现代生化技术考试资料.doc

第一章 生命大分子物质的制备习题1、作为现代生化制备的重要对象的蛋白质、核酸等生物大分子有何特点？（1）成分复杂：生物材料的组成极其复杂，经常包具有数百种乃至几千种化合物。有的生物大分子在分离过程中还在不断的代谢，所以生物大分子的分离纯化方法差别极大，想找到一种适合各种生物大分子分离制备的标准方法是不也许的。（2）含量甚微：许多生物大分子在生物材料中的含量极微，只有万分之一、几十万分之一，甚至几百万分之一。分离纯化的环节繁多，流程又长，有的目的产物要通过十几步、几十步的操作才干达成所需纯度的规定。（3）易变性易被破坏：许多生物大分子一旦离开了生物体内的环境时就极易失活，因此分离过程中如何防止其失活，就是生物大分子提取制备最困难之处。过酸、过碱、高温、剧烈的搅拌、强辐射及自身的自溶等都会使生物大分子变性而失活，所以分离纯化时一定要选用最适宜的环境和条件。（4）具经验性：生物大分子的制备几乎都是在溶液中进行的，温度、pH值、离子强度等各种参数对溶液中各种组成的综合影响，很难准确估计和判断，因而实验结果常有很大的经验成份，实验的反复性较差，个人的实验技术水平和经验对实验结果会有较大的影响。（5）均一性的相对性：生物大分子制备物的均一性（即纯度）的鉴定，通常只采用一种方法是不够的，必须同时采用23种不同的纯度鉴定法才干拟定。2、生物物质制备方案的设计基本原则是什么？生物物质的制备一般涉及初始阶段、中间阶段和精制阶段。在制备方法的选择上，初始阶段宜选择粗放、分辨率低、快速、有助于缩小样品体积和减少后工序的方法，重要考虑样品量和解决速度两个指标；中间阶段选择的方法应在考虑样品解决量的基础上适当提高分辨率。精制阶段宜选择精确、分辨率高、需样品少的方法。在安排各种分离纯化方法的使用程序时应注意：（1）不适宜连续使用同一种分离纯化方法，应当交叉使用，由于每一步分离后，性质相似的物质聚在一块；（2）使用顺序还要考虑到有助于减少工序、提高效率。3、综合评价生物物质制备环节方法的好坏应从哪些方面进行？每一个制备环节方法的好坏，除了从分辨本领和重现性二方面考虑外，还注意方法自身的回收率和纯化倍数，特别是制备某些含量很少的物质时，回收率的高低十分重要。因此综合评价实验方案的优劣应从分辨本领、重现性、回收率和纯化倍数等方面进行。一个好的制备方法应当使纯化倍数和收得率都同时有较大提高。但在实际过程中，随纯化倍数的提高，收得率是逐渐减少的。因此应当根据材料的来源难易（难收得率优先考虑，易纯化倍数优先考虑）和制备物的目的等方面来综合评估方法的优劣。5、提取生物活性物质时，活性保护性措施有哪些？提取一些具有生理活性的物质时，除了考虑被提取物溶解度外，还应考虑被提取物活性的保护。对于一些生物大分子如蛋白质、酶和核酸来说，重要措施有如下几点：（1）采用缓冲系统；（2）加入保护剂；（3）克制水解酶的破坏；（4）其它一些特殊规定的保护措施。6、蛋白质、DNA和RNA的常用提取方法有哪些？（1）蛋白质和酶的提取方法：水溶液提取、有机溶剂提取（2）DNA的提取方法：浓盐法、阴离子去污剂法、苯酚抽提法、水抽提法（3）RNA的提取方法：苯酚法、去污剂法和盐酸胍法。7、提取组织中的胰岛素时，为什么采用68乙醇溶液（用草酸调溶液的pH为2.53.0）为溶剂进行提取。胰岛素可溶于稀酸、稀碱和稀醇溶液，但在组织中与其共存的糜蛋白酶对胰岛素有极高的水解活性，采用68乙醇溶液（用草酸调溶液的pH为2.53.0）进行提取，可以从下面三个方面克制了糜蛋白酶的水解活性： 68的乙醇可以使糜蛋白酶暂时失活； 草酸可以除去激活糜蛋白酶的Ca+；选用pH2.53.0，是糜蛋白酶不宜作用的pH值。第二章 常用生物化学检查技术习题1、蛋白质的化学物理检测方法重要有哪些？ 紫外吸取法、凯氏定氮法、双缩脲法、福林酚试剂法、考马斯亮蓝法2、糖类的化学检测方法重要有哪些？