喀斯特洞穴沉积物中可培养固碳和固氮细菌多样性分析.pdf

喀斯特洞穴沉积物中可培养固碳和固氮细菌多样性分析冉光娟1，吴庆珊1，方正1，安妮1，陈秀1，李诗霞1，任篓1，翁庆北1,2*(1.贵州师范大学生命科学学院，贵州贵阳550001；2.黔南民族师范学院生物科学与农学院，贵州都匀558000)摘要：微生物固碳和固氮作用在生物地球化学循环和能量流动中具有重要作用.洞穴黑暗和寡营养极端环境中蕴藏丰富独特的微生物资源.为了解喀斯特洞穴固碳细菌和固氮细菌群落结构组成和多样性，利用 9种分离培养基，分离筛选喀斯特洞穴沉积物固碳细菌和固氮细菌，并基于 16SrDNA 序列测定，分析分离菌株的系统发育和多样性.共分离获得 230 株固碳细菌，隶属于 3 门、16 属和 64 种，优势属为假单胞菌属（Pseudomonas）和不动杆菌属（Acinetobacter）.固碳细菌 Shannon-Wiener 多样性指数为 3.65，Margalef 丰富度指数为 11.58，Pielou 均匀度指数为 0.88.共分离获得 425 株固氮细菌，分别属于 3 门、14 属和 68 种，优势属为假单胞菌属、不动杆菌属和贪铜菌属（Cupriavidus）.固氮细菌 Shannon-Wiener 多样性指数为 3.43，Margalef 丰富度指数为 11.07，Pielou 均匀度指数为 0.81.此外，无碳培养基 CFMD 和无氮培养基 NFb 分离获得的菌株多样性最高.以上结果表明，荔波喀斯特洞穴沉积物中存在丰富的固碳和固氮细菌类群，这些结果为进一步研究固碳和固氮微生物在喀斯特洞穴生态系统中的功能以及农业应用提供了菌种资源.关键词：喀斯特洞穴；可培养；固碳细菌；固氮细菌；多样性中图分类号：Q939.1文献标志码：A文章编号：02587971(2024)02037913碳循环和氮循环是生态系统中最重要的物质循环之一.固碳和固氮微生物一直以来是农业菌种资源利用关注的重点，作为主要的初级生产者，对不同生态系统的碳和氮支配起着积极而重要的作用1.碳循环包括碳固定、甲烷代谢和碳降解等多个重要代谢过程2.固碳微生物通过吸收 CO2并将其转化成细胞自身物质或者有机物，不仅为异养生物提供了完成碳循环所需的有机碳，也为实现“碳中和”提供了一条有前景的新途径3-4.氮循环包括固氮、氨化、硝化、反硝化等主要过程5-6.固氮微生物通过固氮酶将大气中的气态氮转化为生物可利用氨，在不同的环境中调节固氮或其它多种促生功能7.喀斯特洞穴是指可溶性岩石经喀斯特作用所形成的地下空间，是石灰岩地区地下水长期溶蚀的结果8，被认为是一种陆地寡营养极端地下生态系统9.洞穴内总有机碳质量浓度通常不超过 2mg/L，氮源也较匮乏.尽管如此，喀斯特洞穴作为一个天然的微生物群体库，蕴含丰富的微生物资源，是研究微生物多样性的天然实验室.据报道每克洞穴沉积物平均含 106个微生物10.洞穴微生物通过促进碳酸盐矿物的生物风化或加速碳酸钙沉淀促进洞穴形成，并在洞穴元素循环中起着重要作用11.由于黑暗和贫营养，洞穴微生物通过固碳和固氮等代谢途径来获取营养和能量.随着宏基因组学测序的快速发展，使用免培养技术研究洞穴环境中微生物的组成及其代谢功能，结果表明洞穴中含有固碳固氮微生物类群10.有研究表明，湖北省长阳县和尚洞固碳细菌类群包含变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）和浮霉菌门（Planctomycetes）收稿日期：2023-08-28；接受日期：2023-12-05；网络出版日期：2024-02-02基金项目：国家自然科学基金委贵州省喀斯特科学研究中心联合基金（U1812401）；贵州省科技创新人才团队 黔科合平台人才（2019）5617 号；贵州省优秀青年科技人才 黔科合平台人才（2019）5655 号.作者简介：冉光娟（1995），女，贵州人，硕士生，主要研究微生物资源开发利用.E-mail：.*通信作者：翁庆北（1975），女，贵州人，博士，教授，主要研究环境资源微生物.E-mail：.云南大学学报（自然科学版），2024,46（2）:379391JournalofYunnanUniversity:NaturalSciencesEditionDOI:10.7540/j.ynu.20230328等12.对葡萄牙亚述尔群岛 Terceira 熔岩洞穴分析揭示了弗兰克氏菌属（Frankia）、伯克霍尔德菌属（Burkholderia）、克雷伯氏菌属（Klebsiella）和芽孢杆菌属（Bacillus）以及其它未培养细菌等包含固氮基因 nifH，推测这些微生物对洞穴氮固定起着一定的作用13.洞穴中细菌通过特殊的碳代谢和氮代谢途径以适应洞穴环境，并对洞穴的碳氮循环起着重要的作用.Zhu10从贵州遵义的洞穴岩石、水体和沉积物样品中共分离3562 株细菌，包括102 属329 种（含 14 个新描述种），其中 KEGG 通路预测含有一氧化碳氧化基因，通过碳代谢为洞穴提供碳源.