绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达.doc

. 绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达背景知识绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。当受到紫外或蓝光激发时，GFP 发射绿色荧光。它产生荧光无需底物或辅因子发色团是其蛋白质一级序列固有的。GFP 由3 个外显子组成，长2.6kb；GFP 是由238 个氨基酸所组成的单体蛋白,相对分子质量为27. 0kMr，其蛋白性质十分稳定，能耐受60处理。1996 年GFP 的晶体结构被解出，蛋白质中央是一个圆柱形水桶样结构，长420 nm，宽240 nm，由11 个围绕中心螺旋的反平行折叠组成，荧光基团的形成就是从这个螺旋开始的，桶的顶部由3 个短的垂直片段覆盖，底部由一个短的垂直片段覆盖，对荧光活性很重要的生色团则位于大空腔内。发色团是由其蛋白质内部第65-67位的Ser-Tyr-Gly自身环化和氧化形成.1996 年GFP 的晶体结构被解出，蛋白质中央是一个圆柱形水桶样结构，长420 nm，宽240 nm，由11 个围绕中心螺旋的反平行折叠组成，荧光基团的形成就是从这个螺旋开始的,桶的顶部由3 个短的垂直片段覆盖，底部由一个短的垂直片段覆盖，对荧光活性很重要的生色团则位于大空腔内。实验一 质粒DNA的分离与纯化一、实验目的掌握一种最常用的质粒DNA提取方法：碱裂解法。该法用于从小量培养物中抽提质粒DNA，比较方便、省时，提取的质粒DNA质量较高，可用于DNA的酶切、PCR甚至测序。二、基本原理质粒是一类在细菌细胞内发现的独立于染色体外，能够自主复制的稳定的遗传单位。迄今为止，从细菌中分离得到的质粒都是环型双链DNA分子，分子量范围从1kb到200kb。质粒DNA可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下又会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。在大多数情况下质粒DNA复制中的酶体系和细菌染色体复制时所用的酶是相同的。有些质粒复制受宿主细胞复制作用的严格限制，因此每个细胞中只含一个或几个拷贝，称为严谨型质粒，有的质粒的复制受宿主细胞的控制不严，称为松弛型质粒，它们在每个细胞中的数目可达10-200个拷贝。当宿主细胞的蛋白质合成受到抑制时（例如经氯霉素处理），细菌染色体虽不再增加，但松弛型质粒DNA可继续被复制，以至每个细胞内的拷贝数可以增至一千到几千。质粒具有一定的生物功能，它们往往带有一些抗药标记，当质粒DNA用人为的方法转化进细菌时，转化后的细菌会表现出质粒基因所具有的新的生物表现型，例如，把一个含有抗药基因的质粒转入细菌后，原来无抗药性的细菌则表现出抗药的新表型。借助转化菌获得的新表型特征，可证实质粒已转入宿主细菌中，这样就可以作为转化菌的选择性标记。质粒作为基因克隆载体分子的重要的条件是获得批量的纯化的质粒DNA分子。目前已有许多方法可用于质粒DNA的提取，它们都包括三个基本的步骤：细菌的生长和质粒的扩增；菌体的收集裂解，质粒DNA的分离；质粒DNA的纯化。1、 细菌的生长和质粒的扩增从琼脂培养基平板上挑取一个单菌落，接种到含适当抗生素的液体培养基中培养。对于松弛型质粒（如pUC系列）来说，只要将培养物放到标准的LB或2YT培养基中生长到对数晚期，就可以大量提取质粒，而不必选择性地扩增质粒DNA。但对于严谨型质粒（如pBR322）来说，则需在得到部分生长的细菌培养物中加入氯霉素继续培养若干小时，以便对质粒进行选择性扩增。2、菌体的收集、裂解和质粒DNA的分离质粒分离的基本原理是利用宿主菌（一般是大肠杆菌菌株）DNA与质粒DNA之间的两种主要性质差异：（1）大肠杆菌的染色体较一般的载体质粒DNA大得多。