兰爱农（Lane-Eynon）法、斐林试剂快速法（GB法）、碘量法、铜试剂法3、核酸的化学检测方法重要有哪些？ 定磷法、二苯胺法和地衣酚法4、凯氏定氮法的基本原理是什么？其重要操作环节涉及哪些？原理：样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸出，而样品中的有机氮转化为氨与硫酸结合成硫酸铵。然后加碱蒸馏，使氨蒸出，用硼酸吸取后再以标准盐酸或硫酸溶液滴定。根据标准酸消耗量可计算出蛋白质的含量。重要操作环节：消化、蒸馏、滴定5、放射自显影技术的基本原理是什么？其原理是将放射性同位素（如14C和3H）标记的化合物导入生物体内，通过一段时间后，将标本制成切片或涂片，涂上卤化银乳胶，经一定期间的放射性曝光，组织中的放射性即可使乳胶感光。然后通过显影、定影解决显示还原的黑色银颗粒，即可得知标本中标记物的准确位置和数量。6. 生物检测内容重要有哪些？安全性检测涉及哪些内容？生物检测内容重要涉及生物效价测定和安全性实验。安全性检测重要涉及毒性实验、局部刺激性实验、溶血实验、热原实验、过敏实验和变异原实验。7. 核磁共振在生物学研究中重要有哪些方面的应用？(1)分析研究：如拟定生物分子成分及浓度，特别是可不破坏组织细胞而测知其中组分；拟定异构体比例；拟定分子解离状态；拟定金属离子或配基是否处在结合状态；以及测定细胞膜内外的pH差异。 (2)热力学研究：如测定酶与底物、配基、克制剂的结合常数；测定可解离基团的pK值，特别是能测定生物大分子中分处不同微环境的同类残基的同类基团的不同pK值，这是其他方法所不及的；还可测定相变温度，G等其他热力学参数。(3) 动力学研究：监测反映进程，测定各组分随时间的变化；通过变温实验和线形分析，测平衡过程的动力学常数，涉及某些生化反映的反映速率，研究分子间（如酶与克制剂，DNA与药物）互相作用的动力学过程。 (4)分子运动研究：弛豫参数可用来研究生物高分子的动力学，以及生物膜的流动性。(5)分子构象及构象变化研究：目前用二维核磁共振技术加上计算机模拟已能独立拟定小的蛋白质分子及核苷酸片段在溶液中的三维空间结构。改变物理化学因素或加入可与生物分子互相作用的其他物质，将会使核磁图谱发生变化，从而可用来研究这种构象变化。 (6)活体研究：用P，C，H磁共振方法测定活细胞，活组织以致整体的代谢物浓度及变化，测定细胞内pH值，观测药物或不同生理状况对代谢的影响。研究对象有微生物、植物、各种动物以及人体器官等。第三章 标记习题1、何为标记？常用的标记物有哪些？ 标记是指以共价键方式将放射性元素或非放射性物质结合到某些生命物质上的过程。常用的标记物重要涉及放射性物质和非放射性物质，放射性标记元素如3H、14C、32P、35S、125I等；非放射性物质如地高辛、生物素、酶、荧光素等。2、双链DNA探针标记的方法有哪些？ 随机引物引导法 切口平移法3、列举一种核酸标记的新方法，并说明其特点。扫若仑标记：扫若仑（psoralen）是一种天然的三环化合物，其带有胺活性基团衍生物可用来标记多种核酸（如DNA、RNA、PCR产物和寡核苷酸等）。用其制成的探针灵敏度高（可达fg级别）。扫若仑标记为非酶促反映，是用波长320400nm的紫外光照射，引起光循环反映，使带胺基的扫若仑以三环平面形式插入核酸分子，并以共价键结合形成探针，DNA和RNA时，共价键结合的位置分别在dT和U处；探针中扫若仑衍生物的含量与核酸中胸苷（ dT ）或尿苷（U）的含量成正比关系。分子灯塔探针：一种新的非核素化合物标记，用于检测特别序列核酸的核酸探针。标记化合物类似灯塔，由25个核苷酸组成，灯中间环形的15个核苷酸与靶DNA是互补序列，灯竿一端的5个核苷酸与另一端的5个核苷酸是互补，在5 和3端分别耦合一种荧光素（发光剂）和非荧光素（熄灭剂）。分子灯塔探针的熄灭剂可吸取发光剂发射的能量。