同时，也检测到大量的氮代谢相关基因，显示出微生物具有固氮的潜力，超过 50%的分离菌株具有硝酸盐还原的潜力，并获得了一株新的可培养固氮细菌 Azospirillum cavernae.Wischer 等14从 Movile洞穴中分离获得了能够使用一碳化合物的细菌，这种细菌被认为是该群落的主要初级生产者之一.研究洞穴固碳固氮细菌资源，对研究洞穴生态系统的碳和氮循环具有重要意义.但尽管如此，迄今对喀斯特洞穴生态系统的认识以及洞穴微生物的发掘应用仍较有限15.由于海洋、湖泊、土壤、河流等自然环境中营养物质远远低于实验室细菌的培养条件，在寡营养条件下筛选获得功能性微生物正逐步成为生物治理领域的研究热点16.本研究以中国西南地区贵州省荔波县的喀斯特洞穴沉积物为研究对象，通过无碳无氮筛选培养基分离固碳细菌和固氮细菌，阐明寡营养喀斯特洞穴生境中固碳细菌和固氮细菌的多样性和群落结构组成，并为洞穴细菌资源的开发和利用提供菌种资源.1材料与方法1.1样品采集洞穴石笋沉积物样品于 2020 年 8月采集于贵州省黔南布依族苗族自治州荔波县的6 个喀斯特洞穴，采集信息见表 1.洞穴海拔用 GPS定位仪（eTrexVenture）测定；温、湿度用温湿度计（JWSA2-2 型，北京亚光仪器有限责任公司）测定.按照洞穴深度，每个洞穴在无光区每间隔 310m采集 58 份样品，混合后作为各洞穴试验样品.样品用无菌牛皮纸袋收集后低温带回实验室 4 保藏备用.1.2分离培养基参照文献，利用 5 种无碳无机培养基（carbonfreemedium，CFM）CFMA17、CFMB17、CFMC18、CFMD19和 CFME20分离固碳细菌.利用4 种无氮培养基包括LGI 培养基（LGImedium）21、无氮苹果酸钠培养基（nitrogen-freemalatemedium，Nfb）22、阿须贝氏培养基（Ashbymedium，Ashby）23和改良无氮培养基（modifiednitrogen-freemedium，MNF）24分离固氮细菌.1.3样品处理及固碳固氮菌株的分离称取 30g研磨后的样品置盛有 270mL 无菌水的锥形瓶中，180r/min 震荡 20min，悬浮液以 10 倍梯度稀释 3次后，涂布分离培养基，25 恒温培养.挑取不同菌落形态单菌落，纯化后，置斜面 4 低温保藏或加入 20%甘油80 冷冻保存.1.4菌株鉴定1.4.1 菌株基因组 DNA 提取挑取单菌落置相应的 5mL 液体培养基中，25180r/min 震荡培养过夜，12000r/min 离心 2min.菌体沉淀参照细菌基因组 DNA 提取试剂盒（宝生物工程（大连）有限公司）说明书提取菌株基因组 DNA.利用 1%琼脂糖凝胶电泳检测.1.4.2 菌株16SrRNA 基因的扩增、测序和分析以菌株 DNA 为模板，PCR 扩增 16SrDNA.PCR 反应条件为95 预变性 4min；95 变性 45s，56退火 30s，72 延伸 90s，30 个循环；72 再延伸7min.通用引物序列为 27F（5-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3）和 1492R（5-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3）.PCR 扩增产物 1%琼脂糖凝胶电泳检测后，送生工生物工程（上海）股份有限公司测表1样品采集信息Tab.1Samplecollectioninformation洞穴温度/相对湿度/%地理坐标海拔/mJH洞（JH）16.591252626N,1074718E850WM洞（WM）19.07925316N,107400E850SC洞（SC）20.078252610N,1074722E840A洞（A）19.075252456N,1075232E844B洞（B）18.580253217N,107387E839C洞（C）17.07125326N,1074015E933380云南大学学报（自然科学版）http:/第46卷序.获得序列上传到 NCBI（https:/www.ncbi.nlm.nih.gov/）和 Ezbiocloud（https:/ 98.65%的为潜在新种25.利用 MEGA7.0 软件通过邻接法构建系统发育树.1.5多样性分析使用 Shannon-Wiener 多样性指数、Margalef 丰富度指数和 Pielou 均匀度指数对细菌群落多样性进行分析26，利用 SPSS20.0 软件单因素方差进行统计分析.2结果与分析2.1喀斯特洞穴可培养固碳细菌群落结构及多样性分析2.1.1 喀斯特洞穴可培养固碳细菌群落结构分析分离共获得 230 株固碳细菌（表 2）.16SrDNA序列相似性比对分析表明，分离菌株隶属 3 门、5 纲、10 目、11 科、16 属、64 种.在门水平上，变形菌门（Proteobacteria）为优势菌门，占比 76.09%（175/230），其次为拟杆菌门（Bacteroidetes，15.65%）、放线菌门（Actinobacteria，8.26%）.