（2）从细胞中提取得到的大肠杆菌DNA主体是变性的线性分子，而大多数质粒DNA是共价闭合的环状分子。这里主要介绍碱裂解法的基本原理：在细菌悬浮液中加入SDS（十二烷基硫酸钠）和NaOH使菌体裂解（有时需要先使用溶菌酶水解细胞壁）。此处理可破坏碱基配对，故可使细菌的线状染色体DNA变性，但闭环质粒DNA链由于处于拓扑缠绕状态而不能彼此分开。当条件恢复正常时（如加入酸性的NaAc或Kac中和碱性NaOH），质粒DNA链迅速得到准确配对，重新恢复成天然的超螺旋分子。通过离心，可以使染色体DNA与变性蛋白质、RNA分子一起沉淀下来，而质粒超螺旋分子仍滞留于上清中。3、质粒DNA的提纯对于小量制备的质粒DNA，经过苯酚抽提、RNA酶消化和酒精沉淀等简单步骤除去残余蛋白质及RNA，达到纯化的目的。质粒DNA分子具有三种构型：共价闭合环形DNA（cccDNA，SC构型）、开环DNA（OC构型）和线性分子（L构型）。在细菌体内，质粒DNA是以负超螺旋构型存在的。在琼脂糖凝胶电泳中不同构型的同一种质粒DNA，尽管分子量相同，但具有不同的电泳迁移率。其中走在最前沿的是SC DNA，其后依次是L DNA和OC DNA。三、实验材料、仪器及试剂1. 在含有pEGFPN3质粒的DH5平板上菌落上挑取菌种，置于含有5mL LB培养基的试管中。摇晃过夜。 在含有pET-28a质粒的平板上挑取单菌落于另外一个试管中，同样摇荡培养过夜。2、使用仪器 恒温培养箱，超净台，恒温摇床，制冰机，台式离心机，小型混合器，冰箱四、实验步骤1. 取1.5ml DH5培养液倒入1.5mL eppendorf 管中, 13000rpm离心1min。2. 重复1。3. 弃上清,将管倒置于卫生纸上数分钟,使液体流尽。 4. 菌体沉淀重悬浮于100L溶液中(需剧烈振荡),室温下放置10min。 5. 加入新配制的溶液200l, 盖紧管口，快速温和颠倒eppendorf 管5次,以混匀内容物(千万不要振荡),冰浴5min。 6. 加入150L预冷的溶液,盖紧管口，并倒置离心管，温和振荡3次,使沉淀混匀,冰浴中15分钟,13000rpm离心5min。 7. 上清液移入干净eppendorf 管中,加入等体积的氯仿/异戊醇(24：1),振荡混匀, 13000rpm离心2min。 8. 将水相移入干净eppendorf 管中,加入等体积的氯仿/异戊醇(24：1)振荡混匀, 13000rpm离心2min。 9. 将水相移入干净eppendorf 管中,加入2 倍体积的无水乙醇,振荡混匀后，置于室温下2min，然后13000rpm离心5min。 10. 弃上清,将管口敞开倒置于卫生纸上使所有液体流出,加入1mL 70乙醇洗沉淀一次, 振荡混匀后，13000rpm离心5min。 11. 吸除上清液,将管倒置于卫生纸上使液体流尽,室温干燥。 12. 将沉淀溶于30L TE缓冲液(pH8.0，含20g/mL RNaseA)中，保存在-20冰箱中。 13. 按照同样的流程和方法将pET-28a的质粒也提出来，保存在-20冰箱中。五、实验结果实验二 质粒DNA浓度的测定一、实验目的学习利用核酸蛋白测定仪测算核酸的浓度和纯度。二、基本原理核酸分子在260nm下有最大吸光值，因此可以通过260nm下核酸的吸光值计算核酸浓度（mg/ml），并通过测定与280nm和230nm的比值，估算DNA的纯度。三、实验材料与仪器1、实验材料pEGFPN3和pET-28a DNA2.使用仪器Eppendorf核酸蛋白测定仪，移液枪四、实验步骤1. 按下Eppendorf核酸蛋白测定仪dsDNA，比色皿中加入100l ddH2O，blank空白对照。2. 取一0.5ml离心管，吸取质粒DNA 5l，然后再加入95l ddH2O，混匀。3. 将100l的溶液转移到比色皿中，注意不要出现气泡。4. 按下sample，记录260nm下DNA的浓度（mg/ml）。并同时记录OD260nm/280nm，OD260nm/230nm的比值，估测DNA的纯度。