在室温条件下，分子灯塔的构型可保证发光剂和熄灭剂紧密互补结合，致使荧光基团处在熄灭状态，无荧光产生；一旦当灯塔探针的15个核苷酸与靶DNA或RNA序列杂交时，其发光剂和熄灭剂便互相分离，产生荧光。4、说明蛋白质金标记方法的原理、种类和用途。原理：借助金粒的电子密度特性，用其与抗体偶联后，可成功地置显微镜下观测胶体金颗粒。分类：根据金粒子大小，一般分为5 nm、l0 nm和20 nm三种。用途：5nm粒子容易渗透到细胞膜，使细胞间染色，合用于电子显微镜准拟定位抗原。l0nm粒子较大，可使细胞表面染色，合用于光学显微镜观测。20nm粒子可用于免疫印迹和某些细胞和组织化学免疫染色。第四章 DNA序列测定习题1、DNA测序的方法有哪些？经典的方法重要有Sanger双脱氧链终止法和Maxam-Gilbert DNA化学降解法；较新的方法有：杂交测序法、质谱法、单分子测序法、原子探针显微镜测序法、流式细胞仪测序法、PCR法和DNA 芯片法。2、Sanger双脱氧链终止法测定DNA序列的原理是什么？DNA的合成总是从5端向3端进行的。DNA的合成需要模板以及相应的引物链。DNA的合成过程中，在合成的DNA链的3末端，依据碱基配对的原则，通过生成新的3，5磷酸二酯键，使DNA链合成终止，产生短的DNA链。具体测序工作中，平行进行四组反映，每组反映均使用相同的模板，相同的引物以及四种脱氧核苷酸；并在四组反映中各加入适量的四种之一的双脱氧核苷酸，使其随机地接入DNA链中，由于缺少一个形成磷酸二酯键所必需的3-OH而使DNA链合成终止，产生相应的四组具有特定长度的、不同长短的DNA链。这四组DNA链再通过聚丙烯酸胺凝胶电泳按链的长短分离开，通过放射自显影显示区带，就可以直接读出被测DNA的核苷酸序列。3、Sanger双脱氧链终止法测定DNA序列需要哪些构件元素？质粒载体系统、引物、DNA模板、DNA聚合酶、放射性标记dNTP、dNTP类似物（如ddNTP）5、化学降解法测定DNA序列的原理是什么？化学裂解法的原理是用化学试剂在A、G、C、T处特定地裂解DNA片段，产生一簇各种长度的短链，通过PAGE和放射自显影后，可以直接读出DNA的顺序。常用的化学试剂及其断裂的碱基位置重要有：（1）硫酸二甲酯使鸟嘌呤G甲基化，再加哌啶在加热的条件下使G脱落；（2）硫酸二甲酯使鸟嘌呤G甲基化，加甲酸使AG完全分开，再加哌啶使A脱落；（3）用肼和哌啶使T和C断裂；（4）用2mol/L氯化钠加肼，只断裂C。6、化学降解法测定DNA序列的基本环节是什么？（1）将DNA的末端之一进行标记(通常为放射性同位素32P；（2）在多组互相独立的化学反映中分别进行特定碱基的化学修饰；（3）在修饰碱基位置化学法断开DNA链；（4）采用聚丙烯酰胺凝胶电泳将DNA链按长短分开，根据放射自显影显示区带，读出DNA的核苷酸序列。第五章 生物芯片习题1、什么是生物芯片？生物芯片又称为生物微阵列（Bio- micro array), 是将大量的DNA、寡核苷酸探针、多肽或蛋白质密集排列在固相介质上，实现生物信息的大规模检测。2、何谓基因芯片？基因芯片系指将大量核酸探针分子固定于支持物上后与标记的样品分子进行杂交，通过检测每个探针分子的杂交信号强度进而获取样品分子的数量和序列信息。3、基因芯片的工作原理是什么？基因芯片的工作原理重要涉及三方面：锚定：将大量已知基因片段以微阵列方式固定在支持物上，其密度很高捕获：待测样品用荧光染料标记制成探针，当探针与芯片上的靶基因杂交而被捕获。辨认：经严格洗涤，除去未杂交或部分派对的探针DNA分子，用荧光检测仪定量分析杂交信号强度，由于探针与靶基因完全配对的产生的荧光信号强度比含一个或两个错配碱基的杂合分子高数十倍，因而精确测定信号即可实现检测的特异性。4、基因芯片的制作方法有哪些？重要有原位合成法和合成点样法两种。5、什么是蛋白质芯片？