在属水平上，假单胞菌属（Pseudomonas）为优势属，占比 47.39%，其次为不动杆菌属（Acinetobacter，20.00%）和黄杆菌属（Flavobacterium，15.65%）.固碳细菌分离种类及菌株数量如表 3 所示.基于 16SrDNA 序列构建的各代表菌株系统发育树见图 1.变形菌门获得菌株包括 3 纲、7 目、8 科、11 属、51 种.在纲水平上，优势类群为-变形菌纲（Gammaproteobacteria，94.29%）.在属水平上，优势属为假单胞菌属（62.29%）.在种水平上，优势种为 Acinetobacter bohemicus（14.86%）、Pseudomonasneuropathica（9.14%）、Pseudomonas brassicae（8.00%）和 Acinetobacter oryzae（6.29%）.拟杆菌门获得菌株 36 株，均为黄杆菌纲（Flavobacteria）、黄杆菌属（Flavobacterium）.优势种为 Flavobacterium chungangensis（41.67%），其次是 Flavobacterium fluviale（16.67%）、Flavobacteriumginsengisoli（16.67%）.放线菌门获得细菌 19 株，隶属 1 纲、2 目、2 科、4 属、6 种.包括节杆菌属（Arthrobacter，52.63%）、红球菌属（Rhodococcus，26.32%）、假节杆菌属（Pseu-darthrobacter，15.79%）和拟杆菌属（Paenarthrobac-ter，5.26%）.优势种为 Arthrobacter methylotrophus（42.11%）、Arthrobacter gyeryongensis（10.53%）、Paenarthrobacter nitroguajacolicus（5.26%）、Rhodo-coccus erythropolis（21.05%）、Rhodococcus baikonur-ensis（5.26%）和 Pseudarthrobacter psychrotolerans（15.79%）.多样性指数分析表明，洞穴沉积物固碳细菌Shannon-Wiener 多样性指数为 3.65，Margalef 丰富度指数为 11.58，Pielou 均匀度指数 0.88.表2基于 16SrDNA 序列的喀斯特洞穴固碳细菌代表菌株的近缘菌株Tab.2Closelyrelatedstrainsofrepresentativestrainsofcarbon-fixationbacteriainkarstcavesbasedon16SrDNAsequences分类近缘菌株菌株编号分离菌株GenBank登录号种登录号（GenBank）数量/株相似度/%占比/%变形菌门Acinetobacter bohemicusKF679797.1MS332698.9211.30OQ195469.1ProteobacteriaAcinetobacter calcoaceticusNR_119113.1MW9199.400.43OQ195622.1Acinetobacter guillouiaeAPOS01000028.1CJ19398.961.30OQ194045.1Acinetobacter johnsoniiMG594813.1MS7498.871.73OQ195378.1Acinetobacter oryzaeGU954428.1MJ341199.084.78OQ195206.1Acinetobacter portensisKX870877.1CJ37196.650.43OQ194047.1Aeromonas eucrenophilaCDDF01000007.1CS42199.870.43OQ194058.1Aeromonas lusitanaPGCP01000030.1CS7199.000.43OQ194054.1Cronobacter sakazakiiKJ803869.1CW33197.990.43OQ552887.1Ensifer adhaerensMF077128.1MJ3299.370.86OQ195169.1Escherichia coliCP057589.1MJ5399.931.30OQ195170.1Phyllobacterium ifriqiyenseMK240448.1B613198.260.43OQ194032.1Pseudomonas alkylphenolicaMF716701.1CJ11397.411.30OQ194042.1Pseudomonas alvandaeCP077080.1CW4198.100.43OQ194059.1Pseudomonas baeticaMT078669.1MW24199.600.43OQ195624.1Pseudomonas brassicaeLC514379.1MW41499.286.08OQ195568.1Pseudomonas