枯草芽孢杆菌KC1723的鉴定及生物学特征研究.pdf

山 东 农 业 科 学():./.收稿日期:基金项目:山东省重大科技创新工程项目()山东省农业科学院农业科技创新工程项目()作者简介:薛德星()男助理研究员主要从事植物免疫诱抗研究:.通信作者:高兴祥()男研究员主要从事杂草科学研究:.李健()男副研究员主要从事生物农药与杂草科学研究:.枯草芽孢杆菌 的鉴定及生物学特征研究薛德星李美孙作文李纪顺扈进冬高兴祥李健(.山东省农业科学院植物保护研究所山东 济南.山东省农业技术推广中心植物保护部山东 济南.齐鲁工业大学(山东省科学院)生态研究所山东 济南)摘要:本试验从土壤中分离筛选出芽孢杆菌菌株 并对菌株形态、生理生化特征及 序列进行分析 结果显示:菌株 呈杆状链状排列产生椭圆形芽孢生理生化特征与枯草芽孢杆菌一致 序列与枯草芽孢杆菌的同源性为.因此确定菌株 为枯草芽孢杆菌 菌株 最优生长培养基为 培养基最适生长 值为.对暹罗炭疽菌、平头炭疽菌和链格孢菌有良好的抑制作用 本试验为生防菌的开发应用提供了重要的菌种资源关键词:枯草芽孢杆菌鉴定生物学特征生物防治中图分类号:.文献标识号:文章编号:()(.().链格孢属()和炭疽菌属()病原真菌种类繁多地理分布广泛可侵害各种农作物对全球农业生产造成严重威胁链格孢属病原菌感染南瓜、甜瓜、西葫芦、黄瓜等瓜类植物引起叶斑病 芸薹链格孢()是全球性植物病原菌具有很强的环境适应性能够快速引起十字花科蔬菜黑斑病给农业生产造成巨大的经济损失 近年来草莓炭疽病危害日趋严重其致死率一般在 严重可达 以上对我国草莓产业造成巨大危害 化学药剂可以很好地防治病菌感染但长期大量使用化学药剂会导致病原菌产生抗药性造成环境污染且农药残留影响人类身体健康 生物防治是利用微生物之间的拮抗、竞争等方式阻碍病原微生物繁殖改善土壤理化性质促进植物生长提高植物抗病性具有安全、有效和持久的特点可以更好地防治植物病虫害应用于植物病害的生防细菌、真菌、放线菌等多种菌剂相继被开发并取得了良好的生防效果 枯草芽孢杆菌()是一种常见的产芽孢杆状细菌广泛存在于土壤和植物表面对人畜无毒无害不污染环境具有很强的抗逆能力能产生多种抗菌素和抗菌酶对植物病原菌具有广谱抗性已成为重要的生防菌之一 目前枯草芽孢杆菌已经应用在小麦、玉米、大豆、花生、番茄、辣椒、苹果等多种作物上并取得理想的生防效果 本研究从土壤中分离筛选到一株芽孢杆菌 经形态学、生理生化特征分析和 基因鉴定确定为枯草芽孢杆菌并通过抑菌试验研究其对炭疽菌、链格孢菌的抑菌效果以期为其生防制剂的开发应用奠定理论基础 材料与方法.材料来源菌株:分离自济南地区土壤样本供试病原菌:暹罗炭疽菌()、平头炭疽菌(.)、链格孢菌()均为山东省农作物病虫害生物防治工程技术研究中心分离保存.主要仪器和试剂紫外透射反射分析仪上海骥辉科学分析仪器有限公司 仪北京宏达恒业科技有限公司电热恒温水槽浙江恒岳仪器有限公司紫外可见分光光度计上海元析仪器有限公司高速离心机山东德瑞克仪器股份有限公司 细菌基因组 快速抽提试剂盒上海生工生物工程技术服务有限公司其他常用试剂为国产分析纯试剂.培养基细菌基础培养基(培养基)每升去离子水中加入酵母提取物 、胰化蛋白胨 、氯化钠 用 调 至.下高压灭菌.试验方法.