蛋白质芯片, 又称蛋白质阵列或蛋白质微阵列，是指以蛋白质分子作为配基,将其有序地固定在固相载体的表面形成微阵列；用标记了荧光的蛋白质或其它分子与之作用，洗去未结合的成分，经荧光扫描等检测方式测定芯片上各点的荧光强度，来分析蛋白之间或蛋白与其它分子之间的互相作用关系。6、蛋白质芯片的制作方法有哪些？制备蛋白质芯片的方法重要有3种：共价键结合法、凝胶垫结合法和吸附固定法。7、相对于DNA 芯片, 蛋白质芯片技术面临更多困难，为什么？DNA芯片与蛋白芯片最大的区别是靶分子和探针分子的结构差异。相对于DNA 芯片, 蛋白质芯片技术面临更多困难：（1）相对于DNA 的碱基配对杂交机制, 蛋白质之间的互相作用呈现出更强的变化性。并且, 蛋白质的活性以及互相作用的性质也许需要其它蛋白质的作用和翻译后修饰。（2）相对于PCR 技术这种可以大量扩增DNA 的技术, 尚未有可以大量扩增蛋白质的成熟技术。（3）蛋白质的表达和纯化工作十分艰巨, 并且经常不能保持蛋白质的完整功能。（4）许多蛋白质很不稳定, 给阵列制作自身带来很大的困难。8、论述题：根据你的理解，谈谈基因芯片或蛋白质芯片在社会领域的应用。基因芯片的应用：1）分析基因的表达与功能 2）DNA测序：基于杂交测序和邻堆杂交而建立的基因芯片测序术是一种新型高效快速的测序方法。3）检测基因变异与诊断人体疾病：一些疾病的发生与生殖细胞中染色体缺失或基因拷贝数变化有关，这些缺失或变化可用比较基因杂交法检测，即待测样品和对照的基因组分别用不同的荧光试剂标记，混合后与正常细胞分裂中期染色体杂交，根据荧光信号相对强度拟定测试样品中基因拷贝数变化；运用寡核苷酸芯片检测血友病、地中海贫血病、苯丙酮尿症等遗传病和乙型肝炎、丙型肝炎等病毒性传染病，可以在在一块芯片实现同时检测多份样品和多种疾病，此外在婚前体检、产前体检和以后评估等临床应用方面也有广阔的前景。）筛选药物：用基因表达谱评估反义克制、基因敲除、基因过量表达等实验的效应，可以帮助优选或排除也许的药靶基因。此外通过对药物作用后的基因表达谱分析，还可以了解药物对细胞或生物个体的药效和毒副作用，进而筛选出具有不同作用方式的药物。5）癌症研究：用基因芯片研究癌症不仅可以甄别癌症差异，并且还能发现一些与癌症发生、维持和扩散相关的重要基因，这些基因也许成为治疗药物的靶标。蛋白质芯片的应用：1）蛋白质-蛋白质互相作用：蛋白质芯片提供了在蛋白质水平研究基因组中基因的功能，如酶活性，蛋白质;蛋白质间的互相作用，蛋白质;核酸间的互相作用，蛋白质;小分子药物间的互相作用3P;3M。V78 等31构建了含O ) 个酵母蛋白质转化子的蛋白质芯片，根据酵母双杂交的原理，在芯片上筛选3IP 种蛋白质，结果得到了P3 种蛋白质间的互相作用。2）应用蛋白质芯片研究药物作用的机理及细胞对药物所作出的反映。在临床实验中，运用蛋白质芯片跟踪药物所引起的蛋白质的表达就可以拟定被检药物对人体是否有毒副作用，或达成多大剂量才会引起毒副用。此外，蛋白质芯片还能运用于环境监测及食品工业中，用来检测环境或食品中微量的有毒化学物质或病原菌，如大肠杆菌。3）运用蛋白质芯片可进行新药的筛选和毒理学研究。如将蛋白质靶标固定在固相表面形成芯片，就能实现高通量、自动化。此外，运用蛋白质芯片，不仅能找到与毒物互相作用的蛋白质，还能对蛋白质中毒物的作用位点进行研究，进而毒物的作用机理。4）给肿瘤诊断和预后提供了一种高效、高通量的方法，因而适合肿瘤的普查。一般是先从抗体库中挑出对肿瘤诊断或预后有潜在意义的抗体，制成抗体芯片。然后提取正常组织和肿瘤组织的蛋白质有不同的荧光染料进行标记，后与芯片反映，通过计算机分析得出结论。等将抗体点在基片上制成抗体芯片，用来检测正常组织和肿瘤组织中差异表达的蛋白质，发现如明胶酶等在肿瘤的发生中起着重要作用。由于蛋白质芯片是在分子水平进行诊断和预后的，因而它提供了一种更准确的方法。5）蛋白质芯片还可应用于自身性免疫疾病的诊断。如在患类风湿疾病病人的体内发现了大量抗核蛋白及核蛋白复合体的抗体。