brenneriNR_025103.1C19299.030.86OQ194036.1第46卷冉光娟等：喀斯特洞穴沉积物中可培养固碳和固氮细菌多样性分析381续表2分类近缘菌株菌株编号分离菌株GenBank登录号种登录号（GenBank）数量/株 相似度/%占比/%Pseudomonas canadensisNR_156852.1C7199.930.43OQ194038.1Pseudomonas corrugataNR_037135.1KJ23298.440.86OQ195080.1Pseudomonas cyclaminisLC582666.1KJ41197.920.43OQ195085.1Pseudomonas donghuensisMF170832.1MW1481003.47OQ195623.1Pseudomonas fildesensisNR_170438.1A1199.150.43OQ193163.1Pseudomonas fluorescensMK774791.1KS16399.901.30OQ195093.1Pseudomonas frederiksbergensisMW391603.1MW31699.802.60OQ195760.1Pseudomonas huaxiensisMH428812.1CW25798.293.04OQ194065.1Pseudomonas hunanensisJX545210.1KJ11198.640.43OQ195077.1Pseudomonas kairouanensisLR031357.1A44299.500.86OQ194021.1Pseudomonas kilonensisMN826556.1KW19199.600.43OQ195096.1Pseudomonas kitaguniensisLC500862.1A3199.430.43OQ193166.1Pseudomonas koreensisMW048888.1CW21397.981.30OQ194063.1Pseudomonas laurentianaMG719526.1CW13596.952.17OQ253476.1Pseudomonas mooreiNR_042542.1KW28199.120.43OQ195097.1Pseudomonas migulaeLK391510.1CS21299.730.86OQ194057.1Pseudomonas mucoidesLR797589.1B19198.540.43OQ194028.1Pseudomonas neuropathicaLR797591.1MW21699.566.95OQ195491.1Pseudomonas paracarnisKX186983.1C1199.090.43OQ194034.1Pseudomonas pisciumLR797558.1KW2499.001.73OQ195094.1Pseudomonas plecoglossicidaMF716680.1KJ39198.000.43OQ195084.1Pseudomonas protegensLT906567.1B1198.890.43OQ194026.1Pseudomonas putidaLC507959.1CS20298.020.86OQ194055.1Pseudomonas reinekeiLT629709.1CW19198.190.43OQ194061.1Pseudomonas tructaeCP035952.1KJ24199.560.43OQ195083.1Pseudomonas umsongensisAY972402.1CJ12298.370.86OQ194044.1Pseudomonas vancouverensisLT629803.1MW33999.303.91OQ195772.1Pseudomonas veroniiOK136201.1A33199.800.43OQ193171.1Pseudomonas wadenswilerensisNR_157778.1KJ16298.890.86OQ195078.1Pseudomonas salomoniiJX134631.1C29198.530.43OQ194037.1Pseudoxanthomonas mexicanaMF170831.1KJ192198.200.43OQ267776Shigella flexneriMT604864.1KJ20497.081.73OQ195079.1Stenotrophomonas maltophiliaKF818622.1C4199.080.43OQ194035.1Variovorax boronicumulansNR_041588.1KJ37599.062.17OQ195082.1放线菌门Arthrobacter gyeryongensisNR_133699.1CJ23298.200.86OP210298.1Actinobacteria Arthrobacter methylotrophusMG322224.1MJ16898.983.47OQ195202.1Rhodococcus