1壳寡糖对鱼类肠道组织的影响肠道是鱼体重要的消化和吸收器官，也是鱼体内最大的免疫器官、内分泌器官和重要代谢器官，在鱼体各项生理活动中均具有重要作用。鱼类肠道上皮层和黏膜层组成的屏障结构抵御了大部分病原微生物入侵，肠道组织受损不仅会破坏屏障结构，还可能造成肠道炎症和肿瘤。Shi等(49)研究发现，饲料中添加40 0 mg/kg壳寡糖的罗非鱼（O.niloticus）的肠壁厚度增加，杯状细胞和酸性粒细胞数量更多，表明壳寡糖改善了肠道组织并增强了肠道免疫功能。田娟等 50 研究显示，添加0.30%和0.50%壳寡糖组的幼鱼前肠绒毛长度、宽度和密度显著增加。综上所述，壳寡糖对鱼类肠道组织具有保护作用，有助于恢复受损的肠道组织3.2壳寡糖对鱼类肠道免疫的影响壳寡糖作为免疫刺激剂，具有增强肠道屏障功能、缓解肠道炎症等作用。Wu等 51 研究表明，壳寡糖能够激活静息状态巨噬细胞，巨噬细胞的活化与壳寡糖分子量呈正相关，而较大分子量的壳寡糖能够活化细胞凋亡相关通路，激活蛋白家族，如抑癌基因（P53）通路和半胱氨酸蛋白酶蛋白家族（caspase），诱导巨噬细胞凋亡。张义等 52 报道，壳寡糖可刺激水产动物免疫细胞产生免疫因子，通过调节非特异性免疫、细胞损伤修复等功能，形成网状的反馈调节系统，进一步提高机体的免疫功能。壳寡糖激活AMPK促进上皮细胞紧密连接组装，在人结肠腺癌肺转移细胞（T84）中壳寡糖通过CaSR-PLC-IP3受体通道介导的内质网（ER）钙释放激活AMPK53）（见NO.202023饲料研究FEEDRESEARCH156综述图2）。AMP激活蛋白激酶AMPK是由、和亚基组成的异源三聚体蛋白，是一种能量传感器，可在细胞和全身水平控制能量稳态 54。除了控制能量平衡的作用外，AMPK还具有调节上皮功能，包括紧密连接组装和离子转运 5。AMPK被提议作为结肠直肠癌化学预防的药物靶点 50 。钙敏感受体（CaSR）是与PLC连接的Gq偶联受体，在上皮细胞中表达。磷脂酶C（PLC）是参与脂质和Ca2+依赖信号通路的重要调节酶 57 ，壳寡糖在巨噬细胞中可抑制LPS诱导的炎症反应，包括促炎介质（TNF-、IL-6、i NO S、C O X-2、前列腺素E2和NO）的表达和释放 31。三磷酸肌醇（IP3）是参与G蛋白耦联受体介导的信号转导的第二信使，通过IP3诱导内质网释放Ca2，Ca+进一步诱导产生AMPK，A M PK 可促进上皮细胞中胞外Ca+诱导的紧密连接组装 5。因此，壳寡糖主要通过提高鱼体的肠道屏障功能，增强非特异性免疫。调节肠道菌群可能诱导炎症和氧化应激的TLR4/NF-kB信号通路，对LPS诱导的急性肺损伤具有调节免疫力的保护作用 59。陈嘉俊等 6 0 研究表明，壳寡糖对炎症具有双向调控作用，低剂量壳寡糖会激活炎症因子基因IL-6和IL-1的水平，而高剂量壳寡糖会通过NF-kB途径抑制IL-6、IL-1和TNF-的表达。施斐等 0 研究发现，壳寡糖可显著提高免疫相关基因的表达水平，激活炎症因子TNF-、IL-1、T G F-1、T O R 和 TLR3的表达，通过提高GSH-Px、C A T 和MnSOD的水平改善抗氧化能力，并提高紧密连接蛋白ZO-1、ZO-2、ZO-3和Claudin-3的水平3.3壳寡糖对鱼类肠道菌群的影响肠道是微生物喜欢的生态位，鱼类肠道菌群种类异常丰富，但鱼类肠道菌群类别信息不完全一致。鱼类消化道中占主导地位的为变形菌门、拟杆菌门、放线菌门、厚壁菌门和梭杆菌门。鱼类肠道菌群的平衡对鱼类肠道健康很重要，能够影响肠道代谢、营养吸收和肠道免疫 6 2 。胡晓伟等 6 3 研究发现，壳寡糖添加量为0.2%0.6%时花鲈肠道双歧杆菌的数量显著增加，0.6%1.0%时沙门氏菌数量显著降低，0.8%时大肠杆菌的数量显著降低。