将这些特性性的蛋白质固定在芯片上形成蛋白质芯片可以从分子水平来检测类风湿疾病。当有些病人的初期症状不明显，或发病症状不同于常规病例时，运用蛋白质芯片进行检测显得尤为重要。第六章 细胞凋亡的检测习题1、什么是细胞凋亡？细胞凋亡是指细胞在一定的生理或病理条件下，遵循自身的程序，自己结束其生命的过程，最后细胞脱落离体或裂解为若干凋亡小体(apoptotic bodies，而被其他细胞吞噬的过程。2、 细胞凋亡的检测方法有哪些？（1）形态学检测：采用苏木素-伊红染色法、细胞涂片染色、甲醛绿-派诺宁染色等方法染色后用光学显微镜观测；采用吖啶橙染色后用荧光显微镜观测；透射电子显微镜观测。（2）DNA电泳法：凋亡细胞的DNA样品，经1%琼脂糖凝胶电泳分离后，发现核酸谱带呈阶梯状，DNA的降解片段均为200bp的倍数。（3）半胱天冬酶(Caspase) -3活性的检测：Caspase-3正常以酶原的形式存在于胞浆中，在凋亡的初期阶段，它被激活，裂解相应的胞浆胞核底物，最终导致细胞凋亡。（4）组蛋白ELISA分析法。（5）流式细胞仪法。3、荧光显微镜下如何区分正常细胞、凋亡细胞和坏死细胞？用吖啶橙染色后在荧光显微镜下观测。正常细胞：在荧光显微镜下，细胞核DNA为黄色或黄绿色均匀荧光，细胞质和核仁的RNA为桔黄或桔红色荧光。 凋亡细胞：细胞核或细胞质内可见致密浓染的黄绿色染色，甚或见黄绿色碎片。 坏死细胞：细胞质内黄绿色或桔黄色荧光均可减弱或消失。4、论述题：细胞凋亡的检测有何意义？可从抗肿瘤药物的研究和开发、疾病的诊断和治疗两方面进行论述。由基因控制细胞有目的，有选择性的自我消亡过程，这种淘汰机制是保证生命进化的基础。生物适应环境的需要，使各种细胞的生存时限达成平衡。细胞的程序化死亡能帮助机体有效的对付来自外界环境的各种威胁。例如，受病毒感染的细胞的凋亡，能减少病毒对机体的损害；受损的免疫细胞的凋亡能提高免疫系统的防御能力；一些癌症细胞和DNA受损细胞的凋亡，能减少癌症的发病几率。比如，在健康的机体中，细胞的生与死总是处在一种良性的动态平衡中，假如这种平衡被破坏，人就会患病。比如，癌症就是该死亡的细胞没有死亡而导致的。而在艾滋病病毒的袭击下，不该死亡的淋巴细胞大量死亡，人的免疫力遭破坏，艾滋病便发作。除了 A IDS，此外一些疾病，如神经变性性疾病、中风、心肌梗塞和自身免疫疾病等都是由于很多正常细胞被不对的地启动了程序性死亡过程而导致细胞过量死亡。第七章 电泳技术习题1、什么是电渗现象？其对电泳过程有何影响液体在电场中，由于支持介质表面也许会存在一些带电基团，吸附一些带相反电荷的离子，在电场的作用下向电极方向移动，形成介质表面溶液的流动，这种现象就是电渗。假如电渗方向与电泳方向相同，则加快电泳速度；假如电渗方向与电泳方向相反，则减少电泳速度。2、现有电泳技术按照原理及支持介质的不同，分为哪几类？按原理不同可分为：移动界面电泳、区带电泳、等电聚焦电泳和等速电泳按支持介质形状不同可它为：薄层电泳、板电泳和柱电泳。3、蛋白质在不连续PAGE中实现分离的基本原理是什么？不连续PAGE电泳体系中由于缓冲液离子成分、pH、凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应、分子筛效应，还具有浓缩效应，故分离效果比连续系统更好。（1）样品浓缩效应：1、凝胶孔径的不连续性：浓缩胶为大孔胶，分离胶为小孔胶。在电场作用下，样品颗粒在大孔胶中泳动的阻力小，移动速度快；当进入小孔胶时，受到的阻力大，移动速度减慢。因而在两层凝胶交界处，样品迁移受阻而压缩成很窄的区带。2、缓冲体系离子成分及pH值的不连续性： HCl在任何pH溶液中均易解离出(Cl-)，在电场中迁移率快，走在最前面称为快离子。在电极缓冲液中，除有Tris 外，尚有甘氨酸(glycine)，其pI=6.0，在pH8.3的电极缓冲液中，易解离出甘氨酸根(NH2 CH2COO-)，而在pH6.7的凝胶缓冲体系中，甘氨酸解离度仅有0.1%-1%，因而在电场中迁移很慢，称为慢离子。