baikonurensisNR_024784.1C59199.030.43OQ194039.1Rhodococcus erythropolisMW927175.1B29499.231.73OQ194029.1Paenarthrobacter nitroguajacolicusMW578413.1CA66199.170.43OQ194041.1Pseudarthrobacter psychrotoleransNR_174315.1A29399.331.30OQ193168.1拟杆菌门Flavobacterium chungangensisNR_165772.1MS51599.056.52OQ195289.1Bacteroidetes Flavobacterium fluvialeMF991893.2MJ4697.702.60OQ195168.1Flavobacterium ginsenosidimutansNR_108688.1MS40497.531.73OQ195490.1Flavobacterium ginsengisoliNR_109024.1MS13697.092.60OQ195425.1Flavobacterium johnsoniaeDQ530073.1KS3299.190.86OQ195091.1Flavobacterium psychroterraeMH100901.1MJ28298.090.86OQ195204.1Flavobacterium panacisoliNR_169438.1MW40198.160.43OQ195777.1382云南大学学报（自然科学版）http:/第46卷表3喀斯特洞穴可培养固碳细菌种类及菌株数Tab.3Typesandstrainsofculturablecarbon-fixationbacteriainkarstcaves属种种类数占比/%菌株/株菌株数占比/%黄杆菌属（Flavobacterium）710.933615.65不动杆菌属（Acinetobacter）69.374620.00假单胞菌属（Pseudomonas）3554.6810947.39气单胞菌属（Aeromonas）23.1220.86节杆菌属（Arthrobacter）23.12104.34克罗诺杆菌属（Cronobacter）11.5610.43剑菌属（Ensifer）11.5620.86埃希氏杆菌属（Escherichia）11.5631.30拟杆菌属（Paenarthrobacter）11.5610.43叶杆菌属（Phyllobacterium）11.5610.43假节杆菌属（Pseudarthrobacter）11.5631.30假黄色单胞菌属（Pseudoxanthomonas）11.5610.43红球菌属（Rhodococcus）23.1252.17志贺氏菌属（Shigella）11.5641.73寡养单胞菌属（Stenotrophomonas）11.5610.43贪噬菌属（Variovorax）11.5652.17分支上的数值为 1000 次重复抽样检测的自展支持率，大写字母和数字组合为各代表菌株的编号.图1基于 16SrDNA 序列构建的固碳细菌代表菌株系统发育树Fig.1Phylogenetictreeofrepresentativsstrainsofcarbon-fixingbacteriaconstructedbasedon16SrDNAsequences第46卷冉光娟等：喀斯特洞穴沉积物中可培养固碳和固氮细菌多样性分析3832.1.2 不同培养基分离洞穴固碳细菌比较（表4）分离固碳细菌 Shannon-Wiener 多样性为 1.983.05，分离菌株优势属均为假单胞菌属、不动杆菌属和黄杆菌属.利用 CFMD 和 CFME 培养基分离固碳细菌菌株数最多，分别为 66 株（28.70%）和 65 株（28.26%），且分离菌株种数最多，分别为 29 种（45.31%）和 28 种（43.75%）.相比较，CFMB 培养基分 离 菌 株 数 最 少，为 12 株（5.22%），包 含 8 种（12.50%）.多样性指数分析表明，CFMD 培养基分离的固碳细菌 Shannon-Wiener 多样性指数（3.05）和 Margalef丰富度指数（6.68）最高；而 Pielou 均匀度指数最高的是 CFMA 培养基分离的固碳细菌类群，为 0.97.此外，某些属的固碳细菌仅从少数培养基分离获得，如寡养单胞菌属（Stenotrophomonas）和假节杆菌属（Pseudarthrobacter）仅从 CFMA 培养基分离获得，拟杆菌属（Paenarthrobacter）仅从CFMB 培养基分离获得，克罗诺杆菌属（Cronobacter）则仅从 CFMD 培养基分离获得.2.2喀斯特洞穴可培养固氮细菌群落结构及多样性分析2.2.1 喀斯特洞穴可培养固氮细菌群落结构分析分离共获得 425 株固氮细菌（表 5）.经 16SrDNA 序列相似性比对分析，分离固氮菌株分别隶属3 门、5 纲、9 目、13 科、14 属、68 种.