5. 计算质粒DNA母液的浓度=OD260nm下的浓度20（mg/ml），DNA的纯度：OD260nm/280nm=1.80.1(如果低于1.7，说明样品中蛋白质去除的不完全，或样品中有苯酚的污染；如果高于1.9，说明样品中RNA去除的不完全。) OD260nm/230nm 2.0实验三 琼脂糖凝胶电泳一、实验目的学习掌握一种最常用的分离、鉴定、纯化DNA片段的比较方便、省时的技术：琼脂糖凝胶电泳的基本原理和操作方法。二、基本原理影响DNA在琼脂糖凝胶中迁移速率的因素主要有：（1）DNA分子的大小 双链DNA分子在凝胶基质中迁移的速率与其碱基对数的常用对数成反比。分子越大，迁移的越慢，因为摩擦阻力越大，也因为大分子通过凝胶孔径的效率低于较小的分子。（2）琼脂糖浓度 给定大小的线状DNA片段在不同浓度的琼脂糖凝胶中迁移速率不同。在DNA电泳迁移速率的对数和凝胶浓度之间存在线性相关。（3）DNA的构象 超螺旋环状（型）、切口环状（型）和线状（型）DNA在琼脂糖凝胶中以不同速率迁移。其相对迁移速率主要取决于琼脂糖凝胶的浓度和类型，其次是电流强度、缓冲液离子强度和型超螺旋绞紧的程度或密度。一些条件下，型DNA比型迁移得快；在另一些条件下，顺序可能相反。（4）所用的电压 低电压时，DNA片段迁移率与所用的电压成正比。电场强度升高时，高分子量片段的迁移率遂不成比例的增加。所以，当电压增大时琼脂糖凝胶分离的有效范围反而减小。要获得大于2kb DNA片段的良好分辨率，所用电压不应高于5-8V/cm。（5）电泳缓冲液 DNA的泳动受电泳缓冲液的组成和离子强度的影响。缺乏离子则电导率降低，DNA或者不动或者迁移很慢。高离子强度时（如10buffer），电导率升高，使得应用适中的电压也会产生大量的热能，最严重时凝胶会熔化，DNA变性。三、实验材料、仪器及试剂1、实验材料质粒DNA2、使用仪器核酸电泳仪，小型混合器，冰箱，蓝盾可见光透射仪四、实验步骤1、 1%琼脂糖凝胶的配制（1）加20ml 1TBE缓冲液于三角瓶中，（2）精确称取0.2g琼脂糖加到三角瓶中，于微波炉中加热至完全熔化，（3）冷却至60左右，（4）轻缓倒入封好两端和加上梳子的电泳胶板中，静置冷却30分钟以上，（5）将胶板除去封胶带，放入电泳缓冲液（TBE）中，使电泳缓冲液刚好没过凝胶约1mm，轻轻拔除梳子，（6）取5l质粒DNA及2l GeneFinder混匀上样（7）50-100v约电泳0.5-1小时（8）蓝盾可见光透射仪观察结果。五、实验结果实验四 酶切及连接1. 实验目的学习使用限制型内切酶进行DNA酶切的原理和方法。2. 实验原理迄今已发现了3000多种限制性内切酶。传统上将限制性内切酶按照亚基组成、酶切位置、识别位点、辅助因子等因素划分为三大类。II型酶在其识别位点之中或临近的确定位点特异地切开DNA链。它们产生确定的限制片段，因此是三类限制性内切酶中唯一用于DNA分析和克隆的一类。5-GAATTC-33-CTTAAG-5II型限制性内切酶中最普遍的是象EcoR I、Hind III、BamHI和Not I这样在识别序列中进行切割的酶。这一类酶是构成商业化酶的主要部分。大部分这类酶都以同二聚体的形式结合到DNA上，因而识别的是对称序列；但有极少的酶作为单聚体结合到DNA上，识别非对称序列。一些酶识别连续的序列（如EcoR I识别GAATTC；Hind III识别AAGCTT;BamHI识别GGATCC; Not I识别GCGGCCGC）；而另一些识别不连续的序列（如Bgl I识别GCCNNNNNGGC）。限制性内切酶酶切DNA后形成两种类型的末端：(i)两条链断裂的位置是交错地，产生粘性末端，如EcoR I酶切后产生末端；(ii)两条链的断裂位置处在一个对称结构5-GGCC-33-CCGG-5。的中心，产生平末端，如HaeIII酶切后产生DNA连接酶能够催化在两条DNA链之间形成磷酸二酯键，这种酶需要在一条DNA链的3-末端具有一个游离的羟基（-OH），和在另一条DNA链的5-末端具有一个磷酸基团（-P）。