当进入pH8.9的分离胶时，甘氨酸解离度增长。3、电位梯度的不连续性：电泳开始后，快离子的快速移动会在其后形成一个离子强度很低的低电导区，使局部电位梯度增高，将蛋白质浓缩成狭窄的区带。 （2）分子筛效应：大小和形状不同的蛋白质通过一定孔径分离胶时，受阻滞的限度不同而表现出不同的迁移率，这就是分子筛效应。（3）电荷效应：在pH8.9的分离胶中，各种带净电荷不同的蛋白质有不同的迁移率。净电荷多，则迁移快； 反之，则慢。因此，各种蛋白质按电荷多少、相对分子质量及形状，以一定顺序排成一个个区带，因而称为区带电泳。4、SDS-PAGE测定蛋白分子量的原理是什么？由于SDS带有大量负电荷，当其与蛋白质结合时，所带的负电荷大大超过了天然蛋白质原有的负电荷，因而消除或掩盖了不同种类蛋白质间原有电荷的差异，使蛋白质均带有相同密度的负电荷，因而重要运用蛋白分子量的差异而将各种蛋白质分开，因此根据未知蛋白和标准系列蛋白的移动距离可测定出未知蛋白的分子量。 5、蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳和DNA琼脂糖凝胶电泳中，凝胶浓度与被分离分子的大小有何关系？聚丙烯酰胺凝胶浓度越大，允许通过的蛋白分子越小；琼脂糖凝胶浓度越大，允许通过的DNA片段短。6、某同学在进行SDS-PAGE时，发现电压很高而电流却很低，试分析其因素，并提出解决措施。这种现象重要是由于电泳槽没有对的装配，电流未形成通路。涉及：a.内外槽装反；b.外槽液过少；c.电泳槽底部的绝缘体未去掉（比如倒胶用的橡胶皮）。解决办法：电泳槽对的装配即可。7、琼脂糖凝胶电泳缓冲液中一般需要加入适量的EDTA，其目的是什么？目的是螯合Mg2+ 等离子，防止电泳时激活 DNA酶，此外还可防止Mg2+离子与核酸生成沉淀。8、琼脂糖凝胶电泳的电泳缓冲液常用的有哪些？各有何特点？TAE是使用最广泛的缓冲系统。其特点是超螺旋在其中电泳时更符合实际相对分子质量（TBE中电泳时测出的相对分子质量会大于实际分子质量），且双链线状DNA在其中的迁移率较其他两种缓冲液快约10%，电泳大于13kb的片段时用TAE缓冲液将取得更好的分离效果，此外，回收DNA片段时也宜用TAE缓冲系统进行电泳。TAE的缺陷是缓冲容量小，长时间电泳（如过夜）不可选用，除非有循环装置使两极的缓冲液得到互换。 TBE的特点是缓冲能力强，长时间电泳时可选用TBE，并且当用于电泳小于1kb的片段时分离效果更好。TBE用于琼脂糖凝胶时易导致高电渗作用，并且因与琼脂糖互相作用生成非共价结合的四羟基硼酸盐复合物而使DNA片段的回收率减少，所以不宜在回收电泳中使用。 TPE的缓冲能力也较强，但由于磷酸盐易在乙醇沉淀过程中析出，所以也不宜在回收DNA片段的电泳中使用。9、温度梯度凝胶电泳测定DNA点突变的原理是什么？一个特定的 DNA 片段有其特有的序列组成，其序列组成决定了其解链区域和解链行为。一个几百个碱基对的 DNA 片段一般有几个解链区域，每个解链区域有一段连续的碱基对组成。当温度逐渐升高达成其最低的解链区域温度时，该区域这一段连续的碱基对发生解链。当温度再升高依次达成各其他解链区域温度时，这些区域也依次发生解链。直到温度达成最高的解链区域温度后，最高的解链区域也发生解链，从而双链 DNA 完全解链。不同的双链 DNA 片段由于其序列组成不同样，所以其解链区域及各解链区域的解链温度也是不同样的。当它们进行 DGGE/TGGE 时，一开始温度（或变性剂浓度）比较小，不能使双链 DNA 片段最低的解链区域解链，此时DNA 片段的迁移行为和在一般的聚丙烯酰胺凝胶中同样。然而一旦 DNA 片段迁移到一特定位置，其温度（或变性剂浓度）刚好能使双链 DNA 片段最低的解链区域解链时，双链 DNA 片段最低的解链区域立即发生解链。