在门水平上，变形菌门为优势门类群，为 420 株，占比 98.82%，其次为放线菌门（0.71%）和拟杆菌门（0.47%）.固氮菌株分离结果如表 6 所示.在属水平上，优势属为假单胞菌属（72.70%）、不动杆菌属（15.53%）、贪铜菌属（Cupriavidus，7.53%）.基于 16SrDNA 序列构建的各代表菌株系统发育树见图 2.变形菌门获得菌株 420 株，包括 3 纲、7 目、10 科、10 属、63 种.在纲水平上，优势纲类群为-变形菌纲，为 377 株，占比 89.76%.在属水平上，优势属为假单胞菌属（73.57%）.在种水平上，获得菌表4不同培养基分离喀斯特洞穴固碳细菌菌株的多样性Tab.4Diversityofcarbon-fixationbacteriaisolatedfromkarstcavesbydifferentmedia培养基菌株数占比/%种数占比/%Shannon-Wiener多样性指数Margalef丰富度指数Pielou均匀度指数CFMA2711.742234.382.996.370.97CFMB125.22812.501.982.820.95CFMC6026.092031.252.594.640.86CFMD6628.702945.313.056.680.91CFME6528.262843.753.016.470.90表5基于 16SrDNA 序列喀斯特洞穴固氮细菌代表菌株的近缘菌株Tab.5Relativesstrainsofrepresentativestrainsofnitrogen-fixingbacteriainkarstcavesbasedon16SrDNAsequences分类近缘菌株菌株编号分离菌株GenBank登录号种登录号（GenBank）数量/株相似度/%占比/%变形菌门Acinetobacter bereziniaeAIEI01000248.1GW124399.100.70OQ202076.1ProteobacteriaAcinetobacter bohemicusKF679797.1NJ21599.061.17OQ202110.1Acinetobacter bouvetiiNR_117628.1LS553497.650.94OQ202106.1Acinetobacter calcoaceticusNR_119113.1AW18298.630.47OQ202049.1Acinetobacter guillouiaeMW468435.1GW123099.207.05OQ202072.1Acinetobacter haemolyticusSJOD01000002.1GW33299.090.47OQ202077.1Acinetobacter johnsoniiKP763485.1LS221499.500.94OQ202103.1Acinetobacter kyonggiensisMT323127.1NJ601198.760.23OQ202113.1Acinetobacter oryzaeMW487455.1AW132999.792.11OQ202058.1Acinetobacter portensisKX870877.1NS21297.340.47OQ202119.1Acinetobacter tjernbergiaeKM070562.1LS332499.580.94OQ202102.1Bosea caraganaeMH633716.1GS7197.460.23OQ202067.1Cupriavidus necatorMT845856.1LS93199.517.29OQ202094.1Cupriavidus neocaledonicusMH699182.1LJ66198.450.23OQ202091.1Ensifer adhaerensMW391597.1NJ182198.750.23OQ202111.1Massilia niabensisNR_044571.1AW222196.590.23OQ202059.1Pseudomonas alkylphenolicaMT072104.1AW173999.599.17OQ202050.1384云南大学学报（自然科学版）http:/第46卷续表5分类近缘菌株菌株编号分离菌株GenBank登录号种登录号（GenBank）数量/株 相似度/%占比/%Pseudomonas alloputidaMW198149.1LW2212198.950.23OQ202109.1Pseudomonas aspleniiNR_040802.1LJ8298.740.47OQ202082.1Pseudomonas baeticaMT078669.1NW3699.821.41OQ202123.1Pseudomonas brassicaeLC514379.1AW1036199.3914.35 OQ202054.1Pseudomonas cavernaeCP032419.1LS44198.290.23OP210296.1Pseudomonas