菌株的分离筛选称取 土壤样品加入装有 无菌水的三角瓶中充分振荡混匀 水浴 制成土壤悬液 吸取 上层液加入装有 无菌水的试管中 倍梯度稀释至、和 分别吸取.均匀涂布在 培养基平板上倒置于 恒温培养箱培养 .菌株鉴定 形态特征观察:挑取生长优势菌落接种到 培养基平板上 倒置培养 观察菌落生长情况同时进行革兰氏染色利用光学显微镜观察菌株的形态特征生理生化特性分析:挑取单菌落培养 后进行鉴定试验包括葡萄糖发酵试验、蔗糖发酵试验、乳糖发酵试验、淀粉水解试验、明胶水解试验、试验、柠檬酸盐试验、过氧化物酶试验、硝酸盐还原试验、耐盐性试验分子生物学鉴定:采用细菌 提取试剂盒提取菌株基因组 基于 基因设计上、下游引物分别为 ()和 ()反应体系():模板 上、下游引物(/)各 反应条件:个循环 产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序.芽孢杆菌生理生物学特征研究 值对菌株生长的影响:将 培养基的 值分别调为、和 灭菌 后按照体积比接种活化的菌液 恒温培养每小时测菌株生长变化情况热处理对菌株活性的影响:挑取芽孢杆菌单菌落接入 液体培养基中/、恒温振荡培养 芽孢杆菌样品分别在、水浴中处理 采用 倍梯度稀释法依次稀释进行平板菌落计数菌株的抑菌作用:采用平板对峙培养法以暹罗炭疽菌、平头炭疽菌和链格孢菌为靶标菌测定菌株的抑菌能力 每组设 个重复记录病原菌 第 期 薛德星等:枯草芽孢杆菌 的鉴定及生物学特征研究菌落直径计算抑菌率 抑菌率()(对照平均直径处理平均直径)/对照平均直径.数据处理与统计分析试验所得数据均使用 .软件进行方差分析多重比较采用 法(.)将 基因测序结果与 数据库中的已知序列进行比对利用 .软件构建系统发育树 结果与分析.芽孢杆菌 形态特征经分离筛选从济南地区土壤中得到一株芽孢杆菌定名为 在 培养基上 恒温培养 菌落边缘呈不规则齿形表面突起有皱纹菌落颜色为白色(图)在显微镜下菌株 呈杆状产生椭圆形芽孢芽孢位于细胞中部附近 革兰氏染色为阳性(图)图 菌株 菌落形态()及染色情况().芽孢杆菌 的生理生化特征对菌株 进行葡萄糖发酵试验、蔗糖发酵试验、乳糖发酵试验、淀粉水解试验、明胶水解试验、试验、硝酸盐还原试验、过氧化物酶试验、柠檬酸盐试验、耐盐试验共 项常规生化试验结果表明菌株 生理生化反应与枯草芽孢杆菌相同(表)表 菌株 的生理生化特征项目 菌株枯草芽孢杆菌柠檬酸盐试验 测定硝酸盐还原过氧化物酶乳糖发酵试验葡萄糖发酵试验蔗糖发酵试验淀粉水解试验明胶水解液化 注:“”代表阳性“”代表阴性.芽孢杆菌 基因序列分析扩增的菌株 片段长度为 系统进化树显示菌株 与枯草芽孢杆菌聚为一支同源性为.(图)通过上述形态特征、生理生化特征及 基因序列分析将菌株 鉴定为枯草芽孢杆菌 保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(编号 .):枯草芽孢杆菌:稻米不动杆菌:荧光假单胞菌图 菌株 的系统发育树.不同 值 和培养基对菌株 生长的影响菌株 生长的适宜 值在.之间最适 为.随培养基 值升高或降低菌落生长速度明显减慢(图)山 东 农 业 科 学 第 卷图 不同 值对菌株 生长的影响.