ligase53533. 实验材料、仪器及试剂3.1 实验材料 pEGFPN3和pET-28a DNA3.2 仪器准备水浴锅、移液器、电泳槽、电泳仪、振荡器、制冰机、蓝盾可见光透射仪、凝胶成像仪3.3 试剂BamH I(10U/L) (TaKaRa公司); Not I(10U/L) (TaKaRa公司),T4 ligase4. 操作步骤4.1 酶切按如下双酶切体系（30L）混合 ：反应物（L）pEGFP-N3 pET-28a 质粒 1818 BamH I 2 2 Not I 2 2 10buffer K 3 3 0.1%BSA缓冲液 3 3 1. 离心10s，混匀。2. 37水浴酶切3-4h。3. 配制1.0%（M/V）普通琼脂糖凝胶30ml。4. 适当放置冷却，45左右倒于电泳胶板上，插好梳子。5. 待凝胶凝固好以后，拨下梳子。6. 酶切样品中加入5l溴酚蓝-GeneFinder混合液混匀，上样。7. 1TBE Buffer，80V(3-4V/cm)下电泳30min。8. 荧光激发器观察质粒DNA条带的酶切情况，并照像。4.2 回收酶切产物（采用天为时代DNA回收试剂盒进行回收） 1) 配30mL 1进口琼脂糖凝胶，尽量长一些（用粗梳子），对酶切产物进行电泳分离； 2) 将酶切产物全部加入加样孔中 3) 跑胶，观察结果，并且拍照。 4) 用干净的刀片将需要的DNA条带从凝胶上切下来，称取重量。 5) 以0.1g凝胶对应300L的体积加入PN。 6) 50水浴放置10min，期间不断温和上下翻动离心管至胶完全融解。 7) 将上一步得到的溶液加入到一个吸附柱中，吸附柱再放入收集管，13000rpm离心60s，弃掉废液。8) 加入800L漂洗液PW，13000rpm离心60s，弃掉废液。9) 加入500L漂洗液PW，13000rpm离心60s，弃掉废液。 10) 将离心吸附柱放回收集管，13000rpm离心2min。 11) 取出吸附柱，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间位置加入适量洗脱缓冲液EB 30L，洗脱缓冲液先在65水浴预热，室温放置2min，13000rpm离心1min，然后将离心的溶液重新加回离心吸附柱中，13000rpm离心1min。 12) 置于20保存。 4.3 连接按照连接体系进行，16连接过夜。反应物 体积/L 回收纯化的pET-28a质粒 5gfp基因片段 12 T4连接酶 1 缓冲液（10） 2 实验五 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化一、实验目的了解和掌握大肠杆菌感受态细胞的制备方法的原理和操作要点，以及质粒DNA转化大肠杆菌细胞的原理和方法。二、基本原理外源DNA只有转化到大肠杆菌细胞内才能得到扩增。感受态指细菌细胞具有的能够接受外源DNA的一种特殊生理状态。大肠杆菌的感受态可用CaCl2处理而诱导产生：将正在生长的大肠杆菌细胞在0下加入到低渗的CaCl2溶液中，便会使细胞膜的透性发生改变，此时的细胞即呈现为感受态。这一方法可以用于批量制备感受态细胞，其转化效率可达到5106-2107个转化克隆子/g超螺旋质粒DNA。制备好的大肠杆菌感受态细胞可在-70冻存。在0下外源DNA可吸附到感受态细胞表面，短时间的热刺激（42，90s）诱导细胞吸收DNA。 转化了质粒DNA的大肠杆菌随后在培养基中37培养1hr，可使质粒DNA中编码抗生素抗性的基因得以表达，因此，转化了质粒DNA的大肠杆菌细胞可在含有相应抗生素的培养基上生长，而没有转化的细胞则无法生长。三. 实验材料、仪器1. 实验材料DH5，BL21，pET-28a重组质粒DNA2. 