部分解链的 DNA 片段在胶中的迁移速率会急剧减少。因此，同样长度但序列不同的 DNA 片段会在胶中不同位置处达成各自最低解链区域的解链温度，因此它们会在胶中的不同位置处发生部分解链导致迁移速率大大下降，从而在胶中被区分开来。假如不同 DNA 片段的序列差异发生在最高的解链区域时，可在 DNA 片段的一端加入一段富含 GC 的 DNA 片段以防止 DNA 片段在胶中完全解链。当加了 GC 夹子后，DNA 片段中基本上每个碱基处的序列差异都能被区分开。10、什么是IEF-PAGE？以PAG为电泳支持物，并在其中加入两性电解质载体(carrier amphol ytes)，在电场作用下，两性电解质载体在凝胶中移动，形成pH梯度，蛋白质在凝胶中迁移 至其pI的pH处，即不再泳动而聚焦成带，这种方法称聚丙烯酰胺等电聚焦电泳(isoelectric focusing-PAGE,简释IEF-PAGE)。11、试通过与高效液相色谱、普通电泳方法的比较，说明毛细管电泳的特点。CE和高效液相色谱法(HPLC)相比, 其相同处在于都是高效分离技术, 仪器操作均可自动化, 且两者均有多种不同分离模式。两者之间的差异在于：CE用迁移时间取代HPLC中的保存时间, CE的分析时间通常不超过30min, 比HPLC速度快；对CE而言, 从理论上推得其理论塔板高度和溶质的扩散系数成正比, 对扩散系数小的生物大分子而言, 其柱效就要比HPLC高得多；CE所需样品为nl级, 最低可达270fl, 流动相用量也只需几毫升, 而HPLC所需样品为l级, 流动相则需几百毫升乃至更多；但CE仅能实现微量制备, 而HPLC可作常量制备。CE和普通电泳相比, 由于其采用高电场, 因此分离速度要快得多；检测器则除了未能和原子吸取及红外光谱连接以外, 其它类型检测器均已和CE实现了连接检测；一般电泳定量精度差,而CE和HPLC相近；CE操作自动化限度比普通电泳要高得多。第八章 生物传感器习题1、什么是生物传感器？生物传感器是由固定化的具有分子辨认功能的生物材料、换能器和信号解决放大装置组成的分析工具或系统。2、生物传感器的基本组成如何？其作用是什么？生物传感器重要由三部分构成：（1）生物辨认元件：是酶、抗原(体)、细胞器、组织切片和微生物细胞等生物分子经固定化后形成的一种膜结构，对被测定的物质有选择性的分子辨认能力。（2）换能器：能将辨认元件上进行的生化反映中消耗或生成的化学物质，或产生的光或热等转换为电信号的装置，在一定条件下，产生的电信号强度和反映中物质的变化量或光、热等的强度呈现一定的比例关系。（3）信号解决放大装置：重要负责信号的分析解决和放大输出。3、微生物传感器分为哪些类型？分为两类：好气性微生物传感器、厌气性微生物传感器4、生物传感器的固定方法有哪些？重要有夹心法、吸附法、包埋法、共价连接法、交联法、微胶囊法等。5、论述题：论述生物传感器在发酵工业、食品、生物工程、医学和环境监测等领域中的应用 （略） 在工业生产不少过程的监控环节都应有了生物电极。例如，用醇化酶制备的氧电极可以检测酿酒工业发酵液中乙醇的浓度，所测得数值与气相色谱法相比，误差仅25%。此外，用酶电极或微生物细胞电极还可以检测葡萄糖、乙酸、谷氨酸和抗生素等物质的含量；医学方面：生物电极可以有效的检测某些疾病患者体内的代谢物质变化。例如，在糖尿病患者的血液中，葡萄糖的浓度比正常人高数倍，用葡萄糖氧化酶或过氧化氢酶制备的氧化电极可以测出血液中的氧或过氧化氢的含量，通过换算即可得知血液或尿液中葡萄糖的含量。同理，选用适当生物活性材料制备的电极，便可快速测出血液或体液中的乳酸、尿素、尿酸、肌酸、肌酐、谷氨酰胺和抗体等物质的含量；环境检测方面：Karube等在Ames法基础上，建立了用微生物电极系统快速测定诱变物的程序，例如，用该法检测已知致癌物如丝裂霉素C、黄曲霉素B1和克菌丹等物质均为阳性结果，此外还可用微生物电极测定BOD。