温度对菌株 的影响由图 可知 处理 后细胞数量为./随着温度提高细胞数量逐渐降低 时仍有 /细胞存活表明菌株可以很好地耐高温图 不同温度对菌株 的影响.菌株 的抑菌作用平板对峙试验表明 对供试 种病原菌都有较好的抑菌作用抑菌率分别为.、.、.其中对暹罗炭疽菌抑菌效果最好(表)表 菌株 对 种病原菌的拮抗效果病原菌抑菌率/暹罗炭疽菌().平头炭疽菌().链格孢菌().注:数据后不同小写字母表示在.水平差异显著 讨论与结论通过细菌形态特征、革兰氏染色镜检结果以及生理生化鉴定菌株 与枯草芽孢杆菌的形态及生化特征极为相似测序及系统进化树结果进一步确定菌株 为枯草芽孢杆菌 生长适宜 值为.最适 值为.在 培养液中可以生长 处理 仍 有 菌 株 存 活 表 明 菌 株 具有很强的环境适应能力能够在恶劣的生态环境下存活并繁殖有利于生防菌开发利用微生物防治植物病害具有重要的研究价值和应用前景 筛选和鉴定有生防潜力的微生物极为关键 前人研究表明利用枯草芽孢杆菌防治植物病害具有巨大研究价值和应用潜力经枯草芽孢杆菌处理后尖孢镰刀菌古巴专化型、灰葡萄孢、茄病镰刀菌、大丽轮枝菌、麦根腐平脐蠕孢、尖孢镰刀菌的菌丝生长受到显著抑制培养基上均形成明显的抑菌圈 本试验通过平板对峙培养法发现菌株 对暹罗炭疽菌、平头炭疽菌和链格孢菌有较好的抑菌效果特别对暹罗炭疽菌抑菌率达到.表明菌株 对由暹罗炭疽菌、平头炭疽菌和链格孢菌引起的花生炭疽病、大白菜炭疽病和辣椒灰叶斑病具有很好的生防潜力本试验分离、筛选并鉴定了一株枯草芽孢杆菌 并对其培养条件和抑菌效果进行了研究 为了更好地应用生防菌 下一步将提取其抗菌活性产物解析抑菌机理以及开展田间防效研究和评估参 考 文 献:刘行风 刘东 陶磊 等.黑龙江省黄瓜链格孢叶斑病病原鉴定及生物学特性研究.中国蔬菜():.赵艳琴 石凯 张丽娟 等.高粱链格孢叶斑病菌生物学特性研究.植物保护 ():.冯中红 孙广宇.链格孢属及相关属分类研究新进展.菌物研究 ():.王燕荣 王永 李杰 等.番茄早疫病病组织浸提液对番茄早疫病诱导抗性的研究.内蒙古农业大学学报(自然科学版)():.姜莉莉孙瑞红宫庆涛等.草莓炭疽病病原菌的分离及高效防治药剂筛选.山东农业科学():.(.).():.杨晓燕 王钰鑫 叶伟伟 等.枯草芽孢杆菌对几种植物病原真菌的抑菌活性.工业微生物 ():.第 期 薛德星等:枯草芽孢杆菌 的鉴定及生物学特征研究.:.甘金佳 毛玲莉 孙成荣等.枯草芽孢杆菌在番茄病害防治上的应用与研究进展.长江蔬菜():.姜莉莉 陈彦闯 辛明秀.枯草芽孢杆菌在防治植物病害上的应用及研究进展.安徽农学通报 ():.胡亚杰 韦建玉 卢健 等.枯草芽孢杆菌在农作物生产上的应用研究进展.作物研究 ():.杨瑞先 蔡学清 范晓静 等.内生芽孢杆菌防治植物病害的应用及作用机制研究进展.武夷科学 ():.王万能 全学军 谢应宇.植物病害生物防治与微生态学.中国植保导刊 ():.陈明丽 于涵 高虹 等.浅谈枯草芽孢杆菌的研究进展.现代化农业():.豆雅楠 牛世全 豆建涛 等.芽孢杆菌拮抗苹果树腐烂病菌的筛选、鉴定及抑菌活性初探.微生物学通报():.():.魏彩燕 毛雪琴 柴荣耀 等.草莓炭疽病生防菌株 的鉴定及生物学特性.菌物学报 ():.:.山 东 农 业 科 学 第 卷