使用仪器水浴锅，高压灭菌锅、移液器、超净工作台、离心机、振荡培养箱，制冰机四、操作步骤1. LB（Luria-Bertain）液体和固体培养基的配制（参考附录）氨苄青霉素和卡那霉素等抗生素不抗热，如果培养基温度过高，容易导致抗生素失效，应使培养基降温至60左右后，再加入抗生素。但也不应使培养基的温度过低，否则容易出现气泡。75mm直径的培养皿约需15ml培养基。2感受态细胞的制备 (CaCl2法) （1） 挑一大肠杆菌单菌落放入3ml LB液体培养基（含Kan+），37培养过夜。（2） 活化大肠杆菌：取3ml新鲜的LB液体培养基加入50-150l的过夜菌，培养2-3个小时。（3） 将昨夜摇出来的DH5或BL21培养液转入离心管中,冰上放置10min,然后于4下4000rpm离心5min。 （4） 弃去上清,用预冷的0.1mol/L 的CaCl2溶液600L轻轻悬浮细胞,冰上放置20min, 4下4000rpm离心5min。 （5） 弃去上清,加入300L预冷的0.1mol/L的CaCl2 溶液,轻轻悬浮细胞,冰上放置5min,即成感受态细胞悬液，可-80长期保存。3. 转化涂板 （1）取2个无菌离心管，分别加入100L DH5感受态细胞悬液，第1管加5l无菌水，第2管加入质粒DNA溶液5l,轻轻摇匀,冰上放置30min。（2）42水浴中热激90s,热激后迅速置于冰上冷却5min。 （3）分别向管中加入100L LB液体培养基,混匀后在37振荡培养30min。 （4）从管1中取50L涂布于含抗生素和不含抗生素的平板上,从管2中取50L和100L涂布于含抗生素的平板上。正面向上放置约10分钟,待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿,37培养20小时。Kan-Kan+Kan+Kan+管1 管1 管2 管250L 50L 50L 100L实验六 重组质粒DNA的鉴定（双酶切法和菌落PCR法）一、实验目的掌握双酶切法鉴定重组质粒DNA的基本原理和操作步骤，以及菌落PCR法鉴定重组质粒DNA的基本原理。了解菌落PCR法鉴定菌落及保存的操作方法。二、基本原理重组质粒DNA是利用限制性内切酶（如BamH I和Not I）分别酶切基因片段和质粒后，利用基因片段和质粒DNA一端带有相同的粘性末端连接起来的重组质粒，如果再利用相同的限制性内切酶识别重组基因片段两侧的酶切位点，通过酶切下的重组片段的大小与连接的基因片段大小是否相同判断质粒DNA是否为重组质粒。单菌落或提取的质粒DNA也可以通过PCR方法鉴定正确克隆。聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，简称PCR）是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法。典型的PCR由高温变性、低温退火和适温延伸等三步反应组成一个循环周期，通过多次循环反应，使目的DNA得以迅速扩增。其主要步骤是：将待扩增的DNA置于高温下使之解链，人工合成的两个寡核苷酸引物在低温下分别在目的片段两侧与DNA两条链互补结合；DNA聚合酶在72将单核苷酸从引物的3端开始掺入，沿模板从53方向延伸，合成DNA的新互补链。具体地说，PCR反应系统有寡核苷酸引物，反应缓冲液，热稳定DNA聚合酶（Taq酶），脱氧核苷三磷酸底物和靶序列（即模板）等五部分组成，缺一不可。PCR技术能在试管中建立反应，经数小时之后，就能将极微量的某一特定的目的DNA片段扩增106倍以上，而无需经过烦琐的基因克隆程序便可获得足够数量的精确的DNA拷贝。它操作简单，易于掌握，结果也较为可靠，为基因的分析和研究提供了一种强有力的手段，对整个生命科学的研究与发展都有深远的影响。因此，PCR技术产生的时间虽不长，却以惊人的速度广泛地应用于分子生物学的各个领域。它可用于基因的分离、克隆和核苷酸序列分析、突变体和重组体的构建、基因表达调控的研究、基因多态性的分析、遗传病和传染病的诊断、肿瘤机制的探索及法医鉴定等诸多方面。三、实验材料、仪器及试剂1. 