6、论述题：谈谈你对生物传感器此后发展趋势的结识。1)功能多样化:未来的生物传感器将进一步涉及医疗保健、疾病诊断、食品检测、环境监测、发酵工业等各个领域;2)小型化:随着微电子机械系统技术和纳米技术不断进一步到传感技术领域,生物传感器将趋于微型化, 各种便携式生物传感器的出现使人们可在家中进行疾病诊断, 在市场上直接检测食品成为也许;3)智能化与集成化:未来的生物传感器与计算机结合更紧密,实现检测的自动化系统,随着芯片技术越来越多地进入生物传感器领域,以芯片化为结构特性的生物芯片系统将实现检测过程的集成化、一体化;4)低成本、高灵敏度、高稳定性和高寿命: 生物传感器技术的不断进步, 必然规定不断减少产品成本,提高灵敏度、稳定性和延长寿命。这些特性的改善也会加速生物传感器市场化、商品化的进程;5)生物传感器将不断与其他分析技术联用,如,流动注射技术、色谱等,互相取长补短。第九、十章 气液相色谱法习题1、什么是色谱法？是运用混合物不同组分在固定相和流动相中分派系数(或吸附系数、渗透性等)的差异，使不同组分在作相对运动的两相中进行反复分派，实现分离的分析方法。2、色谱法按流动相物理状态和分离原理可分为哪些类型？按流动相物理状态可分为气相色谱、液相色谱和超临界流体色谱。按分离原理可分为吸附色谱、分派色谱、离子色谱和凝胶色谱。3、色谱峰的区域宽度通常可用哪些参数表达？标准偏差s、半峰宽、峰底宽度。4、什么是保存时间？什么是保存体积？色谱分析中，试样从进样到柱后出现峰极大点时所通过的时间，称为保存时间。色谱分析中，试样从进样到柱后出现峰极大点时所流过的流动相体积，称为保存体积。5、根据色谱流出曲线可获得哪些信息？（l）根据色谱峰的个数，可以判断样品中所含组份的最少个数（2）根据色谱峰的保存值(或位置），可以进行定性分析（3）根据色谱峰下的面积或峰高，可以进行定量分析（4）色谱峰的保存值及其区域宽度，是评价色谱柱分离效能的依据（5）色谱峰两峰间的距离，是评价固定相(和流动相)选择是否合适的依据 6、气固色谱和气液色谱的分离原理是什么？气固色谱的固定相是多孔性的固体吸附剂颗粒。固体吸附剂对试样中各组分的吸附能力的不同。因此其分离原理即被分离组分在固体吸附剂中的吸附与脱附的不断反复过程。气液色谱的固定相由担体（用来支持固定液的化学惰性的固体）和固定液（高沸点有机化合物）所组成。固定液对试样中各组分的溶解能力的不同。因此气液色谱分离的原理就是被分离组分在气液两相间的反复多次分派过程。7、色谱理论重要涉及哪些？ 塔板理论和速率理论。8、什么是分离度？相邻两组分达完全分离时一般规定分离度为多少？分离度R是指两相邻组分保存时间之差与两峰底宽度和之半的比值。相邻两组分达完全分离时一般规定分离度为1.5。9、气相色谱定量分析的方法有哪些？各有何特点？ 归一化法：该方法简便，不用称量；操作条件如进样量、载气流速等变化时对结果的影响较小，但规定试样中所有组分均须出峰，并且当各组分的校正因子相差较大时，测定误差较大。内标法：该法进样量不必准确，测定结果准确度高；但增长了一个内标物质，给分离导致一定困难，并且实际测定中寻找合适的内标物比较困难。外标法：不使用校正因子，适合测定大批量样品；但需准确控制进样量、载气流速等操作条件，对进样操作规定严格，不易把握。10、液相色谱中选择流动相时应注意什么问题？（1）尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增长。（2）避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶剂破坏氧化铝固定相等。（3）试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉淀并在柱中沉积。（4）流动相同时还应满足检测器的规定。当使用紫外检测器时，流动相不应有紫外吸取。