chlororaphisNR_164626.1LS99899.571.88OQ202096.1Pseudomonas cichoriiMK302219.1LS1113398.360.70OQ202105.1Pseudomonas daroniaeMK159357.1NS2599.431.17OQ202115.1Pseudomonas donghuensisMF170832.1LS1621299.932.82OQ202099.1Pseudomonas extremaustralisMN826583.1LJ41199.520.23OQ202088.1Pseudomonas fluorescensKU977128.1GC123299.300.47OQ202066.1Pseudomonas frederiksbergensisMT078678.1AW661299.802.82OQ202052.1Pseudomonas fuscovaginaeAB638424.1AW88198.990.23OQ202053.1Pseudomonas huaxiensisMH428812.1GW442899.301.88OQ202079.1Pseudomonas hunanensisJX545210.1GW9399.080.70OQ202073.1Pseudomonas hutmensisNR_165748.1LS118599.891.17OQ202100.1Pseudomonas japonicaMZ571943.1LW313599.351.17OQ202108.1Pseudomonas jesseniiNIWT01000013.1NW2399.270.70OQ202121.1Pseudomonas koreensisMW048888.1AC24297.980.47OQ202048.1Pseudomonas lalkuanensisMF943158.1AW17171198.890.23OQ202061.1Pseudomonas laurentianaMG719526.1LJ1201299.022.82OQ202093.1Pseudomonas migulaeMN704789.1NS102399.600.70OQ202120.1Pseudomonas mooreiNR_042542.1AC14499.110.94OQ202047.1Pseudomonas mucoidesLR797589.1LJ3499.300.94OQ202081.1Pseudomonas neuropathicaLR797591.1AC123299.227.52OQ202045.1Pseudomonas oleovoransMT102301.1GW14599.601.17OQ202074.1Pseudomonas peliMT373673.1NS23198.720.23OQ202118.1Pseudomonas pisciumLR797558.1NW121999.414.47OQ202126.1Pseudomonas plecoglossicidaMH997642.1NW14199.700.23OQ202127.1Pseudomonas pseudoalcaligenesKJ586277.1GW141299.800.47OQ202078.1Pseudomonas putidaAB110608.1AW1711898.814.23OQ202057.1Pseudomonas reinekeiLT629709.1NW1199.890.23OQ202122.1Pseudomonas seleniipraecipitansKT710798.1NS18399.250.70OQ202116.1Pseudomonas soliMN538257.1LS12299.090.47OQ202095.1Pseudomonas stutzeriCP018050.1NW32199.580.23OQ553653.1Pseudomonas umsongensisMK883110.1GC4199.500.23OQ202065.1Pseudomonas vancouverensisLT629803.1LS1821099.722.35OQ202101.1Pseudomonas viridiflavaMZ931317.1NW9199.890.23OQ202124.1Pseudomonas vranovensisHQ202845.1LS513499.550.94OQ202104.1Pseudomonas wadenswilerensisLT009706.2LS77499.790.94OQ202097.1Shigella flexneriMN746200.1AW1616198.680.23OQ202060.1Sphingobium aromaticiconvertensAM181012.1LJ112198.220.23OQ202092.1Stenotrophomonas nitritireducensNZ_CP016756.1LJ5196.510.23OQ2020