实验材料pET-28a重组质粒DNA或菌落2. 使用仪器PCR仪，掌中宝离心机，冰箱，小型混合器，电泳槽和电泳仪，1.5ml离心管，移液器及吸头，蓝盾可见光透射仪，恒温培养箱3. 试剂BamH I(10U/L) (TaKaRa公司); Not I(10U/L) (TaKaRa公司)四、实验步骤1. 双酶切法（1） 随机挑取2个单菌落，接种，37振荡培养过夜。（2） 质粒DNA的提取（碱裂解法）。（3） 双酶切鉴定体系(10l)。反应物(l) 管1 管2 质粒DNA 22 BamH I 0.5 0.5 Xho I 0.5 0.5 10buffer K 1 1 ddH2O/l 6 6 （4） 室温酶切2.5-3h。（5） 配制1.0%（M/V）普通琼脂糖凝胶20ml。（6） 酶切样品中加入5l溴酚蓝-GeneFinder混合液混匀，上样。（7） 1TBE Buffer，80V(3-4V/cm)下电泳30min。（8） 荧光激发器观察质粒DNA条带的酶切情况，并照像。并确定最终的阳性克隆2. 菌落PCR法（1） 挑取菌落随机挑取5个菌落。首先使用无菌枪头挑取菌落，在已准备好的含有卡那抗菌素，分好区的固体培养基中轻划一下（为保菌种），然后将余下菌置于eppendorf管中（作为PCR反应模板）。（2） PCR反应体系（20l）反应物 体积/ dNTP（10mM）2 左引物0.5 右引物0.5 Taq酶（5U/L）0.5 MgCl2(25mM)1.210Buffer 2 ddH2O13.3 （3） PCR循环： 95 5min予变性（95 60s；58 60s；72 90s）30cycles 72 10min延伸（4） PCR产物的检测PCR产物加入5l溴酚蓝-GeneFinder混合液，分别按编号加入DNA琼脂糖凝胶电泳的加样孔，使用1%琼脂糖电泳分离。（5） 用荧光激发器看结果，确定阳性克隆的位置。五、实验结果实验七 GFP蛋白的诱导表达一、实验目的掌握用IPTG诱导GFP基因表达的基本原理及基本操作步骤。二、实验原理IPTG（异丙基硫代-L半乳糖苷）是一种常见的诱导基因表达的诱导剂，结构类似乳糖。GFP基因连接到pET-28a的多克隆位点（MCS），GFP基因的表达受其上游T7启动子和操纵基因O位点以及结合到这些顺式作用元件的蛋白因子的控制。LacI基因编码调节蛋白，可以四聚体的形式结合到操纵基因O位点上，关闭GFP基因的表达。IPTG可与四聚体调节蛋白结合，从而改变调节蛋白的构象，使调节蛋白不再与O位点结合。接着BL21编码的T7 RNA聚合酶结合到T7启动子位点，从而启动GFP基因的表达。三、实验材料和仪器1.实验材料BL21，pET-28a重组质粒DNA2.使用仪器离心机，冰箱，小型混合器，移液器，恒温培养箱，手持式紫外灯，超净工作台。四、实验步骤1. 取阳性克隆质粒DNA转化BL21；2. 在含有Kan的固体培养基上，37培养20h；3. 挑取单菌落，37振荡培养过夜；4. 取4支无菌带盖试管，加入新鲜LB液体培养基（含有Kan）5ml，按1：20稀释比例加入过夜菌，37培养至生长期,约2-3小时。5. 加入IPTG（1：1000）至终浓度1mmol/L，分别诱导0h，1h，2h，4h。 6. 分别取1.5ml，10000rpm离心5min，去除上清，收集沉淀，再重复一次收集沉淀。7. 分别取IPTG诱导培养液20l涂布在含Kan的固体培养基上，37培养20小时。8. 观察蛋白表达用紫外线照射菌体沉淀及培养平板，可以看到绿色荧光。分别对均匀涂布的平板以及表达蛋白的样品管照相，保存照片。实验八 兔肝RNA的制备及测定1. 实验目的（1） 学习从兔肝中提取RNA的原理和方法。（2） 通过紫外吸收法测定RNA的含量。（3） 利用琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。2. 实验原理细胞内大部份RNA均与蛋白质结合在一起，并且多以核蛋白的形式存在。