田娟等150 研究壳寡糖对吉富罗非鱼幼鱼肠道菌群的影响，发现壳寡糖添加组罗非鱼大肠杆菌数量均显著降低，乳酸杆菌数量显著增加3.4壳寡糖对鱼类肠道的抗菌影响壳寡糖可作为益生元，增加结肠黏膜有益菌群，减少促炎菌，改善肠道菌群失衡和黏膜炎症 6 4。壳寡糖具有降脂作用和抗糖尿病特性，在无不良反应的情况下可作为膳食补充剂6 5。鱼类肠道正常菌群是肠道的正常组成部分，是肠道微生物与宿主以及所处的水生环境形成的相互依赖、相互制约的微生态系，对营养物质的消化吸收、免疫反应以及器官的发育等方面具有其他因素不可替代的作用，并且会影响鱼类的生长、发育、生理和病理变化。健康的肠道微生物群可占据覆盖肠上皮细胞的黏液层中的结合位点，并防止病原体在肠道中定植(6 。肠道微生物群失调的情况下可能发生条件性病原体感染 6 7 7。壳寡糖对嗜水气单胞菌、叉尾爱德华氏菌和柱状黄杆菌等3种暖水鱼类高致病性细菌具有抑菌活性，且其活性呈剂量依赖性 6 8 。壳寡糖相对分子量是影响其抑制能力的主要因素，其可抑制大肠杆菌和蜡样芽孢杆菌生长 30 。曹维强等 6 9 研究发现，壳寡糖对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的最低抑制浓度为0.3%，对副伤寒甲沙门氏菌、宋内志贺菌的最低抑制浓度为0.1%，随着壳寡糖质量浓度增加，抑菌作用逐渐变强。综上所述，壳寡糖通过黏附抑制防止病原体感染，且由于壳寡糖对肠道致病菌具有良好的抑制作用，常被认为是一种潜在的、具有前途的益生元，可以改善肠道菌群，对抗病原菌定植。4结论壳寡糖是由壳聚糖通过物理法、化学法和酶解法水解得到的一类小分子寡糖，生产中常使用两种或以上的方法联合制备壳寡糖，从而提高生产效率降低成本。壳寡糖具有良好的生物安全性、抗菌、抗癌、免疫刺激等特点。壳寡糖能够恢复受损的肠道组织，减少外界刺激下的肠道组织损伤，有效阻止细菌和毒素等有害物质进入鱼体。壳寡糖作为免疫刺激剂在水产养殖中应用，能够通过激活AMPK影响肠道上皮细胞屏障，通过NF-kB和MAPK信号通路抑制促炎因子的表达。壳寡糖能够维持肠道内的优势菌群占比，影响部分对鱼体不利菌群的定植，提高鱼体在一些细菌侵染后的存活率，治疗部分细菌性疾病，减少条件致病菌在鱼类肠道的定植。未来应进一步完善壳寡糖在鱼类肠道的应用和作用机制的研究，壳寡糖将在鱼类的养殖和疾病治疗中发挥积极作用。参考文献1 Satitsri S,Muanprasat C.Chitin and chitosan derivatives as biomaterialresources for biological and biomedical applicationsj.Molecules,2020,25(24):59612 Chapelle C,David G,Callol S,et al.Advances in chitooligosaccharideschemical modifications).Biopolymers,2021,112(9):e23461.3 Gunsriwiang B,Huang G L,Huang S Y,et al.Preparation and biologicalactivities of chitosan oligosaccharidesUl.Trends in Food Science&Technology,2021,107:38-44.4 Ahmad B,Dar T,Khan M,et al.Oligochitosan fortifies 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