因此，分离制备RNA时，首先遇到的是必须使RNA与蛋白解离，并除去蛋白质。一般1克动物组织约含有1毫克RNA，植物材料含量低些。其中大部分为rRNA（绝大部分约18S和28S），15% tRNA，只有1-5%左右为mRNA。动物组织中以肝脏器官RNA含量较为丰富。经组织匀浆用苯酚处理并离心后RNA溶于上层被酚饱和的水相中，DNA和蛋白质则留在酚层中，向水层中加入乙醇或异丙醇后，RNA即以白色絮状沉淀析出。此法能较好的除去DNA和蛋白质，且提取的的RNA具有生物活性。本实验就是将兔肝组织，在酚与十二烷基肌酸钠的存在下，RNA与蛋白质分离使蛋白质变性凝固。RNA溶解在水相中，用乙醇或异丙醇使RNA从水相中沉淀，达到分离。RNA分子是不稳定的，极易被降解破坏。主要原因在于：一是由于RNA 2-OH的存在，RNA分子可自发水解，特别在强碱性条件下很容易通过2-OH形成2，3磷酸二酯，而后进一步水解成2-核苷酸和3-核苷酸。二是源于核酸酶的广泛存在与高稳定性。RNA酶为极小的单肽链蛋白（约120aa），具有4个二硫键。100处理20分钟不能灭活RNA酶，高压灭菌的条件也不会使之变性。自然界中存在着大量污染的RNA酶，且细胞在破碎时细胞内的核酸酶也会同时将细胞中放出的RNA破坏。由于RNase具有极强的稳定性，所以在提取时尽量创造一个无RNA酶污染的环境。在有关RNA操作的实验中需要注意以下问题：一、必须采取强烈的处理条件如强变性剂、有机溶剂或180高温来抑制外源RNA酶的活性。这些强变性剂和有机溶剂包括DEPC（焦碳酸二乙酯）、氯仿均可以使RNA酶失活。0.1%DEPC 37浸泡12小时能强烈地抑制RNA酶的活性，DEPC在高温时分解为二氧化碳和乙醇，所以可以通过高压灭菌将DEPC去除。玻璃器皿使用前必须于180烘烤8小时以上。塑料制品可用氯仿冲洗。二是对于内源RNA酶的灭活可以通过向提取液中加入盐酸胍、异硫氰酸胍或有机溶剂苯酚/氯仿等来解决。异硫氰酸根和胍离子都是很强的蛋白质变性剂，使得RNase分子肽键伸展，失去有序的高级结构，而失去活性。三、由于RNA极不稳定性，通常需要在低温下快速操作，尽量减少RNA的降解。四、操作时要保持空气清洁，尽量减少空气流动，如条件允许，可在超净工作台上进行。五、实验中RNA酶最主要的污染源是操作人员的手，因此在准备实验材料和溶液及进行其它与RNA实验有关的操作时，都应戴一次性手套，接触不干净的玻璃器皿和物品以后，手套就可能沾染上RNA酶，因此要勤换手套。3. 实验材料、仪器及试剂3.1 实验材料 取新鲜兔肝脏组织0.2g，30min内速冷冻保存于液氮或-70冰箱待用。3.2 仪器准备试剂瓶、组织匀浆器、移液器、离心机、电泳槽、电泳仪、振荡器、制冰机、紫外分光光度计、烘箱、凝胶成像仪3.3 溶液的配制凡是水溶性液体均用1ml/L DEPC水配制。有2mol/L pH4.0乙酸钠, 100g/LSLS(十二烷基肌氨酸钠)，1mol/L Sodium Citrate(柠檬酸钠)，CSB液( 42mmol/ L Sodium Citrate pH4.0 ,10g/L SLS ,0.2mmol/L-巯基乙醇)，变性液D(取CSB33ml,加25g 异硫氰酸胍充分溶解，4保存)，700ml/L 乙醇(用DEPC处理的水配制)，酸性饱和酚：250ml饱和重蒸酚68溶解，加入8-羟基喹啉至终浓度为1g/L 溶解混匀，此时溶液呈黄色，加入等体积50mmol/L pH4.0的乙酸钠抽提，重复数次,直至上层水相pH大于3.8)。4. 操作步骤4.1 操作程序 取0.2g 组织，置入预冷的组织匀浆器中，在冰浴中匀浆，充分研碎组织。 加入变性液D 0.4ml，冰上匀浆至液体粘稠，无小组织块。 加入40l 2M NaAc pH4.0，混匀。 加入酸性饱和酚0.4ml，80l氯仿:异戊醇，涡旋20sec，呈现均匀的浑浊态，冰上放置15min。 将组织匀浆倒入处理过的1.5ml 的Ep管中，4离心，12000/rpm，5min。 取上层水相，加入等体积酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）抽提1次。 再取上层水相，加入等体积氯仿、异戊醇（24：1）抽提1次。 4离心，取上层水相，加等体积预冷异丙醇，-20放置20min30min。 4离心，收集沉淀，70%乙醇洗涤3次，室温干澡20min。 用20l DEPC处理过的水溶解沉淀，取少量鉴定。4.2 RNA质量的鉴定RNA产率和纯度的鉴定：用紫外分光光度计分别测波长230nm、260nm、280nm的OD值，按RNA 的浓度(g/L) = OD260核酸稀释倍数40/1000，并计算OD260/OD230、OD260/OD280的比值以估测RNA的纯度。4.3 RNA完整性的鉴定 1) 配制1.5%（M/V）普通琼脂糖凝胶。2) 适当放置冷却，45左右倒于电泳胶板上，插好梳子。3) 待凝胶凝固好以后，拨下梳子。4) 取10l RNA样品，3l的genefinder染色，混匀，上样。5) 1TBE Buffer，60V(3-4V/cm)下电泳30min。6) 紫外灯下观察RNA条带的分离情况，并照像。5. 使用注意1) 避免RNA酶的污染，提取RNA所有的试剂和用具物品必须是专用的。最好贴好“RNA专用”的标签,存放在指定地点，作为RNA实验专用。2) 实验操作时应带手套，实验的仪器及溶液应经DEPC处理。操作不严谨会造成RNA降解，导致RNA条带不清晰或不完整。DEPC可能致癌，操作时需要小心。附录：1. LB培养基的配制：组成液体固体蛋白胨（Trypton）10g10g酵母提取物（Yeast Extract）5g5gNaCl10g10g琼脂（Agar）15g蒸馏水定容至1000ml定容至1000ml2. 溶液： 50mM 葡萄糖 25mM Tris-HCl（pH8.0） 10mM EDTA3. 溶液（现用现配）：0.2N NaOH 1% SDS （先加水，再加NaOH和SDS）4. 溶液（100ml）：5M KAc 60ml 冰醋酸 11.5ml5. DNase-free RNase A：溶解RNase A于TE缓冲液中，浓度为10mg/ml，煮沸10-30min，除去DNase活性，-20贮存。6.TE缓冲液（pH8.0）10mM Tris-HCl；1mM EDTA的配制：药品名称1M Tris-HCl（pH8.0）10ml1ml0.5M EDTA2ml0.2mlddH2O定容至1000ml定容至100ml7. 20TBE：216g Tris碱，110g硼酸，80ml 0.5M EDTA（pH8.0），定容至1000ml。8. GeneFinder-溴酚蓝上样缓冲液6loading buffer：0.25%溴酚兰，0.25%二甲苯青FF，40%（w/v）蔗糖水溶液。配制好后可以按50：1的比例稀释GeneFinder。9PEGFP-N3质粒全图谱实验使用的EGFP蛋白取自原核-真核穿梭质粒pEGFP-NB3B的蛋白质编码序列。此质粒原本被设计于在原核系统中进行扩增，并可在真核哺乳动物细胞中进行表达。本质粒主要包括位于PCMV真核启动子与SV40 真核多聚腺苷酸尾部之间的EGFP编码序列与位于EGFP上游的多克隆位点；一个由SV40 早期启动子启动的卡那霉素/新霉素抗性基因，以及上游的细菌启动子可启动在原核系统中的复制与卡那抗性。在EGFP编码序列上下游，存在特异的BamH I及Not I限制性内切酶位点，可切下整段EGFP编码序列。10pET-28a质粒全图谱表达EGFP 蛋白使用的pET-28 原核载体包含有在多克隆位点两侧的His-tag polyHis 编码序列；用于表达蛋白的T7 启动子，T7 转录起始物以及T7 终止子；选择性筛选使用的lacI 编码序列及卡那霉素抗性序列，pBR322 启动子，以及为产生单链DNA 产物的f1 启动子。21 / 21